专利名称：一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，具体地说，涉及一种应用毛细管电泳检测原生质体与单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)或药物的相互作用，实现ssDNA或药物对原生质体的识别，进而实现对细菌的检测，属于生物分析领域。
背景技术：
目前，微生物检测分析的方法主要有生理生化鉴定、气相色谱、免疫学、分子生物学、傅里叶变换红外光谱、三维荧光光谱以及毛细管电泳等方法。其中，毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),又称高效毛细管电泳 (highperformance capillary electrophoresis, HPCE),是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性，如电荷、大小、等电点、极性、亲和行为以及相分配特性等为根据的液相微分离分析技术。毛细管电泳的工作原理为某物质在受到其它物质的各种作用，包括化学、物理和生物的作用后，该物质自身的荷电情况、几何尺寸、构型及具有原性质形态的浓度等性质将发生改变。在毛细管电泳谱图中，所述改变表现为该物质的迁移时间、峰高、峰面积的改变。CE是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平加入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能，生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。毛细管电泳具备以下优点高效，自由溶液CE的效率在105 106理论塔板之间；快速，几十秒至十几分钟完成分离；微量，进样所需的样品体积可小到luL，试剂消耗体积在I 50nL ；多模式，仅需一台仪器就可根据需要选用不同的分离模式；样品对象广，可从无机离子到整个细胞，具有很强的分析功能和潜力；自动，通常使用水溶液，对人对环境无害，实属“绿色”分析技术。目前，CE已成为重要的分离技术，在生物、医药以及化工等领域具有广阔的应用前
旦
-5^ O基于小分子与微生物的相互作用对微生物进行检测，目前已有关于核酸分子与微生物发生相互作用识别检测微生物的报道，但能够与核酸分子发生相互作用的微生物非常少，因为微生物的细胞壁具有强屏蔽作用，使微生物能与核酸分子相互作用的位点非常少， 即使有相互作用的位点，这些位点的相互作用力也非常微弱，所以大大限制了利用小分子与微生物的相互作用以识别检测微生物的准确率和应用范围。原生质体指在人为条件下，去除原有细胞壁或抑制新生细胞壁后所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状对渗透敏感的细菌。现有技术中主要是通过酶法去掉细菌的细胞壁制备得到原生质体，由不同细菌制备的原生质体具有该细菌的特性，原生质体在适宜条件下可生长繁殖形成与原细菌生物活性基本相同的细菌，因此对原生质体的识别即等同于对原生质体所属细菌的识别。研究ssDNA或药物对原生质体的识别，进而实现对相关细菌的检测，具有重要的理论和应用价值，目前还未见有关于应用毛细管电泳检测原生质体与 ssDNA或药物的相互作用实现对细菌检测的方法的报道。
发明内容
为实现准确、快速、简便、低成本地检测细菌，本发明的目的在于提供一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法应用毛细管电泳检测原生质体与ssDNA 或药物的相互作用，实现ssDNA或药物对原生质体的识别，进而实现对细菌的检测；可克服现有核酸分子与微生物发生相互作用识别检测微生物的方法中存在的相互作用位点少以及相互作用力弱的缺陷，具有准确、快速、简便以及成本低特点。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法步骤如下(I)制备原生质体采用生物领域中制备细菌原生质体的常规技术手段进行制备。(2)毛细管电泳检测用样品配制将待检测的细菌原生质体和与所述原生质体相互作用的ssDNA或药物采用毛细管电泳缓冲液配制成样品，样品中，原生质体悬液的浓度为IO5 109CFU/mL，ssDNA溶液的浓度为2 20 μ M,药物溶液的浓度为O. 5 10mmol/L。(3)毛细管电泳检测样品将步骤(2)制备得到的样品进行毛细管电泳检测，所述毛细管电泳为常规毛细管电泳技术。