变应原微阵列的利记博彩app

专利名称：变应原微阵列的利记博彩app
变应原微阵列本发明涉及一种用于评估对象是否已发生哮喘、结膜炎或鼻炎或具有其发生风险的方法。本发明还涉及用于所述方法的抗原集合，所述方法包括鉴定与此类风险相关的抗原。
背景技术：
哮喘被普遍认为是一种主要的全球性健康问题。在过去的五十年中，它是影响成人和儿童的最常见的疾病之一，其导致了全世界多达3亿个病例，并且令人担忧的是它出现频率在逐年上升。遗传因素(细胞因子和免疫应答基因)和环境因素(如病毒性感染、变应原和职业性暴露)均与哮喘易感性、发作年龄和严重程度有关。但是，该疾病的发病机理还未被完全阐明。·一个主要的风险因素是发生对外源抗原的免疫应答，所述免疫应答的特征在于产生抗原-特异性IgE。此概念最先来自于下述现象，哮喘的患病率与血清IgE水平紧密相关。现在，压倒性的证据已经确证IgE在特应性哮喘中的作用，而数个研究还揭示了 IgE和非特应性哮喘之间的关联性。更多的争论是抗原特异性IgE在决定疾病的发作和严重程度中的作用。因为发现房尘螨是灰尘中变应原的主要来源，所以数个研究将抗特异性螨变应原的血清IgE的存在与哮喘相联系。但是，在世界范围内有大量个体(尤其生活在美国和斯堪的纳维亚的一些地区的那些)通常在他们的生活中不与螨抗原接触。有意思的是，这些个体在哮喘的患病率和严重程度的方面不会显示出任何降低。因此，很有可能另一些抗原单独地或组合地在该疾病的发病中起重要的作用。遗憾的是，抗原接触、IgE产生与哮喘的发生和/或严重程度之间的任何关联性似乎都涉及出乎意料地大量的因素，并且接触与应答之间似乎存在非线性关系。迄今为止，试图确定特异性IgE和哮喘之间关联性的研究集中在要么分析一种抗原要么同时分析少数几种抗原，如描述房尘螨作用的那些研究。与此相反，目前尚没有针对IgE对大抗原库的应答和哮喘发生进行调查的研究。已知变应原的数目和已经分析的抗原的数目之间的不均衡性可很好地解释在建立特异性IgE在哮喘的发病中作用之中所遇到的困难。例如，大多数患有哮喘的患者具有针对多于一种变应原的血清IgE，并且其每一种在疾病表现和症状中的相对贡献仍然是未知的。因而，尽管通过针对常见变应原的特异性IgE的存在所定义的特应性与哮喘相关联，但是特异性IgE的高血清水平并不总是与特应性相关联。结果，全部的或特异性的IgE与哮喘应答模式之间的相关性仍是不清楚的。因此，尽管确定患者或对象是否显示对特定抗原的免疫应答是相对直接的，但是并没有简单的方式来确定同一患者或对象是否具有发生更严重病症(如哮喘、结膜炎或鼻炎)的风险。目前，本发明人出人意料地发现预测发生此类病症的风险是可能的。

发明内容
在本发明的第一个方面中，提供鉴定生物标志物集合的方法，更特别地鉴定与哮喘、结膜炎或鼻炎显著相关的抗原集合。所述方法包括(a)在分离自一组无症状对象的多个第一样品中测量IgE对多种抗原反应性的水平，(b)在分离自一组患有哮喘、结膜炎或鼻炎的对象的多个第二样品中测量IgE对多种抗原反应性的水平，(C)鉴定对象组之间IgE反应性水平显示出显著差异的所述多种抗原的子集，其中IgE对所述子集反应性的水平与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关。在某些实施方案中，尽管可对每个个体样品分开进行评估，但基本上同时测量每个样品内的所述多种抗原的反应性水平。 优选地，在第一和/或多个第二样品中的样品数目为30至800个样品，优选为50至800个样品。因此，样品的数目可以是30至800之间的任何数目；例如，30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700或800，或者其中的任何范围。优选地，所述多种抗原包含30至400种抗原，优选为50至400种抗原。因此，抗原的数目可以是30至400之间的任何数目，例如30、40、50、60、70、80、90、100、200、300或400，或者其中的任何范围。在一些具体的实施方案中，抗原被选择为在特定地区出现率最高的抗原。在一个实施方案中，通过将所述多种抗原与分离自所述对象组的血清相接触以及使用抗IgE抗体测定与每种抗原结合的IgE的量来确定IgE反应性的水平。在一些具体的实施方案中，所述抗IgE抗体是带标记的抗体。在另一些实施方案中，所述抗IgE抗体是未标记的并且通过使用带标记的抗体进行检测。所述带标记的抗体可包含荧光标记。在一些优选的实施方案中，通过使用荧光检测来确定与每个抗原结合的IgE的量。在某些实施方案中，所述多种抗原结合于至少一个具有多个地址的固体支持物，其中每个地址具有一种独特的抗原布置于其上。在一个实施方案中，所述固体支持物包含多个可分开识别的珠子(separately identifiable bead)。在另一个实施方案中，所述固体支持物是微阵列。当所述固体支持物是微阵列时，抗原的点样浓度为O. 008mg/ml至3mg/ml ο在第二个方面中，本发明提供用于评估对象是否已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎或者具有其发生风险的方法。在某些实施方案中，所述方法包括测量在分离自对象的样品中IgE对生物标志物集合的反应性水平。