专利名称：一种可适用于观察骨骼微细结构及研究其环境记录的石珊瑚骨骼样品制备方法
技术领域：
本发明属于生物地球化学领域和环境生态领域，涉及一种实验用造礁石珊瑚骨骼样品的制备方法。
背景技术：
造礁石珊瑚在生命活动过程中分泌并沉积碳酸钙，形成连续的骨骼生长层。造礁石珊瑚对外界环境变化反应敏感，温度、盐度、PH等环境因子的日周期变化都会引起珊瑚虫生理状况甚至健康状况的改变，其同期钙化所形成的文石在生物化学性状上亦会受到影响，比如其所含同位素δ 180、δ 13C、δ 11B组成比率的改变，地球化学元素(包括重金属元素) 的含量发生变化，骨骼密度条带发生变化等等。故而，造礁石珊瑚骨骼的生长同步记录了珊瑚生长历史和环境变化信息，被广泛的应用于生物地球化学，生态环境等领域，诸如古气候重建、海平面波动、火山喷发、大陆径流、上升流、海洋污染甚至生产力的研究。同时基于造礁石珊瑚骨骼构造和微细结构特征的观察还被广泛应用远古四射珊瑚的分类和演化、现代造礁石珊瑚(六放珊瑚)的分类以及医学领域珊瑚羟基磷灰石人工骨的研究和临床应用等研究领域。在进行石珊瑚骨骼样品的同位素分析、重金属分析、微细结构观察等实验之前， 都须通过前期处理，去除珊瑚水螅体组织，以及骨骼中所含有的少量有机质及无机碳酸盐胶结物。这些杂质都足以影响珊瑚骨骼地球化学测量的结果和微细结构的观察。因此，制备适用于观察骨骼微细结构及地球化学测定的石珊瑚骨骼样品是开展石珊瑚环境记录等研究的前提，具有重要的意义。国内外诸多涉及石珊瑚骨骼前处理的文献中有相当一部分未曾提及具体的处理方法或者只是简单的用淡水冲洗、煮沸或者超声波震荡一番而已。这些方法往往无法有效地去除珊瑚组织等有机质，并且还常会引起珊瑚骨骼损伤甚至变异。应用较为广泛的是腐蚀和氧化法，根据其化学物质可划分为NaOH、H2O2, NaClO三种不同浸泡方法。但是关于这三种方法的叙述都不是很细致，对于如何有效去除珊瑚组织和骨骼内部杂质而不影响骨骼微细结构和组成成分没有系统的论述和介绍。实际上，NaClO的氧化性最强，但是其毒性和氧化后导致的二次污染不可避免；而NaOH虽具优异的腐蚀性，但是也会引起二次污染并干扰微细结构的观察，只有通过足够的后期清洗才能消弭上述影响。双氧水由于其化学成分的特殊性，能够在进行氧化去污的同时基本没有二次污染，但是因其水溶性呈弱酸性，会导致文石针晶等微观结构的溶解。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可适用于观察骨骼微细结构及研究其环境记录的石珊瑚骨骼样品制备方法，通过简单的实验室器材制备符合不同实验要求石珊瑚骨骼的方法。发明通过以下技术方案实现上述目的本发明的石珊瑚骨骼样品制备方法包括以下步骤(1)将石珊瑚骨骼样品于漂白液中进行第一次浸泡，用清水冲洗，再用新的漂白液中进行第二次浸泡；所述的漂白液是PH 为8-9的10%的双氧水或NaClO溶液；(2)浸泡结束后，将石珊瑚骨骼样品进一步清洗，于 450C 60°C烘干备用。步骤(I)中，所述的第一次浸泡时间为1-2小时左右，使大部分生物组织及有机质被氧化并脱离珊瑚骨骼。随后用洁净的淡水冲洗I分钟，以去除被氧化后的组织污物。第一次浸泡后会产生大量气泡和组织破碎物，故需要更换漂白液进行第二次浸泡。第二次浸泡时间为24小时左右，，进一步充分氧化骨骼内部残余的有机物等杂质。步骤(2)所述的进一步清洗，是先用清水进行涮洗，涮洗步骤需要轻柔减少磕碰， 再置于超声波震荡仪中低档清洗3-5分钟。超声振荡清洗时间和次数可根据实际情况酌情增减，单次震荡时间不可过久，防止水温过高。超声振荡后再用去离子水进行清洗，再进行烘干。本发明采用的漂白液可采用双氧水溶液或次氯酸钠(NaClO)溶液，但鉴于次氯酸钠毒性及可能产生二次污染物，若样品后续用于微量元素(包括金属元素)的测定不建议使用；若后续用于同位素的测定则可使用次氯酸钠溶液，但须清洗干净。优选双氧水溶液，更优选是pH为8. 5的10%的双氧水溶液。调节漂泊液的pH值时，可采用NaOH进行调节。若后续应用于重金属的测定，超声振荡后应将石珊瑚骨骼样品进一步用金属螯合剂溶液浸泡10-20分钟，以彻底清除表面残留金属并使用去离子水重复震荡清洗一次。所用金属螯合剂溶液含有17 mM 二乙基二硫代氨基甲酸钠、O. 4 M维生素C和11.7 mM氯化隹丐(calcium chloride) ;pH值为5。经过去离子水涮洗浸泡后按实验要求可采取不同处理方法。若骨骼样品后续用于同位素的测定，烘干温度不可超过45°C ;其他用途可酌情选择 60°C烘干。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