其中，当毛细管电泳为毛细管区带电泳时，原生质体悬液的浓度为IO7 IO9CFU/ mL ；ssDNA溶液的浓度为2 20 μ M ;药物溶液的浓度为O. 5 lOmmol/L ;将所述原生质体悬液和ssDNA溶液混合或将原生质体悬液和药物溶液混合得到毛细管区带电泳检测用样品。检测时，将样品转移至毛细管区带电泳进样瓶中，采用压力进样或电进样，使样品进入毛细管一端；然后加电压进行电泳，使样品在毛细管内移动并通过紫外检测器或荧光检测器；此时，在选定的波长下检测原生质体与ssDNA或药物的相互作用，可检测到明显复合物的产生，游离分子浓度降低，实现ssDNA或药物对原生质体的识别。当毛细管电泳为亲和毛细管电泳时，原生质体悬液的浓度为IO6 109CFU/mL ； ssDNA溶液的浓度为2 20 μ M ;药物溶液的浓度为O. 5 10mmol/L ；检测时，预先将原生质体悬液充满毛细管；采用压力进样，使ssDNA溶液或药物溶液进入毛细管一端；然后加电压进行电泳，在电泳的过程中ssDNA或药物会与原生质体发生相互作用；通过紫外检测器或荧光检测器可检测随着原生质体浓度的增大，ssDNA或药物出峰时间逐渐向后偏移，说明原生质体与ssDNA或药物发生了相互作用，偏移越大，作用越强；实现了 ssDNA或药物分子对原生质体的识别。紫外检测器检测时采用的紫外波长范围为180 600nm。激光诱导荧光检测器 (LIF)的激发波长为488nm或635nm，发射波长为520nm。当待检测的细菌原生质体为大肠杆菌原生质体或嗜酸乳杆菌的原生质体时，优选毛细管电泳缓冲液由硼酸根离子浓度为50mM，pH = 8. 7的硼酸-硼砂缓冲液与lmol/L的蔗糖溶液以体积比为I : I混合而成；ssDNA的核苷酸序列为人工合成的核苷酸序列5’-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG- (40N) -CCT ATGCGT GCT ACC GTG M-3’，即核苷酸序列表中数字标识符〈210〉所表示的序列标识符I所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中SEQ ID No. I ； 药物为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或二苯乙烯苷。优选毛细管电泳所用毛细管的长度为30 100cm，内径为10 100 μ m。采用压力进样时的压力为500 25000Pa，进样3 30s ;采用电进样方式时，电进样条件为500 30KV，3 30s。加电压时的电泳电压O 30KV。有益效果I.本发明提供了一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法采用细菌的原生质体用于与ssDNA或药物相互作用，通过毛细管电泳进行检测，提供了一种简单、实用、快速和低成本检测细菌的新方法；2.本发明提供了一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法中采用细菌的原生质体作为检测对象，原生质体制备操作简单、成熟可靠且不需要复杂的前处理，由不同的细菌制备的原生质体具有专一的特性，对原生质体的识别即等同于对所述细菌的识别；采用原生质体作为检测对象可以克服用细菌作为检测对象时细胞壁的强屏蔽作用、作用位点少和作用强度弱等不利因素，原生质体暴露了细菌细胞膜上的各种酶及蛋白，大大增加了与ssDNA或药物相互作用的结合位点，ssDNA或药物更易与原生质体相互作用形成复合物，使检测的准确率更高，适用对象范围更广；3.本发明提供了一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法中选用与原生质体特异性结合的ssDNA或药物对原生质体进行识别检测，对原生质体具有很强的相互作用，且具有专一性；4.本发明提供了一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法中通过毛细管电泳检测原生质体与ssDNA或药物发生的相互作用，具有毛细管电泳在仪器成本、实验成本、操作技术和试剂消耗量少等方面的优势；5.本发明提供了一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法中的原生质体电泳后仍具有生物活性，在适宜条件下可恢复其细胞壁，生长繁殖形成菌落恢复到细菌状态，进一步证明可通过ssDNA或药物对原生质体的识别进而识别细菌；6.本发明提供了一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法可用特定的小分子、药物或原生质体的适配体对原生质体进行检测，进而筛选出特定的细菌。