优选地，所述生物标志物是预先确定与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关联的抗原，例如通过本发明的第一个方面预先确定的。在一些具体的实施方案中，IgE对生物标志物集合中的至少75%的反应性水平高于3. 511U/ml，这表明该对象可能发生或已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎。在某些实施方案中，所述生物标志物集合包含9至51种抗原。在一些具体的实施方案中，所述生物标志物集合选自以下抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、EU E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、Gl、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。在一个实施方案中，通过将所述多种抗原与分离自所述对象的血清相接触以及使用抗IgE抗体测定与每种抗原结合的IgE的量来确定IgE反应性的水平。在某些实施方案中，所述抗IgE抗体是带标记的抗体。在另一些实施方案中，所述抗IgE抗体是未标记的并且通过使用带标记的抗体对其进行检测。所述带标记的抗体可包含荧光标记并且通过荧光检测确定与每种抗原结合的IgE的量。在一些优选的实施方案中，所述抗原与固体支持物结合。在一个实施方案中，所述固体支持物是微阵列。在某些实施方案中，所述抗原的点样浓度为O. 008mg/ml至3mg/ml。优选地，基本上同时测量与生物标志物集合中每种抗原结合的IgE的量。在第三个方面中，本发明提供用于诊断哮喘、结膜炎或鼻炎或者确定其发生风险的抗原微阵列。所述微阵列包含与哮喘、结膜炎或鼻炎相关联的生物标志物集合。在某些实施方案中，所述微阵列包含抗原F95、Gl、G3、G4、G12、G14、G15和G18以及任选地一种或更多种选自以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907 和 Χ910。 在本发明的第四个方面中，提供用于确定发生哮喘、结膜炎或鼻炎的风险的试剂盒。在另一些实施方案中，所述试剂盒可用于诊断哮喘、结膜炎或鼻炎。此类试剂盒可包含⑴抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18，(ii)任选地一种或更多种以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、
16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910，(iii)抗 IgE 抗体。在一些具体的实施方案中，所述试剂盒可包含在微阵列上的抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、El、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、Gl、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。在本发明的第五个方面中，提供根据第一个或第二个方面的方法、根据第三个方面的微阵列或根据第四个方面的试剂盒用于评估对象是否已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎或者具有其发生风险的用途。在本发明的第六个方面中，提供前述方面的方法、微阵列或试剂盒用于筛选可用于治疗哮喘、结膜炎或鼻炎的化合物的用途。


图I :表I列出了 103种抗原，它们排列成阵列并用作第一抗原集合以用于筛选。抗原标示符与ImiliunoCAPi^应原产品货号相对应，例如可得自Phadia AB。图2 :表2举例说明了根据年龄、性别和包括哮喘在内的多种特应性疾病的发生对实施例中所述研究群体的分层。图3 :表3例证了对103种变应原的聚类反应性特征谱的相关性分析。分析了三个聚类在性别频率、结膜炎、湿疹、鼻炎、哮喘以及哮喘持续性、哮喘严重程度和发作年龄上的差异。通过在SPSS中使用X 2检验，或者对于发作年龄，通过使用平等性(equality)的Kruskal-Wallis秩和检验评估相关性。图4 :表4列出了排成阵列的变应原子集，当在Mann-Whitney检验中比较哮喘的和非哮喘的个体时，其显示IgE血清反应性上的最高差异。
图5 :针对排成阵列的103种变应原(行)的872个血清(列)的血清反应性特征谱的K-均值聚类分析。显现出每个聚类(节点)中的特异性血清反应性模式，图5a——节点O、图5b——节点I和图5c——节点2 ;将个体变应原的血清反应性特征谱分类为阳性(白框——分类得分I 5)和阴性(黑框——分类得分O)。图6 :针对排成阵列的显著的所选择的51个变应原(行)的872个血清(列)的血清反应性特征谱的K-均值聚类分析。显现出每个聚类(节点)中的特异性血清反应性模式，图6a——节点3、图6b——节点4和图6c——节点5。将个体变应原的血清反应性特征谱分类为阳性(白框——分类得分I 5)和阴性(黑框——分类得分O)。图7 :在对多个比较进行Bonferroni校正后，使用皮尔逊(Pearson' s) x 2试验评估聚类和变量之间的相关性。图7a列出了所有103种抗原的结果，图7b列出了 51种抗原子集的结果。
