专利名称：一种胰蛋白酶的检测方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质检测技术领域，尤其涉及一种胰蛋白酶的检测方法。
背景技术：
胰蛋白酶是胰腺分泌的一种水解酶，它能水解由肽键相连的氨基酸类化合物。作为一种重要的蛋白质消化酶，胰蛋白酶在医药、食品及工业生产中都有着广泛的应用，在临床上用于治疗脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等，亦可以喷雾形式吸入用于溶解粘痰；另外，胰蛋白酶与胰腺的分泌功能有着密切的关系，胰蛋白酶的含量是胰腺相关疾病如急性胰腺炎、慢性胰腺炎和胰腺癌的临床诊断的一个重要依据。因此对胰蛋白酶含量的检测对人体健康、医药和食品的质量控制以及工业产品的质量检测有着重要的作用。传统的检测胰蛋白酶含量的方法为分光光度法，然而，分光光度法检测胰蛋白酶的步骤较多，不但操作繁琐，而且检测灵敏度较低，因此需要发展一种简单的、灵敏度高的检测胰蛋白酶含量的方法。荧光光度法具有比分光光度法较高的检测灵敏度，被广泛的用于蛋白质含量的检测，然而对于自身没有荧光性质的蛋白质来说，如胰岛素、胰蛋白酶等，需要借助荧光探针完成对其含量的检测，如新加坡的Yanyan Wang等人合成了一种具有荧光性质的聚合物 PFF-CO2Na,这种聚合物会由于细胞色素c的加入而发生荧光淬灭反应，再加入胰岛素，会由于胰岛素对细胞色素c的水解作用，而使细胞色素c脱离聚合物PFF-CO2Na,导致聚合物重现显示突光特性，从而实现对胰岛素的检测(Yanyan Wang, Yong Zhang, Bin Liu. Anal. Chem. 2010,82(20)，8604 8610)。然而这种荧光聚合物的制备过程较复杂，成本较高，合成困难，使得荧光光度法对蛋白质检测的发展受到了限制。为了促进荧光光度法在蛋白质检测领域中的应用，现有技术致力于开发简单的荧光探针的合成方法，如浙江大学徐建平等人合成了一种季铵化四苯基盐与牛血清蛋白 (BSA)的复合物，并以这种复合物作为荧光探针，采用荧光分光光度法同时检测了胰蛋白酶和抗膜蛋白酶的含量(Jian-Ping Xu,Yuan Fang,Zhe-Gang Song, Ju Mei,Lan Jia,An-Jun Qin, Jing-Zhi Sun, Jian Ji, Ben-Zhong Tang. Analyst,2011,136(11), 2315 2321.),这种荧光探针的合成主要依靠季铵化的四苯基盐的铵基阳离子与BSA的羧基阴离子之间的静电作用力，然而这种静电作用力较弱，容易受到其他物质的干扰，使得检测得到的胰蛋白酶的含量不准确，灵敏度低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胰蛋白酶含量的检测方法，本发明提供的方法对胰蛋白酶的含量的检测结果准确，灵敏度高。本发明提供一种胰蛋白酶的检测方法，包括以下步骤检测金属纳米簇的荧光强度；将胰蛋白酶与金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度；
计算所述金属纳米簇的荧光强度与所述反应产物的荧光强度的差值，根据所述差值与预定的标准曲线，得到胰蛋白酶的含量。优选的，所述金属纳米簇为牛血清蛋白-金纳米簇、牛血清蛋白-银纳米簇、多肽-金纳米簇或多肽-银纳米簇。优选的,所述金属纳米簇为牛血清蛋白-金纳米簇。优选的，所述金属纳米簇按照以下方法制备将金属离子与蛋白质混合，得到混合溶液；将所述混合溶液的pH值调至10 14，搅拌反应得到金属纳米簇。优选的，所述金属离子为金离子或银离子。优选的，所述蛋白质为牛血清蛋白或多肽。优选的，所述多肽包含精氨酸和赖氨酸中的一种或两种，且所述多肽的末端为在碱性条件下具有还原作用的氨基酸。优选的，所述金属离子的物质的量与蛋白质的质量比为(5 15) μ mol (25 75)mg。优选的,所述反应具体为在水浴条件下反应，所述水浴的温度为30°C 45°C。