图I为实施例2通过激光诱导荧光检测器检测到的毛细管区带电泳谱图。图2为实施例2中大肠杆菌原生质体电泳后平板培养所拍的照片。图3为实施例3通过激光诱导荧光检测器检测到的毛细管区带电泳谱图。图4为实施例3中嗜酸乳杆菌原生质体电泳后平板培养所拍的照片。图5为实施例4通过紫外检测器检测到的亲和毛细管电泳谱图。图6为实施例5通过紫外检测器检测到的亲和毛细管电泳谱图。图7为实施例6通过紫外检测器检测到的亲和毛细管电泳谱图。
图8为实施例7通过紫外检测器检测到的亲和毛细管电泳谱图。图9为实施例8通过紫外检测器检测到的亲和毛细管电泳谱图。图10为实施例9通过紫外检测器检测到的亲和毛细管电泳谱图。
具体实施例方式为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出实施例。以下实施例I 9中，硼酸-硼砂缓冲液为硼酸根离子浓度为50mM，pH = 8. 7的硼酸-硼砂缓冲液；溶菌酶为20000U/g，购自北京拜尔迪生物技术有限公司；电泳缓冲液由硼酸根离子浓度为50mM，pH = 8. 7的硼酸-硼砂缓冲液与lmol/L 的蔗糖溶液以体积比为I:I混合而成；ssDNA的核苷酸序列为人工合成的核苷酸序列5’-AGC AGC ACA GAGGTC AGA TG- (40N) -CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3’，即核苷酸序列表中 SEQ ID No. I ；毛细管区带电泳检测使用的毛细管电泳仪为美国Beckman公司生产的Beckman P/ACETM MDQ毛细管电泳仪；亲和毛细管电泳检测使用的毛细管电泳仪为美国Agilent公司的 AgilentTechnologoies 7100 毛细管电泳仪；激光诱导荧光检测器(LIF)购自美国Beckman公司；药物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和二苯乙烯苷均购自北京市理化分析测试中心。在实施例4 9中，中性标记物二甲基亚砜(DMSO)添加量(体积)非常少,对样品ssDNA和药物的浓度影响忽略不计。实施例I培养细菌(I)在超净工作台上接种大肠杆菌，从平板上挑取大肠杆菌单菌落，接种于LB液体培养基中，摇床培养12h，温度为37°C，转速为200转/分钟，得到培养好的大肠杆菌。(2)在超净工作台上接种嗜酸乳杆菌，从平板上挑取嗜酸乳杆菌单菌落，接种于 MRS液体培养基中，静置培养48h，温度为37°C，得到培养好的嗜酸乳杆菌。实施例2(I)取实施例I培养好的大肠杆菌ImL,在3000r/min下离心5min,弃上清得到沉淀，将沉淀用硼酸-硼砂缓冲液离心洗涤3次，向洗涤后的沉淀中加入已在37°C预热5min 的浓度为12g/L的溶菌酶100 μ L、硼酸-硼砂缓冲液50 μ L和2mol/L的蔗糖溶液50 μ L， 得到混合溶液1，将混合溶液I置于离心管中放入37°C的水浴锅中水浴25min，再向混合溶液I中加入O. 05mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA) 50 μ L，得到混合溶液2，其中EDTA的浓度为 O. Olmol/L，混合溶液2继续在37°C下水浴15min，得到大肠杆菌的原生质体混合溶液；将所述大肠杆菌的原生质体混合溶液在3000r/min离心5min,弃上清,沉淀用电泳缓冲液离心洗涤3次，得到的沉淀为大肠杆菌的原生质体，将所述原生质体加入200μ L的电泳缓冲液中悬浮备用。(2)用电泳缓冲液配制浓度为109CFU/mL的大肠杆菌原生质体悬液和浓度为4 μ M的ssDNA溶液，并将它们按体积比为I : I的比例充分混合均匀，得到样品。(3)将内径为75m、柱长为50. 2cm的熔融石英毛细管用O. IM的NaOH溶液冲洗 6min,然后用三蒸水冲洗3min,再用电泳缓冲液冲洗4min。采用毛细管电泳仪进行毛细管区带电泳，检测ssDNA与原生质体的相互作用。检测时，将样品转移至毛细管区带电泳进样瓶中，采用压力进样，使样品进入熔融石英毛细管一端；然后加电压进行电泳，使样品在熔融石英毛细管内移动并通过激光诱导荧光检测器；所述激光诱导荧光检测器的激发波长为488nm，发射波长为520nm ;其中，所述毛细管区带电泳采用压力进样时的压力为 O. 5psi(lpsi = 6. 89X103Pa，即 3445Pa)，进样 5s,电泳电压为 20KV，毛细管温度为 25。。。