图8 :示例了基于RBF的ANN哮喘分类器的广义结构和性能。RBF网络由三层组成，分别为输入层(框I 51)、隐层(圈I 8)和输出层(黑框中的哮喘分类)。图9a ANN的预测-观察性能图表。框图代表了 RFB输出种类的预测假概率；对于合并的训练和测试样品，针对已知临床状况的哮喘患者(I)哮喘患者(2)绘制的哮喘(灰色)和非哮喘(白色)图。图％ :对合并的训练和测试样品计算ROC曲线，哮喘(黑色)，非哮喘(灰色)。图10示例了 ANN哮喘分类器的一致性性能。针对所选个体之已知的临床状况，基于皮尔逊X 2检验评估盲性样品的ANN预测的哮喘状况。发明详述本发明人已发现对象将发生或已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎的倾向性或可能性可能与来自该对象的针对特定抗原和抗原集合的特异性IgE的存在和/或结合水平相关联。所述抗原是可用于预测、诊断或确定治疗有效性的生物标志物。这个发现是出人意料的，因为在无症状对象组和有症状对象组之间以及在每个组内个体之间特异性IgE结合程度存在非常大的变异性。该发现是哮喘、结膜炎和鼻炎的治疗和诊断中的显著进步。本发明公开了用于鉴定诊断性生物标志物的方法，所述生物标志物与这些临床状况具有统计学上显著的相关性。所述方法鉴定了无症状患者和有症状患者之间的差异，从而揭示出临床症状与特异性IgE的存在或缺乏之间之前不为所知的相关性。因此，可产生疾病特异性模式并将其用于筛选或诊断。为了鉴定疾病特异性模式，首先需要获得来自至少两组对象的样品一第一组为健康的、无症状的对象以及第二组为有症状的对象。优选地，有症状的对象已被临床诊断为哮喘、结膜炎、鼻炎或这些的组合。但是，显然对本领域技术人员而言，本发明的方法也可施用于其他的(尤其是变应性的)病症或疾病，如皮炎、湿疹、炎症、荨麻疹、支气管狭窄等。为了获得结果或数据，通常，任何样品一般包含或期望包含一种或更多种免疫球蛋白E抗体(IgE)或其结合片段。分离自患者或对象的样品优选为全血样品。此类全血样品可以是，例如静脉或毛细血管样品，或者可以是此类样品的级分(例如血浆或血清)。溶血样品、脂血症样品或黄疸样品或者包含添加剂的样品也被设想适于使用，所述添加剂常见于用以收集血液的管中，如EDTA、肝素和柠檬酸盐。也可使用其他体液(bodily fluid),如淋巴液、初乳、乳汁、唾液、眼泪、尿液或这些流体的级分。在另一些实施方案中，样品可来源于细胞培养物、细胞培养液或上清液或者液化的固体样品，例如来源于组织活检。所述患者或对象是哺乳动物以及可以是人或下列动物，例如但不限于，猫、狗、兔、小鼠、豚鼠、雪貂、猴、马、奶牛或骆驼。在该方法的第一个步骤中，在分离自每组中对象的样品中测量IgE对多种抗原的反应性水平。例如，为了避免统计学或系统偏差，对象可在分析之前分配至特定的组(即有症状的或无症状的)或者可在测试后分配至特定的组。正常情况下，在来自对象的样品中检测不到针对特异性变应原的免疫球蛋白E (IgE)，只有当对象变得对该变应原致敏时才会产生所述IgE。针对特定抗原并且只与该抗原反应的IgE通常被称为特异性IgE(SlgE)。对象可具有针对多于一种变应原的特异性 IgE0反应性用来表示特定抗体与其配体之间相结合从而形成免疫复合物的结合水平。在本发明的背景下，抗体是特异性IgE，配体是抗原。通常，特异性IgE与特定抗原结合。反应性的水平可定义为IU/ml，或者可替代地，可定义为分配为分类得分值的范围。例如，分类O为少于O. 35IU/ml ;分类I为O. 35至O. 7IU/ml ;分类2为O. 71至3. 5IU/ml ;分类3为
3.51 至 17. 5IU/ml ;分类 4 为 17. 51 至 50IU/ml 和分类 5 为 50. 01 至 100IU/ml。或者，IgE对特定抗原的反应性可被认为是阳性/存在或者是阴性/缺乏，例如低于阈值时，应答被视为阴性/缺乏；高于阈值时，应答是阳性/存在。通常，水平> (大于)0. 35IU/ml表明阳性结果，换言之，特异性IgE与其配体结合。事实上，使用合适的测定对样品中特异性IgE与其配体(在本发明情况下为抗原)之间的相互作用形成的抗体-抗原复合物进行测定。在本发明的背景下，术语变应原意指可触发由IgE抗体介导的变应性反应的特定抗原类型。本发明的方法和制备延展至此类变应原及变应原片段或充当变应原的半抗原的广义类别。这些可包括可在变应对象中引起IgE介导应答的所有特异性过变应原。变应原可以是重组的或制备自天然来源的，并且其可包含单一表位或者具有两个或更多个表位的更复杂的混合物，所述两个或更多个表位来自单一抗原或者两种或更多种变应原个体。术语“变应原”和“抗原”通常可互换。本文所使用的术语“多个”定义为两个或多于两个。在本发明的第一个方面的背景中，所用样品的数目应是足以产生统计学显著性结果的数目。对于特定的抗原，该结果应确定所述抗原与来自有症状对象的特异性IgE之间没有相关性，或者确定所述抗原与来自有症状对象的特异性IgE之间有相关性；换言之，确定特定抗原与哮喘、结膜炎或鼻炎的存在之间是否有关联性。 