优选的，所述反应的时间为I小时 5小时。本发明提供一种胰蛋白酶含量的检测方法，包括以下步骤检测金属纳米簇的荧光强度；将胰蛋白酶与金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度；计算所述金属纳米簇的荧光强度与所述反应产物的荧光强度的差值，根据所述差值与预定的标准曲线，得到胰蛋白酶的含量。本发明提供的方法以金属纳米簇为荧光探针，所述金属纳米簇包含蛋白质和金属，利用胰蛋白酶使金属纳米簇荧光淬灭的性质，采用荧光分光光度法对胰蛋白酶的含量进行检测。胰蛋白酶能够使金属纳米簇发生荧光淬灭，而且淬灭程度与胰蛋白酶的浓度正相关，从而根据荧光淬灭的程度得到胰蛋白酶的含量。本发明提供的胰蛋白酶含量的检测方法结果准确，灵敏度高，实验结果表明，本发明提供的检测方法对胰蛋白酶检测的灵敏度为1.0X10_9g/mL。另外，本发明提供的胰蛋白酶的检测方法操作简单，选择性好，取样量少。本发明提供的金属纳米簇的合成方法简单，得到的金属纳米簇稳定性好，量子产率高，具有良好的荧光性能。
图I为本发明实施例2得到的标准曲线。
具体实施例方式本发明提供一种胰蛋白酶的检测方法，包括以下步骤检测金属纳米簇的荧光强度；将胰蛋白酶与金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度；计算所述金属纳米簇的荧光强度与所述反应产物的荧光强度的差值，根据所述差值与预定的标准曲线，得到胰蛋白酶的含量。
胰蛋白酶为蛋白质水解酶的一种，它能够选择性地水解蛋白质中由赖氨酸和/或精氨酸的羧基所构成的肽链，作为一种重要的蛋白质消化酶，在临床上可用于治疗脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等，在医药、食品及工业生产中都有着广泛的应用。本发明以金属纳米簇作为荧光探针，利用胰蛋白酶使金属纳米簇荧光淬灭的性质，采用荧光分光光度法对胰蛋白酶进行检测。本发明检测得到金属纳米簇的荧光强度，所述金属纳米簇优选按照以下方法制备将金属离子与蛋白质混合，得到混合溶液；将所述混合溶液的pH值调至10 14，搅拌反应得到金属纳米簇。本发明将金属离子与蛋白质混合，得到混合溶液。金属纳米簇属介观相，它具有与微观金属原子和宏观金属相所不同的性质，它是一种由金属的几个至几十个原子组成核心，有机单分子或生物分子等作为保护基团组装而成的核/壳型分子级聚集体。金属纳米簇具有荧光、水溶性的分子级聚集体。其特有的量子尺寸效应使其荧光发射光谱在可见光到近红外光区范围内可调谐。此外，金属纳米簇具有生物相容性好、光稳定性强、反聚合能力强、斯托克位移(Stoke’ s shift)较大且在所有相关时间尺度上无闪烁等特点，大大改善了其作为生物标记物的性能。在本发明中，所述金属离子优选为金离子或银离子，更优选为金离子，最优选为氯金酸中的金离子；所述蛋白质优选为牛血清蛋白或多肽，更优选为牛血清蛋白，其中，所述多肽优选包含精氨酸和赖氨酸中的一种或两种，且所述多肽的末端为在碱性条件下具有还原作用的氨基酸，本发明对所述多肽中氨基酸的数目没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的、具有上述技术方案所述的特征的多肽即可；所述金属离子的物质的量与蛋白质的质量比优选为(5 15) μ mol (25 75) mg，更优选为(6. 5 12. 5) μ mol (30 70) mg,最优选为(8 10) μ mol (40 60)mg ;所述金属离子优选为金属离子溶液,所述金属离子溶液的摩尔浓度优选为(5 15)mmol/L,更优选为(6. 5 12. 5)mmol/L,更优选为 (8 10) mmol /I,η得到混合溶液以后，本发明将所述混合溶液优选置于25°C 50°C、更优选30°C 45°C，最优选35°C 40°C的温度下，使所述金属离子与所述蛋白质进行初步反应，所述初步反应的时间优选为5分钟 20分钟，更优选为8分钟 15分钟。