相同毛细管区带电泳条件下，还分别对大肠杆菌原生质体悬液和ssDNA溶液单独进样进行了检测。检测完毕后的电泳图谱如图I所示，其中谱线I为大肠杆菌原生质体悬液单独进样时的检测结果，因为大肠杆菌原生质体的荧光强度很低，因此很难检测到，未出现特征峰；其中谱线3为ssDNA溶液单独进样时的检测结果，因为ssDNA带有荧光，可检测到其荧光吸收，因此出现游离ssDNA的特征峰；谱线2为大肠杆菌原生质体悬液与ssDNA溶液混合均匀后的样品检测结果，可明显检测到样品具有多个相邻的特征峰，且其中游离ssDNA的特征峰明显降低，实现了 ssDNA对大肠杆菌原生质体的识别，进而实现了对大肠杆菌的检测。收集熔融石英毛细管出口端样品进行平板培养，培养基为LB固体培养基，培养温度为37°C，培养时间为12小时，从图2中可以看出经过电泳后的大肠杆菌原生质体经过培养可恢复其细胞壁，生长繁殖形成菌落，恢复到原大肠杆菌状态。实施例3(I)取实施例I培养好的嗜酸乳杆菌2mL,在3000r/min下离心5min,弃上清得到沉淀，沉淀用硼酸-硼砂缓冲液离心洗涤3次，向洗涤后的沉淀中加入已在37°C预热5min 的浓度为24g/L的溶菌酶100 μ L、硼酸-硼砂缓冲液50 μ L和2mol/L的蔗糖溶液50 μ L， 得到混合溶液1，将混合溶液I置于离心管中放入37°C的水浴锅中水浴30min，再向混合溶液I中加入O. 05mol/L的EDTA 50 μ L，得到混合溶液2，其中EDTA的浓度为O. 01mol/L,混合溶液2继续在37°C下水浴20min，得到嗜酸乳杆菌的原生质体混合溶液；将所述嗜酸乳杆菌原生质体混合溶液在3000r/min离心5min，弃上清，沉淀用电泳缓冲液离心洗涤3次，得到的沉淀为嗜酸乳杆菌原生质体，将所述原生质体加入200μ L的电泳缓冲液悬浮备用。(2)用电泳缓冲液配制浓度为109CFU/mL的嗜酸乳杆菌原生质体悬液和浓度为 4 μ M的ssDNA溶液，并将它们按体积比I : I充分混合均匀，得到样品。(3)将内径为75 μ m,柱长为50. 2cm的熔融石英毛细管用O. IM的NaOH溶液冲洗 6min,然后用三蒸水冲洗3min,再用电泳缓冲液冲洗4min。采用毛细管电泳仪进行毛细管区带电泳检测ssDNA与嗜酸乳杆菌原生质体的相互作用。检测时，将样品转移至毛细管区带电泳进样瓶中，采用压力进样，使样品进入熔融石英毛细管一端；然后加电压进行电泳， 使样品在熔融石英毛细管内移动并通过激光诱导荧光检测器；所述激光诱导荧光检测器的激发波长为488nm，发射波长为520nm。其中，所述毛细管区带电泳采用压力进样时的压力为O. 5psi，进样5s，电泳电压为20KV，毛细管温度为25°C。相同毛细管区带电泳条件下，还分别对嗜酸乳杆菌原生质体悬液和ssDNA溶液单独进样进行了检测。检测完毕后的电泳图谱如图3所示，其中谱线I为嗜酸乳杆菌原生质体悬液单独进样时的检测结果，因为嗜酸乳杆菌原生质体的荧光强度很低，因此很难检测到，未出现特征峰；其中谱线3为ssDNA溶液单独进样时的检测结果，因为ssDNA带有荧光，可检测到其荧光吸收，因此出现游离ssDNA的特征峰；谱线2为嗜酸乳杆菌原生质体悬液与ssDNA溶液混合均匀后的样品检测结果，可明显检测到样品具有多个相邻的特征峰，且其中游离ssDNA 的特征峰明显降低，实现了 ssDNA对嗜酸乳杆菌原生质体的识别，进而实现了对嗜酸乳杆菌的检测。收集熔融石英毛细管出口端样品进行平板培养，培养基为MRS固体培养基，培养温度为37°C，培养时间为36小时，从图4中可以看出经过电泳后的嗜酸乳杆菌原生质体经过培养可恢复其细胞壁，生长繁殖形成菌落，恢复到原嗜酸乳杆菌状态。实施例4(I)同实施例I步骤(I)。(2)用电泳缓冲液分别配置不同浓度的大肠杆菌原生质体悬液，如表I所示，用电泳缓冲液配置浓度为10 μ M的ssDNA溶液，所述ssDNA溶液中添加有中性标记物DMS0。(3)对不同浓度的大肠杆菌原生质体悬液与ssDNA溶液之间的相互作用分别采用毛细管电泳仪进行亲和毛细管电泳检测如下将内径为75 μ m,柱长为48. 5cm的熔融石英毛细管用O. IM的NaOH溶液冲洗6min, 然后用三蒸水冲洗3min，再用电泳缓冲液冲洗4min。检测时，预先将大肠杆菌原生质体悬液充满熔融石英毛细管；采用压力进样，使ssDNA溶液进入熔融石英毛细管一端；然后加电压进行电泳，使用紫外检测器进行检测，检测波长为195nm。在电泳的过程中ssDNA会与大肠杆菌原生质体发生相互作用。其中，所述亲和毛细管电泳采用压力进样时的压力为50mbar(lmbar = IOOPaJP 5000Pa)，进样5s，电泳电压为20KV，毛细管温度为25°C。