优选地，为了鉴定任何相关性，应测试大量的个体对象，例如总计30至1000个，优选为总计50至1000个。通常，在每个实验或研究中只分析来自每个个体对象的一个样品。取自每组的样品数可大致相等，即当总共使用了 1000个样品时，500个来自无症状的对象，而500个来自有症状的对象。但是,对本领域技术人员而言很清楚,对象和样品的数目可根据许多因素(如患者招募)的不同而不同，并且不一定相等。因此，所用对象和样品的数目应是足以精确地建立相关性的数目。优选地，所述多种抗原将是包含大量抗原的集合，例如大于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 种，更具体地，大于 150、200、250、300、350、400、450 或 500 种。通过使每个个体样品(包含特异性IgE)分开地与多种抗原基本上平行地相接触以及测定来自所述样品的与每种抗原结合的每种特定抗原的量来确定IgE反应性的水平。通常，该方法的特征在于包括两个分开的步骤(a)在分离自无症状对象组的多个第一样品中测量针对多种抗原的IgE反应性水平，(b)在分离自患有哮喘、结膜炎或鼻炎的对象组的多个第二样品中测量针对多种抗原的IgE反应性水平。为避免疑义，对本领域技术人员而言很清楚，这种分成两个单独步骤的分开是出于书面描述目的的人为分离。基本上，两个步骤是相同的，只有样品取自的组不同。因而，在实验室中，(a)和(b)可概括为对于来自每组的每个样品重复的单一步骤，即(ab)在分 离自对象的样品中测量针对多种抗原的IgE反应性水平。对于“η”个样品，步骤(ab)重复至少“η”次。因此，当多个第一样品包含“χ”个样品且多个第二样品包含“y”个样品时，χ+y等于重复的数目n。所以，显然步骤(a)和
(b)可以以任何顺序平行地或者依次地进行，或者根据需要重复步骤(ab)直到测试完所有样品。优选地，通过使用抗IgE抗体的免疫测定的方法测量针对多种抗原的IgE反应性的水平。抗IgE抗体与人免疫球蛋白的IgE同种型反应。因此，在某些实施方案中，通过使用抗IgE抗体确定或定量与每种抗原结合的IgE的量。抗IgE抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、人源化抗体或嵌合抗体，尽管通常优选为亲和纯化抗体，更特别地为单克隆抗体。此类抗IgE抗体可以是常规抗体或重组抗体并且可由单链组成，但优选为由至少轻链或重链组成。但是，应了解，为了结合靶标(如抗体特异性结合的抗原)需要至少一个互补决定区(⑶幻。制备抗IgE抗体的方法为本领域所知。例如，如果期望多克隆抗体，那么可使用所选抗原(如异源抗原IgE)免疫接种选择的哺乳动物如人、小鼠、兔、猪、绵羊、骆驼、山羊或马。之后收集并处理来自经免疫的动物的血清以获得抗体，例如通过免疫亲和层析。单克隆抗IgE抗体可通过本领域已知的方法生产。使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般性方法是公知的(参见，例如，Kohler, G和Milstein, C, Nature 256 495-497 (1975) ；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983) ；Cole 等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy 中的第 77 96 页，Alan R. Liss, Inc. (1985))。本文所提及的一种抗IgE抗体应由表位结合区(如CDR)组成。该抗体可以是任何合适的分类，包括IgE、IgM、IgD、IgA以及特别是IgG。还考虑了这些抗体的多种亚类。在一些具体的实施方案中，可使用抗IgE抗体或保留抗IgE抗体结合特异性的来源于此类抗体的多肽。此类片段包括，但不限于抗体片段，如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv，其全部都能结合至表位。术语“抗IgE抗体”还扩展至任何多种天然或人工抗体以及可获得的抗体衍生蛋白质以及衍生物，例如包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，单结构域抗体，全抗体，抗体片段如F(ab’)2和F(ab)片段、Fv片段(非共价异二聚体)，单链抗体如单链Fv分子(scFv)、微型抗体、寡聚抗体(oligobody)、二聚或三聚抗体片段或者构建体，等等。术语“抗IgE抗体”不暗示任何特定来源，其包括通过非常规方法所获得的抗体，如噬菌体展示。本发明的抗体可以是任何的同种型(例如IgA、IgG、IgM即α、Y或μ重链)并且可以具有K (kappa)或λ (lambda)轻链。因此，本发明扩展至抗IgE抗体和具有用于本发明的IgE结合特异性的结合片段的用途。术语“特异地结合”或“结合特异性”指抗体或其片段以大于结合非靶表位的亲和性结合靶标的能力。例如，抗体与靶表位的结合可导致比非靶表位的结合亲和性高至少10、50、100、250、500或1000倍的结合亲和性。在某些实施方案中，结合亲和性由亲和ELISA测定所确定。在一些替代性实施方案中，亲和性由BIAcore测定所确定。或者，结合亲和性可由动力学方法确定。