所述金属离子与所述蛋白质完成初步反应后，将得到的溶液的pH值调至10 14， 搅拌反应得到第一金属纳米簇。在本发明中，向所述初步反应得到的溶液中加入pH值调节剂，将所述溶液的pH值调节至10 14，优选调至11 13，所述pH值调节剂优选为氢氧化钠溶液，本发明对所述氢氧化钠溶液的浓度没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的调节溶液PH值的技术方案即可。本发明对所述搅拌没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的搅拌的技术方案即可， 在本发明中，所述反应的温度优选为25°C 50°C，更优选为30°C 45°C，最优选为35°C 40°C;所述反应的时间优选为5小时 25小时，更优选为8小时 20小时，最优选为10小时 15小时。得到金属纳米簇后，本发明检测得到金属纳米簇的荧光强度，本发明对所述金属纳米簇荧光强度的检测方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的荧光分光光度法即可。在本发明中，优选将所述金属纳米簇置于水浴中，静置后测定其荧光强度。所述金属纳米簇优选为牛血清蛋白-金纳米簇、牛血清蛋白-银纳米簇、多肽-金纳米簇或多肽-银纳米簇，更优选为牛血清蛋白-金纳米簇；所述金属纳米簇优选为金属纳米簇水溶液，本发明对所述金属纳米簇水溶液的浓度没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的金属纳米簇水溶液的浓度即可，在本发明中，所述金属纳米簇水溶液的摩尔浓度优选为I μ mo I/L 10 μ mol/L,更优选为3 μ mol/L 8 μ mol/L ;所述水浴的温度优选为25V 50°C，更优选为30°C 45°C，最优选为35°C 37°C ;所述静置的时间优选为O. 5小时 5小时，更优选为I小时 4小时,最优选为I. 5小时 3小时；所述测定的突光激发波长优选为350nm 400nm,更优选为360nm 390nm ;所述测定的激发狭缝优选为5nm 20nm,更优选为8nm 15nm ;所述测定的发射狭缝优选为IOnm 30nm,更优选为15nm 25nm。得到金属纳米簇后，本发明将胰蛋白酶与金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度。本发明将胰蛋白酶与金属纳米簇混合，得到混合溶液，将所述混合溶液在水浴中反应，得到反应产物。在本发明中，所述胰蛋白酶的质量与金属纳米簇的物质的量的比优选为(10_3 l(T9)g : (1(T1CI l(T7)mol,更优选为(10_4 10_8)g : (I (T9 I (Γ8) mol ;在所述混合溶液中，所述胰蛋白酶的质量浓度优选为(10_3 10_9)g/mL，更优选为(10_4 10_8)g/mL ;所述水浴的温度优选为25°C 50°C，更优选为30°C 45°C，最优选为35°C 40°C;所述反应的时间优选为0. 5小时 5小时，更优选为I. O小时 4小时，最优选为I. 5小时 3小时。在所述混合溶液中，金属纳米簇与胰蛋白酶发生反应，具体为胰蛋白酶将金属纳米簇中的蛋白质水解，使得金属与蛋白质分离，分离后的金属粒子会发生团聚，使得金属纳米簇的荧光强度降低，从而发生荧光淬灭的现象，而且胰蛋白酶的浓度与金属纳米簇荧光淬灭的程度成正相关，因此能够根据金属纳米簇荧光淬灭的程度得到胰蛋白酶的浓度。得到胰蛋白酶与金属纳米簇的反应产物后，本发明检测得到所述反应产物的荧光强度。本发明对所述反应产物荧光强度的检测方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的荧光强度的测定方法即可，在本发明中，所述反应产物的荧光强度的测定与上述技术方案中检测金属纳米簇的荧光强度的过程相同。