专利名称：一种df1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种DFl细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
禽白血病病毒(Avain leukosis virus,以下简称ALV)是以引起禽各种造血细胞肿瘤性增生为特征的一类反转录病毒群，能感染鸡的可分为A、B、C、D、E和J等6个亚型，其中A、B、C、D和J亚型属于外源性ALV，临床上常见A和J亚型，B、C、D亚型相对少见，E亚型属于内源性ALV，本身不具有致病特征。近几年，外源性ALV尤其是ALV-J 已在我国的蛋鸡和地方品种鸡中广泛传播，造成了巨大的经济损失。并且宿主范围的扩大、 ALV本身的变异以及与其他病毒的混合感染等都给禽白血病的防制提出了新的挑战。由于目前没有商业化疫苗可用，只能从源头上阻断病毒的传播，因此，必须加强外源性ALV检测方法的研究，及时检测并淘汰感染或者疑似感染鸡，才能有效控制外源性ALV。我国每年需要对进口的约120万套种鸡中O. 5%-1%个体进行病原学抽样检测，保证进口种鸡的洁净度；并对全国10-15个市场占有量最大的自繁自养种鸡场的核心群开展彻底的净化程序(每个鸡场每年需病原学检测1-1. 5万只鸡，每代鸡2-3次)，至少持续4-5 年；同时，特别需要对农业部国家地方鸡种基因库禽白血病的净化，每个品种核心群至少 500只，该基因库现保存有31个我国重要的纯地方品种鸡，承担国家的保种任务。但目前， 用于批量血液或蛋清样品病毒感染状态的检测方法技术难度大，检测周期长，大多数实验室达不到这一技术要求，通常在培养7天时开始细胞脱落，导致检测结果不稳定。现有的外源性ALV检测的常规方法是必须在将血浆或蛋清样品接种鸡胚成纤维细胞系DFl细胞(以下简称DFl细胞)，持续培养9天后，取细胞上清用ALV p27抗原ELISA检测试剂盒检测。如能既确保ALV-p27抗原检测的灵敏度与稳定性，又能快速检测出p27抗原，即使将常规检测方法所用时间提前1-2天，也将节省大量成本，大幅度提高经济效益，从而有利于将细胞培养法用于种鸡场禽白血病净化所必需的批量样品检测技术的推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供了一种DFl细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，4 -5天即可快速、准确、特异检出鸡抗凝血中外源性ALV。ALV在细胞上的复制过程是鸡抗凝血中ALV首先要吸附细胞，然后通过进入、复制、装配，最终释放子代病毒。本发明是利用ALV首先要感染DFl细胞，然后再释放至细胞上清，同一培养时间的DFl细胞比细胞上清中的ALV含量高这一原理，通过冻融接种鸡抗凝血的DFl细胞，使DFl细胞中的ALV释放，从而缩短检测到ALV的时间，达到快速检测ALV 的目的。一种DFl细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，包括以下步骤
I. DFl细胞的准备DFl细胞传代于24孔细胞培养板，并置于39°C、5%C02培养箱中进行培养，培养至DFl 细胞长成70%-80%单层；培养基为含10%胎牛血清的高糖细胞培养基(DMEM)。2.鸡抗凝血的采集与处理
常规方法无菌采集鸡抗凝血1ml, 1500rpm离心5min取白细胞,接种到步骤I培养至长成70%-80%单层的DFl细胞；再向24孔细胞培养板中每孔加入100 μ I待检样品，置于 39°C、5%C02培养箱中继续培养2 h，然后换成含1%胎牛血清的高糖细胞培养基(DMEM)，再置于39°C、5%C02培养箱中培养。3. DFl细胞的收集
培养4d-5d后倒掉上述细胞培养基，24孔细胞培养板中每孔加入pH 7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO4 2mmol/L) 500 μ 1，-20°C冻存，至少Ih以上。4. DFl细胞中p27抗原的检测
取出上述冻存的DFl细胞，融化后以3000rpm离心5min后取上层液体，吸取100 μ I上层液体加到Ρ27抗原反应板中，按ELISA试剂盒说明书检测DFl细胞中的ρ27抗原，并通过酶标仪读数进行结果判定。当样品与阳性对照比值(S/P值)大于O. 2时，即判定该样品阳性。ALV ρ27抗原检测用ELISA试剂盒由IDEXX公司生产。本发明方法的创新之处
本发明通过检测DFl细胞中ALV ρ27抗原的ELISA检测结果判定，可用于种鸡群的净化。与检测细胞培养上清中ALV ρ27抗原的常规方法比较，本发明方法不仅具有同等稳定性和准确性，而且更快速，操作流程缩短了 4天以上，有利于种鸡场外源性禽白血病净化所必需的批量样品细胞培养检测技术的推广应用。
具体实施例方式实施例I :以山东某鸡场的BR地方品种鸡的24份鸡抗凝血为检测材料，比较该发明能够快速准确地检出外源性ALV阳性样品。随机采集ρ27抗原检测结果为阳性的BR鸡抗凝血22份，阴性鸡的抗凝血2份作为检测材料。该实例验证了本发明与常规检测方法具有同等稳定性、准确性，但更快速，操作流程缩短了 4天以上。I.材料与方法
I.I DFl细胞的准备