在一些具体的实施方案中，抗IgE抗体是带标记的抗体。作为非限制性的实例，标记可通过与酶(如过氧化物酶)或者化学发光或突光化合物(Alexa Fluor 555)或质量标 签(mass tag)相缀合。在另一些实施方案中，抗IgE抗体是未标记的并且通过使用另外的抗体检测，另外的抗体一般称为第二抗体，如所述其可以是带标记的。在一个优选的实施方案中，抗IgE抗体是抗IgE的未标记小鼠单克隆抗体，其使用带标记的第二抗体来检测，如抗小鼠IgG。在某些实施方案中，一个或更多个发光的或发荧光的部分可结合亲和素/链霉亲和素，所述亲和素/链霉亲和素继而可结合与抗体化学缀合的生物素。在另一些实施方案中，凝集素(蛋白A/G/L)可连接发光或荧光分子，该分子还可连接抗体或其他蛋白质缀合物。在一些优选的实施方案中，使用了酪胺信号放大系统(tyramide signal amplification system),其使用辣根过氧化物酶(HRP)的催化活性以产生抗体的高密度标记。合适的标记和标记方法是本领域已知的并且对本领域技术人员而目是清楚的。在一些具体的实施方案中，带标记的抗体包含荧光标记。适当的荧光标记为本领域所熟知，例如，非限制性的实例可包括Alexa Fluor488,Alexa Fluor 555、R-藻红蛋白、Aqua、德克萨斯-红(Texas-Red)、FITC、罗丹明、罗丹明衍生物、荧光素、荧光素衍生物、级联蓝(cascade blue)、Cy5或Cy3。检测方法可以是本领域已知的任何合适的方法，如通过光学检测，包括荧光测量、比色法、流式细胞术、化学发光等。其他方法包括电化学法、放射性方法、压电法等。检测结合的另一些方法可以是表面等离子体共振(surface Plasmon resonance, SPR)、表面等离子体显微镜(surface Plasmon microscopy, SPM)、表面等离子体突光光谱(surfacePlasmon fluorescence spectroscopy)或SELDI质谱等。技术人员将了解可通过使用检测方法的组合进行检测。具体地，通过发光信号的测量/检测进行结合的检测，例如通过化学发光化合物产生的化学发光。尽管群体所接触的许多抗原在一个地理区域和另一个区域之间是共有的，但是可能有特定的抗原在一些区域是常见的但在另一些区域是稀有的。因此，对于每次分析或每一次实施所述方法，合适的抗原可选自在特定地理区域或国家中最常见的抗原，并且所述合适抗原可以变化。表I中鉴定了合适的多种抗原，具体为103种抗原。本领域的技术人员能够选择适当的抗原和合适的抗原并且抗原制品为普遍可商购的。尽管一般分开地评估每个个体样品，但是优选地，基本上同时测量每个样品中对所述多种抗原的反应性水平。例如，如果所述多种抗原包含50种抗原，那么对于1000个对象的组，将进行1000个单独的测定并且测量50，000个反应的结果。一个接一个测量如此大量的反应，尽管是可能的，但通常是不可行的并且将花费大量的时间和人力去完成。因而，为了有助于平行处理大量的抗原，优选地，所述多种抗原结合至至少一个具有多个地址的固体支持物，所述地址每个具有一个独特的(即特异性)抗原布置于其上。固体支持物的使用是有利的，因为其能够平行处理大量的抗原，同时尽可能地减少所需的时间和人力。所述固体支持物可以是本领域已知的任何材料，例如玻璃载体、合成载体、硅片或膜。合适的材料包括塑料、玻璃、硅、陶瓷或有机聚合物(包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、纤维素和硝化纤维)。其自身表面可以是如下形式或其部分载玻片、片、微量培养·板或微量滴定板、托盘、膜、纤维、孔、丸、棒、棍、管、珠等。所使用的术语“结合”意指物质(在本发明情况下为抗原)在分子水平(即，通过共价或非共价键或相互作用)上保留、固定或基本上结合至表面。所使用的固定方法应当是可再现的，适用于不同特性(大小、亲水性、疏水性)的抗体、可用于高通量和自动化，并且维持抗原与抗体形成复合物的能力。非限制性的实例是本领域已知的非限制性的合适方法包括被动吸收、基于亲和性的结合、与化学活化表面共价偶联、光化学交叉偶联等。术语“地址”用于指固体支持物或固体支持物上确定位置的独特特征，其允许识别特定抗原，从而实现对针对特定抗原的IgE反应性水平的测定。在一个实施方案中，所述固体支持物是多个珠子，其每个可通过地址分别识别。合适的地址包括RFID标签、质量标签、荧光标签、光学编码、数字磁性标签、光谱编码等。在另一些实施方案中，所述固体支持物为微阵列。本文所使用的术语“微阵列”指用于结合IgE抗体的点的有序阵列。本发明的微阵列包含至少2个、至少9个、至少50个、至少100个、至少500个或至少1000个点。在一些实施方案中，微阵列可包含至少10,000、40，000,100, 000或I, 000，000个不同且独特的点。点的密度为约100个/cm2至约1000个/cm2或更高。“点”表示放置于阵列表面上特定地址(在本发明情况下为物理位置)的一种或更多种试剂(在本发明的情况下为特定抗原或变应原制备物)。通常情况下，点的特征在于存在一种或更多种特异性分子(例如，特定的蛋白质、变应原提取物、抗原等)。点直径可为10至2000 μ m，50至500μπι或150至250 μ m。