根据上述技术方案得到反应产物的荧光强度后，本发明计算所述金属纳米簇的荧光强度与所述反应产物的荧光强度的差值，根据所述差值与预定的标准曲线，得到胰蛋白酶的含量。在本发明中，所述标准曲线优选按照以下方法获得检测得到金属纳米簇的荧光强度；将胰蛋白酶的标准溶液与金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度；计算所述金属纳米簇的荧光强度与所述反应产物的荧光强度的差值，根据所述差值与胰蛋白酶标准溶液的浓度，得到标准曲线。在本发明中，获得标准曲线中对金属纳米簇荧光强度的检测方法与上述技术方案中所述检测金属纳米簇荧光强度的过程相同。本发明将胰蛋白酶的标准溶液与金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度。本发明对所述胰蛋白酶标准溶液的配制没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的胰蛋白酶标准溶液的配制方案即可。在本发明中，所述胰蛋白酶标准溶液的质量浓度优选为(10_3 10_9)g/mL，更优选为(10_4 10_8)g/mL ;所述胰蛋白酶的质量与所述金属纳米簇的物质的量的比优选为(10_3g 10_9g) (I(TltW)I I(Tmol)，更优选为 (l(T4g l(T8g) (l(T9mol l(r8mol);所述反应的过程与上述技术方案所述金属纳米簇与胰蛋白酶反应的过程相同。根据上述技术方案得到胰蛋白酶标准溶液与金属纳米簇的反应产物后，本发明检测所述反应产物的荧光强度，得到金属纳米簇与胰蛋白酶标准溶液的反应产物的荧光强度。本发明所述检测反应产物荧光强度的过程与上述技术方案中对胰蛋白酶与金属纳米簇反应产物的荧光强度的检测过程相同。根据上述技术方案得到金属纳米簇与所述反应产物的荧光强度后，计算得到所述金属纳米簇的荧光强度与所述反应产物的荧光强度的差值，根据所述胰蛋白酶标准溶液的质量浓度与其对应的差值，得到标准曲线。在本发明中，优选对所述胰蛋白酶标准溶液的质量浓度取对数，以所述胰蛋白酶标准溶液质量浓度的对数为横坐标，以所述胰蛋白酶标准溶液对应的差值为纵坐标，绘制得到标准曲线。得到标准曲线后，根据所述标准曲线与上述技术方案得到的金属纳米簇的荧光强度与胰蛋白酶的荧光强度的差值，得到胰蛋白酶的含量。本发明提供了一种胰蛋白酶含量的检测方法，采用金属纳米簇作为荧光探针，所述金属纳米簇包含蛋白质和金属，其中的蛋白质在胰蛋白酶与金属纳米簇反应的过程中会被胰蛋白酶水解，使蛋白质与金属粒子分离，分离后的金属粒子会发生团聚，使得金属纳米簇发生荧光淬灭，造成其荧光强度降低，而且荧光淬灭的程度与胰蛋白酶的含量成正比，从而实现对胰蛋白酶的检测，本发明提供的方法结果准确，灵敏度高。另外本发明提供的方法操作简单，成本低，而且本发明提供的金属纳米簇量子产率高，荧光性能好，发射光为红光， 制备方法简单，容易合成。为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的胰蛋白酶含量的检测方法进行详细描述，但不能将他们理解为对本发明保护范围的限定。实施例I将5mL摩尔浓度为lOmmol/L的氯金酸溶液与5mL质量浓度为50mg/mL的牛血清蛋白溶液混合，在37°C下反应10分钟，然后向其中加入质量浓度为30%的氢氧化钠溶液， 将溶液的PH值调至12，然后将得到的混合溶液在37°C下搅拌反应12小时，得到牛血清蛋白-金(BSA-Au)纳米簇。本发明检测BSA-Au纳米簇的荧光光谱性质，得到本实施例制备的BSA-Au纳米簇的发光颜色为红光；测定金属纳米簇的荧光强度，结果表明在摩尔浓度为5 μ mol/L的 BSA-Au的荧光强度为171。实施例2将摩尔浓度为5 μ mol/L的实施例I制备的BSA-Au金属纳米簇溶液置于37°C水浴中2小时，采用荧光激发波长为385nm，激发狭缝和发射狭缝分别为IOnm和20nm，检测得到其荧光强度为171。将含有5 μ mol/L BSA-Au金属纳米簇分别与质量浓度为I X 10_8g/mL、 I X l(Tg/mL、I X 10_6g/mL、I X 10_5g/mL 或 I X 10_4g/mL 的胰蛋白酶溶液在 37°C水浴中反应 2 小时，检测其荧光强度。