I.本发明通过应用双氧水等常见试剂和超声波清洗仪去除珊瑚水螅体组织和其他有机杂质，从而获得洁净的石珊瑚骨骼，最大限度的减少制备过程中珊瑚骨骼构造和微细结构的破坏，同时避免了骨骼中微量元素含量和同位素组成比率的改变。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例I
从中科院南海海洋研究所热带海洋生物实验站附近海域珊瑚礁区3 m水深采集鼻形鹿角Pocillopora damicornis。截取长度为5cm的珊瑚样品置于已调整pH值为8. 5的10% 双氧水溶液中浸泡2小时。取出珊瑚骨骼用自来水轻轻涮洗后再次使用相同浓度和pH值的双氧水溶液浸泡24小时。用蒸馏水涮洗干净,然后使用超声波震荡5分钟,最后用去离子水浸泡涮洗后于烘箱60°C烘干。用于骨骼内部构造和微细结构的观察。经过上述步骤处理后的珊瑚骨骼表面和内部结构保存完整，经过4年时间后，隔间腔内的次生文石结构仍保留完好。实施例2从三亚西瑁岛海域珊瑚礁区3m水深采集鹿角杯形珊瑚pociIlopora damicornis，氣取10块3cm的珊瑚，置于已调整pH值为8. 5的10%双氧水溶液中浸泡2小时。取出珊瑚骨骼用自来水轻轻涮洗后再次使用相同浓度和pH值的双氧水溶液浸泡24小时。用蒸馏水涮洗干净，使用超声波清洗10分钟，然后浸泡于螯合物去除剂中10分钟，用去离子水涮洗后再次使用超声波清洗10分钟。最后于烘箱60°C烘干。用于骨骼重金属(Cu、Pb、Cd、Zn、 Ni)的测定。经过上述步骤处理后的珊瑚骨骼表面和内部结构保存完整，经过3年时间后隔间腔内的次生文石结构保留完好。
权利要求
1.一种可适用于观察骨骼微细结构及研究其环境记录的石珊瑚骨骼样品制备方法，其特征在于包括以下步骤(I)将石珊瑚骨骼样品于漂白液中进行第一次浸泡，用清水冲洗， 再用新的漂白液中进行第二次浸泡；所述的漂白液是PH为8-9的10%的双氧水或NaClO溶液；(2)浸泡结束后，将石珊瑚骨骼样品进一步清洗，于45°C 60°C烘干备用。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述的第一次浸泡时间为1-2小时左右。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述的第二次浸泡时间为24小时左右。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述用清水冲洗是用洁净的淡水冲洗I分钟。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的进一步清洗，是先用清水进行涮洗后，再置于超声波震荡仪中低档清洗3-5分钟。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的烘干前，还将骨骼样品用去离子水进行清洗。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述的双氧水或NaClO溶液烘是用 NaOH调节pH值至8. 5。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述的漂白液是双氧水溶液。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的超声波震荡清洗后，还将石珊瑚骨骼样品进一步用金属螯合剂溶液浸泡10-20分钟。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的金属螯合剂溶液含有17mM二乙基二硫代氨基甲酸钠、O. 4 M维生素C和11.7 mM氯化I丐(calcium chloride) ；pH为5。
全文摘要
本发明涉及一种可适用于观察骨骼微细结构及研究其环境记录的石珊瑚骨骼样品制备方法，包括以下步骤(1)将石珊瑚骨骼样品于漂白液中进行第一次浸泡，用清水冲洗，再用新的漂白液中进行第二次浸泡；所述的漂白液是pH为8-9的10%的双氧水或NaClO溶液；(2)浸泡结束后，将石珊瑚骨骼样品进一步清洗，于45℃~60℃烘干备用。本发明通过应用双氧水等常见试剂和超声波清洗仪去除珊瑚水螅体组织和其他有机杂质，从而获得洁净的石珊瑚骨骼，最大限度的减少制备过程中珊瑚骨骼构造和微细结构的破坏，同时避免了骨骼中微量元素含量和同位素组成比率的改变。
文档编号G01N1/28GK102589947SQ20121003938
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者叶承, 张成龙, 李秀保, 雷新明, 黄晖 申请人:中国科学院南海海洋研究所