为了形成阵列，抗原可以以O. 008mg/ml至3mg/ml的点样浓度施于固体支持物的表面。适于测量或读取来自微阵列的荧光信号的系统是已知的。通常，通过在激光点下二维扫描载玻片来构建图像。在约I分钟内可取得图像，但是在图像分析处理方面，分析是复杂的。由于所产生的大量数据以及产生来自每个点或微点的集成信号的清晰测定所需的分析算法，这些处理可以是复杂的。在本发明人之前的专利申请(公开为W0/2003/091712)中，为了逐个像素的构建每个点的图像，本发明人发现有可能通过下述方式读取荧光，即通过照射阵列上每个点的整体以及在单一测量中测量整个点的荧光，而不是分数次对每个点的一部分进行扫描和照射。这个方法使得低成本光源LED可用作发光源。每个荧光分子接受相同的光能，如同如果相干光源被用作发光源时那样。但是检测器产生单一阅读，不需要进一步信号分析(而不是400像素图像/点，其需要复杂的图像处理以计算整个测量)。在一些情况下，由于干涉作用而在信号中引入的额外噪音，相干光源的使用是不利的。在另一些实施方案中，如在国际专利公开W02006/138161中所公开的设想使用微悬臂梁。在另一些实施方案中，使用一个或更多个微流体芯片进行测定。该方法的第三个步骤包括，(C)鉴定在对象组之间显示出IgE反应性水平显著差异的所述多种抗原的子集，其中针对所述子集的IgE反应性水平与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关联。 可通过使用统计数据分析方法来确定对象组之间的显著差异的IgE反应性水平。数据集的统计分析可被用以确定一种或更多种抗原是否与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关，即相关联。例如，根据针对特定抗原的IgE反应性水平，对象可被分为至少两个分类。之后，通过聚类或学习算法分析IgE反应性和健康状况之间的相关性。作为非限制性的实例，合适的方法包括有监督和/或无监督聚类算法、k-均值、主成分分析、分层聚类、最近邻分析、支持向量机、人工神经网络等。特定的聚类或分类中的显著量对象(例如，至少50%、60%、70^^80^^90%或更多)可具有第一健康状况，以及在一个或更多个其他分类中的显著量患者可具有不同的健康状况。从而，相对于另一组对象，可鉴定IgE对第一组对象中多种抗原的反应性的差异。对此类抗原反应性的水平可用作生物标志物用于预测/确定对象的健康状况、临床效果或治疗效果。与临床病症相关的并经鉴定的反应性水平代表了反应性的理想模式，该模式是不同健康状况的对象的代表。结果，此类疾病特定的模式或特征谱可进行比较以预测/确定对象的健康状况、临床或治疗效果。合适的方法如下例证，其包括聚类分析以将数据分配到子集或聚类。分析的终点是与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关或相关联的来自所述多种抗原的抗原子集的鉴定。针对抗原的子集IgE反应性可用以制备可用于比较的针对特定临床状况的一般性反应性特征谱。在下面的实验部分例证了鉴定与此类临床诊断相关的51种抗原的子集。表4中列出了包含所述抗原子集的抗原。显然，任何特定子集的组成取决于所使用的多种抗原的组成。更显然，可合并与临床诊断相关联的抗原子集。例如，第一集合包含20种抗原，第二子集包含30种抗原，假定所述子集之间没有共有的抗原，合并的子集将包含50种抗原。但是，子集之间可能有一些交叉，使得在组合的子集中抗原的总数可能少于组合前每个子集中抗原数目的总和。在这种情况下，所使用的术语合并简单地意指所述抗原一起使用，例如分别放置在同一微阵列上。本发明的第二个方面提供了评估对象是否已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎或者具有其发生风险的方法。该方法包括(a)在分离自所述对象的样品中测量针对生物标志物集合的IgE反应性水平的步骤。在本发明的背景中，至少一定比例的生物标志物来源于与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关的抗原子集。优选地，所述抗原已根据本发明的第一个方面被鉴定。从而，此类抗原已知与临床诊断相关联。因此，本文所使用的术语“预先确定相关联”指，在用于所述方法之前，一个要素(例如抗原)的反应性已显示出与所关心疾病或异常具有统计学上显著的相关性。在下文的实验章节中并根据本发明的第一个方面例证了用于确定此类相关性的合适方法。所使用的术语“比例”意指至少10 %的生物标志物是预先确定与关心的疾病或异常相关的抗原。更具体地，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%，或者至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的生物标志物预先确定与关心的疾病或异常相关。在某些实施方案中，所有的生物标志物(100% )预先确定与关心的疾病或异常相关。对象的IgE反应性特征谱之间的相似或差异指示了对象的分类成员及其各自的健康状况。相似或差异可由任何合适的方法确定，例如由上述的统计学方法。比较可以是 定性的、定量的或其两者。