本实施例得到的反应后的其荧光强度值分别为155、121、105、86和62，计算得到 I X 10-8g/mL、I X 10-7g/mL、I X l(T6g/mL、I X l(T5g/mL 或 I X l(T4g/mL 的胰蛋白酶溶液对应的荧光强度的差值分别为16、50、66、85和109，将胰蛋白酶的质量浓度取对数，以胰蛋白酶质量浓度的对数为横坐标，荧光强度的差值为纵坐标，绘制得到标准曲线，结果如图I所示， 图I为本发明实施例2得到的标准曲线，由图I可知，本实施例得到的荧光强度的差值与胰蛋白酶质量浓度的对数之间存在良好的正相关，线性曲线方程为A = 197. 8+22. IlgC(g/ mL)，相关系数为O. 9920，其中A为荧光强度的差值，C为胰蛋白酶的质量浓度，单位为g/ mL，线性范围为10_8g/mL 10_4g/mL。本发明提供的方法具有较高的灵敏度，最低检测线为 I X 10 9g/mL。实施例3将摩尔浓度为5 μ mol/L的实施例I制备的BSA-Au金属纳米簇溶液置于37°C水浴中2小时，采用荧光激发波长为385nm，激发狭缝和发射狭缝分别为IOnm和20nm，检测得到其荧光强度为171。将含有质量浓度为5X 10_8g/mL胰蛋白酶和摩尔浓度为5 μ mol/L的 BSA-Au金属纳米簇的混合溶液在37°C水浴中反应2小时，平行检测反应产物的荧光强度三次。本实施例得到的反应产物的荧光强度与5 μ mol/L的BSA-Au金属纳米簇的荧光强度之间的差值分别为36. 0,36. 2和36. 6，根据实施例I得到的标准曲线计算得到本实施例中胰蛋白酶的质量浓度分别为4. 8X10_8g/mL、4. 9X10_8g/mL和5. I X 10_8g/mL，结果如表I 所示，表I为本发明实施例3 6得到的检测结果。实施例4将摩尔浓度为5 μ mol/L的实施例I制备的BSA-Au金属纳米簇溶液置于37°C水浴中2小时，采用荧光激发波长为385nm，激发狭缝和发射狭缝分别为IOnm和20nm，检测得到其荧光强度为171。将含有质量浓度为3X 10_7g/mL胰蛋白酶和摩尔浓度为5 μ mol/L的 BSA-Au金属纳米簇的混合溶液在37°C水浴中反应2小时，平行检测反应产物的荧光强度三次。本实施例得到的反应产物的荧光强度与5 μ mol/L的BSA-Au金属纳米簇的荧光强度之间的差值分别为53. 5,53. 8和54. 1，根据实施例I得到的标准曲线计算得到本实施例中胰蛋白酶的质量浓度分别为2. 95X 10VmL,3. 02X 10VmL和3. 16X 10VmL,结果如表I所示，表I为本发明实施例3 6得到的检测结果。实施例5将摩尔浓度为5 μ mol/L的实施例I制备的BSA-Au金属纳米簇溶液置于37°C水浴中2小时，采用荧光激发波长为385nm，激发狭缝和发射狭缝分别为IOnm和20nm，检测得到其荧光强度为171。将含有质量浓度为8X 10_6g/mL胰蛋白酶和摩尔浓度为5 μ mol/L的 BSA-Au金属纳米簇的混合溶液在37°C水浴中反应2小时，平行检测反应产物的荧光强度三次。本实施例得到的反应产物的荧光强度与5 μ mol/L的BSA-Au金属纳米簇的荧光强度之间的差值分别为85. 0,85. 5和85. 3，根据实施例I得到的标准曲线计算得到本实施例中胰蛋白酶的质量浓度分别为7. 94X 10VmL,8. 32 X 10VmL和8. 13 X 10VmL,结果如表I所示，表I为本发明实施例3 6得到的检测结果。