DFl细胞采用常规方法传代于9块24孔细胞培养板，DFl细胞用含10%胎牛血清的高糖细胞培养基(DMEM)，并置于39°C、5%C02培养箱中进行培养。鸡抗凝血的采集与处理
将24支2. 5ml 一次性注射器分别吸取少许肝素，使注射器内壁充分润滑，无菌采集24 份鸡抗凝血各1ml，然后1500rpm离心5min，取白细胞加入不含血清的DMEM稀释10倍后， 分别接种于已培养至70%-80%单层的DFl细胞；每个样品设9个重复；置于39°C，5%C02培养箱中培养2 h，然后换入含1%胎牛血清的DMEM细胞维持液，继续培养。细胞上清的收集每天取出一块24孔板，用I. 5ml离心管分别收取每个样品的细胞上清，分别-20°C冻存。收集至第9天。细胞的收集
按照步骤I. 3每天收集完每个样品的细胞上清后，倒掉每个孔剩余的细胞上清，然后每孔加入 pH 7. 2 的磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 137mmol/L,KCl 2. 7mm。I/L，Na2HPO4 IOmmol/ L，KH2PO4 2mmol/L)500y 1，与DFl细胞一起于-20°C冻存。收集至第9天。用于与I. 3中常规方法中收集培养9天的细胞上清进行检测这一方法进行比较。细胞上清中p27抗原的检测
取出上述冻存于_20°C的所有细胞上清，融化后，分别吸取每个I. 5ml离心管中的细胞上清100 μ I加到ρ27抗原反应板中，按ELISA试剂盒说明书检测DFl细胞中的ρ27抗原， 并通过酶标仪读数进行结果判定。当样品与阳性对照比值(S/P值)大于O. 2时，即判定该样品阳性。ALV ρ27抗原检测用ELISA试剂盒由IDEXX公司生产，批号09254-CG801。细胞中ρ27抗原的检测
取出步骤1.4中冻存的所有DFl细胞，3000rpm离心5min。然后分别吸取上层液体 100 μ I加到ρ27抗原反应板中，按ELISA试剂盒说明书检测DFl细胞中的ρ27抗原，并通过酶标仪读数进行结果判定。当样品与阳性对照比值(s/ρ值)大于O. 2时，即判定该样品阳性。ALV ρ27抗原检测用ELISA试剂盒由IDEXX公司生产，批号09254-CG801。数据的统计与处理
采用SPSS 17. O软件进行数据的统计与相关性分析。结果
2.1细胞上清中外源性ALV p27抗原检测结果
ALV p27抗原检测结果显示，采集的24份无菌鸡抗凝血接种DFl细胞，培养8d_9d 后的细胞上清中可以检出所有的15份阳性样品，见表I。结果表明，在常规检测方法中，稳定检出P27抗原阳性所需的培养时间为8d-9d。表I细胞上清中p27抗原检测结果(S/Ρ值*)
权利要求
1.一种DFl细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤1)DFl细胞的培养DFl细胞传代于24孔细胞培养板，并置于39°C、5%C02培养箱中进行培养，培养至DFl 细胞长成70%-80%单层；培养基为含10%胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM ；2)鸡抗凝血的采集与处理常规方法无菌采集鸡抗凝血1ml, 1500rpm离心5min取白细胞,接种到步骤I培养至长成70%-80%单层的DFl细胞；再向24孔细胞培养板中每孔中加入100 μ I待检样品，置于 39°C、5%C02培养箱中继续培养2 h，然后换成含1%胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM，再置于39°C、5%C02培养箱中培养；3)DFl细胞的收集培养4d-5d后倒掉上述细胞培养基，24孔细胞培养板中每孔加入500 μ I pH 7. 2的磷酸盐缓冲液 PBS NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO4 2mmol/ L，-20°C冻存至少Ih ；4)DFl细胞中p27抗原的检测取出上述冻存的DFl细胞，融化后以3000rpm离心5min后取上层液体，吸取100 μ I上层液体加到Ρ27抗原反应板中，按ELISA试剂盒说明书检测DFl细胞中的ρ27抗原，并通过酶标仪读数进行结果判定；当样品与阳性对照比值S/P值大于O. 2时，即判定该样品阳性。
全文摘要
本发明涉及一种DF1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法，是利用ALV首先要感染DF1细胞，然后再释放至细胞上清，同一培养时间的DF1细胞比细胞上清中的ALV含量高这一原理，通过冻融接种鸡抗凝血的DF1细胞，使DF1细胞中的ALV释放，从而缩短检测到ALV的时间，达到快速检测ALV的目的。与检测细胞培养上清中ALV的常规检测方法比较，本发明不仅具有同等稳定性和准确性，而且更快速，操作流程缩短了4天以上，有利于种鸡场外源性禽白血病净化所必需的批量样品细胞培养检测技术的推广应用。
文档编号G01N33/569GK102590507SQ20121005221
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者刘绍琼, 孙淑红, 张培培, 王秀臻 申请人:山东农业大学