针对抗原子集的IgE反应性可用以制备反应性特征谱，其可用于与特定的临床病症的一般性特征谱进行比较。对象的生物标志物特征谱可与参照特征谱(手动地或电子地)相比较。在一个实例中，通过将针对特定抗原的每个IgE反应性水平与参照数据集或特征谱中针对特定抗原的一般性IgE反应性水平进行比较，来实施所述比较。针对特定抗原的IgE反应性可具有绝对值或归一化的值。可通过倍数变化、绝对差、模式识别或比较或者其他合适的方法(包括算法)来评估针对对象的特定抗原的IgE反应性与参照特征谱或数据集之间的差异。在某些实施方案中，在来自对象的样品中，针对生物标志物集合中至少75%的IgE反应性水平高于3. 51 IU/ml表明对象可能发生或已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎。在另一些实施方案中，反应性水平可高于O. 71IU/ml、高于3. 51IU/ml、高于
17.51IU/ml或高于50.01IU/ml。显然，IgE反应性与针对抗原的应答将有变异性。因此，优选地,针对至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少91 %、92%、93%、94%、95%、96^^97^^98^^99%或100%的所述多种抗原的阳性反应表明对象可能发生或已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎。另外，显然可以有指示临床状况但在抗原之间有所差异的特定的反应性阈值水平。因此，为了诊断或预测的目的，17.51IU/ml的反应性水平可指示一个抗原的阳性结果，但是指示另一个的阴性结果。在一些具体的实施方案中，生物标志物集合包含9至51种预先确定与关心的疾病或异常相关的抗原。预先确定与关心的疾病或异常相关的抗原包括抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907和X910。在下面的实验部分中例证这些抗原的鉴定。在一些具体的实施方案中，优选地至少包括抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18。如上所讨论的，关于本发明的第一个方面，可通过将所述多种抗原或生物标志物与分离自对象的血清相接触以及通过使用抗IgE抗体测定与每种抗原结合的IgE的量来确定IgE的反应性水平。IgE抗体的检测表明致敏过程已经开始。伴随症状和阳性病史，其确认了临床诊断；或者，在没有症状的情况下，其可预测变应性疾病随后的发展。常常发现，特异性IgE抗体应答先于症状出现，而症状随时间随后才发生。再次，如上述，关于本发明的第一个方面，所述抗原与固体支持物结合。因而，在本发明的第三个方面中，提供了抗原微阵列，其用于评估对象是否已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎或者具有其发生风险的方法，所述抗原微阵列包含抗原F95、GU G3、G4、G12、G14、G15和G18和任选地一种或更多种选自以下的抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。优选地，明确地排除不根据本发明的第一个或第二个方面使用的或者不用于评估对象是否已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎或者具有其发生风险的抗原微阵列。 在本发明的第四个方面中，提供试剂盒，其包含(i)抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15 和 G18 以及(ii)任选地一种或更多种抗原 C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。以适用于根据第一个和第二
个方面的方法或适用于根据本发明的第三个方面的制备微阵列的形式提供抗原。此类试剂盒还可包含其他组分，例如抗IgE抗体、洗涤缓冲液、稀释剂、抗体(即一抗、二抗、三抗)、检测剂、荧光团、手套、移液器枪头、操作说明书等。优选地，抗原以微阵列上点的形式提供并且还可包括对照和标准品等。因而，所述试剂盒可包含阵列，其由下列抗原组成C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907和X910。或者，所述试剂盒可包含阵列，其包含抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。在本发明的第五个方面中，以及如在实验部分所例证的，提供了第一个和第二个方面的方法、第三个方面的微阵列或第四个方面的试剂盒的用途，其用于评估对象是否已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎或者具有其发生风险。在本发明的第六个方面中，提供了前述方面的方法、微阵列或试剂盒在筛选用于治疗哮喘、结膜炎或鼻炎的化合物中的用途。例如，所述方法可包括以下步骤(a)在分离自对象的第一样品中测量针对生物标志物集合的IgE的反应性水平；(b)在分离自对象的第二样品中测量针对生物标志物集合的反应性水平和(c)比较IgE的反应性水平以确定任何具有以下特征的差异，即一定比例的生物标志物是预先确定为与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关的抗原。