在进行上述亲和毛细管电泳时，电泳液还对ssDNA溶液单独进样进行了检测。检测完毕后的电泳图谱如图5所示，其中，谱线I是ssDNA溶液单独进样时的检测结果，出现两个特征峰，前一个峰为中性标记物DMSO的特征峰，后一个峰为ssDNA的特征峰；谱线2 8分别为不同浓度的大肠杆菌原生质体悬液与ssDNA溶液之间的相互作用的检测结果，每条谱线具体对应的大肠杆菌原生质体浓度如表I所示，其中大肠杆菌原生质体的单位为CFU/mL。从谱线2 8中可以看出随着电泳缓冲液中大肠杆菌原生质体浓度的增加，ssDNA的特征峰的位置会逐渐向后偏移，说明大肠杆菌原生质体与ssDNA发生了相互作用，偏移越大，作用越强，实现了 ssDNA对大肠杆菌原生质体的识别，进而实现了对大肠杆菌的检测。表I
权利要求
1.一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于步骤(I)原生质体；2)毛细管电泳检测用样品配制将检测的原生质体和与所述原生质体相互作用的 ssDNA或药物采用毛细管电泳缓冲液配制成样品，样品中，原生质体悬液，ssDNA溶液的，药物溶液的浓度为；(3)将步骤(2)制备得到的样品进行毛细管电泳检测。
2.根据权利要求I所述的一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于当毛细管电泳为毛细管区带电泳时，原生质体悬液的浓度为107109CFU/mL ;ssDNA溶液浓度为220 μ M ;药物溶液浓度为O. 510mmol/L将所述原生质体悬液和ssDNA混合或将原生质体悬液和药物溶液混合得到毛细管区带电泳检测用样品，采用紫外检测器或荧光检测器对电泳结果进行检测。
3.根据权利要求I所述的一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于当毛细管电泳为亲和毛细管电泳时，原生质体悬液的浓度为106109CFU/mL ;ssDNA溶液的浓度为220 μ M ;药物溶液的浓度为O. 510mmol/L，采用紫外检测器或荧光检测器对电泳结果进行检测。
4.根据权利要求2或3所述的一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于紫外检测器的紫外波长为180600nm ;荧光检测器为激光诱导荧光检测器，激发波长为488nm635nm,发射波长为520nm。
5.根据权利要求I所述的一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于当待检测的以核苷酸，即核苷酸序列表中的SEQ ID No. I。
6.根据权利要求I所述的一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于毛细管电泳所用毛细管的长度为30100cm,内径为10100 μ m。
7.根据权利要求I所述的一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于毛细管电泳采用压力进样，进样时的压力为50025000，进样330s。
8.根据权利要求I所述的一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于毛细管电泳采用电进样，电进样条件为50030KV，330s。
9.根据权利要求I所述的一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法其特征在于毛细管电泳的电泳电压为030KV。
全文摘要
本发明涉及一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法如下(1)制备原生质体；(2)将待检测的细菌原生质体和与所述原生质体相互作用的ssDNA或药物用毛细管电泳缓冲液配制成样品，样品中，原生质体悬液的浓度为105～109CFU/mL，ssDNA溶液的浓度为2～20μM，药物溶液的浓度为0.5～10mmol/L；(3)将步骤(2)制备得到的样品进行毛细管电泳检测。所述方法通过实现ssDNA或药物对原生质体的识别，进而实现对细菌的检测；可克服现有核酸分子与微生物发生相互作用识别检测微生物的方法中存在的相互作用位点少以及相互作用力弱的缺陷，具有准确、快速、简便以及成本低特点。
文档编号G01N21/33GK102590319SQ20121000942
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者古力, 孟朝阳, 屈锋, 梅芳 申请人:北京理工大学