实施例6将摩尔浓度为5 μ mol/L的实施例I制备的BSA-Au金属纳米簇溶液置于37°C水浴中2小时，采用荧光激发波长为385nm，激发狭缝和发射狭缝分别为IOnm和20nm，检测得到其荧光强度为171。将含有质量浓度为6X 10_5g/mL胰蛋白酶和摩尔浓度为5 μ mol/L的 BSA-Au金属纳米簇的混合溶液在37°C水浴中反应2小时，平行检测反应产物的荧光强度三次。本实施例得到的反应产物的荧光强度与5 μ mol/L的BSA-Au金属纳米簇的荧光强度之间的差值分别为104. 1、104. 8和104. 6，根据实施例I得到的标准曲线计算得到本实施例中胰蛋白酶的质量浓度分别为5. 75 X 10 VmL,6. 16 X 10 VmL和6. 02 X 10 VmL,结果如表I所示，表I为本发发明实施例3 6得到的检测结果。表I本发明实施例3 6得到的检测结果
权利要求
1.一种胰蛋白酶的检测方法，包括以下步骤检测金属纳米簇的荧光强度；将胰蛋白酶与金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度；计算所述金属纳米簇的荧光强度与所述反应产物的荧光强度的差值，根据所述差值与预定的标准曲线，得到胰蛋白酶的含量。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述金属纳米簇为牛血清蛋白-金纳米簇、牛血清蛋白-银纳米簇、多肽-金纳米簇或多肽-银纳米簇。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述金属纳米簇为牛血清蛋白-金纳米簇。
4.根据权利要求I 3任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述金属纳米簇按照以下方法制备将金属离子与蛋白质混合，得到混合溶液；将所述混合溶液的PH值调至10 14，搅拌反应得到金属纳米簇。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述金属离子为金离子或银离子。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白质为牛血清蛋白或多肽。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述多肽包含精氨酸和赖氨酸中的一种或两种，且所述多肽的末端为在碱性条件下具有还原作用的氨基酸。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述金属离子的物质的量与蛋白质的质量比为(5 15) iimol (25 75)mg。
9.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述反应具体为在水浴条件下反应，所述水浴的温度为30°C 45°C。
10.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述反应的时间为I小时 5小时。
全文摘要
本发明提供一种胰蛋白酶的检测方法，包括以下步骤检测金属纳米簇的荧光强度；将胰蛋白酶与金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度；计算所述金属纳米簇的荧光强度与所述反应产物的荧光强度的差值，根据所述差值与预定的标准曲线，得到胰蛋白酶的含量。本发明提供的检测方法以金属纳米簇为荧光探针，所述金属纳米簇包括蛋白质和金属，利用胰蛋白酶对金属纳米簇的荧光淬灭性质，而且荧光淬灭的程度与胰蛋白酶的浓度正相关，采用荧光分光光度法对对胰蛋白酶的含量进行测定。本发明提供的检测方法准确度高、灵敏度高、选择性好，实验结果表明，本发明提供的检测方法对胰蛋白酶检测的灵敏度为1.0×10-9g/mL。
文档编号G01N21/64GK102590166SQ20121003031
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者徐国宝, 胡连哲 申请人:中国科学院长春应用化学研究所