在一个实施方案中，第一样品可在用药物或药品治疗前取自对象。第二样品可在用药物或药品治疗后取自同一对象。在第一和第二样品之间的反应性水平的任何改变可指示特定的药物或样品在治疗哮喘、结膜炎或鼻炎中有用或者具有临床应用。或者，该结果可指示针对个体对象的治疗方案的效力。显然，根据第一个、第二个、第五个和第六个方面的方法或其每个阶段之间，可包括任选的洗涤、干燥和/或孵育步骤。所述方法还可任选地包括所述方法的一个或更多个步骤之间的“封闭步骤”，例如其中将非相互作用蛋白(如牛血清白蛋白(BSA))的浓溶液添加至例如微量滴定板的全部孔中。此类蛋白阻断了其他蛋白的非特异性吸附并且在降低可干扰测定灵敏度的“背景”假象中可能是有益的。通过引用下列描述和实施例可更好的理解本发明，下列描述和实施例意图作为本发明的方法的示例。
实施例群体案例研究这个研究包括后代患特应性哮喘的家族。所有的哮喘患者是特应性的。在4年的 时期内收集特应性哮喘的兄弟姐妹两人(同胞亲属)和三人，主要来自儿科和肺病中心。为了避免拟表型(phenocopy)，所有的患者满足下列标准至少3代为撒丁岛人来源和访视时年龄> 6岁。在募集时期，每个对象接受面试,通过身体检查确定疾病状况,请求使用个人健康记录的许可，以及收集血液样品。每个参与者签署经当地伦理委员会(Azienda SanitariaLocale number 8 protocol 24/Comitato Etico/02, authorization number 4737)批准的知情同意书。哮喘由肺科医师诊断，依照美国胸科学会(American Thoracic Society)标准(I)由肺量测量法评价肺功能用升/分钟表示I次的用力呼气量(FEVl)。根据世界卫生组织指南(World Health Organization guideline)(全球哮喘防治创议(GlobalInitiative for Asthma)),医师进行问卷调查以收集病史并将哮喘严重程度分为4个水平。记录哮喘药品和任何其他药剂的使用。使用标准方法通过对常见吸入性变应原的阳性皮肤测试来测定特应性。关于青春期(18岁)结束后哮喘症状的持续性由医师与具有早期发作史的患者面谈。样品由总计872份血清(包含440位父母的及其子女(432个个体))组成。在研究组内，428位儿童和58位父母(总数的55. 73% )被诊断为哮喘，341位父母(总数的39. 11% )被分类为非哮喘，但是他们中的一些患特应性相关的病症，如鼻炎、结膜炎和湿疹，剩余的5. 16%被分类为未证实的哮喘诊断。将这些数据列于表2中。基于微阵列的免疫测定的开发微阵列免疫测定法由4个阶段组成(“印刷”、处理、扫描、定量和分析)。微阵列的制备为了产生阵列，将选择的变应原(天然提取物、经纯化的变应原和重组分子)一式两份地印刷在乙醛活化的玻璃显微镜载玻片上乱序的位置，以使得处理错误的影响最小化。所述阵列还可包含阳性和阴性对照、空白和内部剂量应答曲线。为了减少标准点样时间、减少批次间变异性和增加每次测试所处理的芯片数目，在单个显微镜载玻片上印刷两个芯片(“变应芯片”)。每个微阵列批次包含120个载玻片，总计240个变应芯片(执行时间为14小时)。研究组的分析需要总共480个经印刷的载玻片，相当于960个芯片，并且全部的印刷过程被分成4个批次。每个芯片包含使用高速机器人技术(Microgrid Compact ；Biorobotics) 一式两份地印在经乙醒活化的玻璃显微镜载玻片(CEL Associates)的103种变应原。在23°C /60°C湿度下“印刷”阵列并在印刷箱内保存过夜。最初在pH7. 4的PBS (重构缓冲液)中重构变应原(由Allergopharma提供)，其终浓度为O. 4至40mg/ml,然后在下列点样缓冲液中点在阵列上PBS pH7. 4、甘氨酸ρΗ2· 4、硼酸盐ρΗ9· 4、甘油10%、DTT 5mM、SDS (O. 2%；0. 05% )、吐温20(0. 01% )D每个变应原的点样浓度为O. 008至3mg/ml。微阵列加工用含有2% BSA的PBS在室温下将经印刷的载玻片封闭I小时。之后将载玻片与各个血清样品(100μ I)在37°C下孵育60分钟。为了显现结合的IgE，载玻片用抗人IgE的第二小鼠单克隆抗体(O. Hyg/miaOOy I)在37°C下孵育45分钟，然后用抗小鼠IgG HRP缀 合抗体(1.6 μ g/mL，100 μ I)在37°C下孵育45分钟，最后用以I : 200稀释的酪胺-Alexa555 (具有HRP-链霉亲和素和Alexa Fluor 555酪胺*的TSA Kit#42 *，* 50-150个载玻片*) (InvitiOgen) (100 μ I)在37°C下孵育15分钟。在测量荧光信号之前，载玻片37°C下干燥。荧光测量使用突光检测扫描仪ScanArray Gx扫描经加工的载玻片并且使用由PerkinElmer Life Sciences Inc提供的ScanArray 软件产生图像。在相同的设置下扫描所有的载玻片90%激光功率和60%光电倍增管增益。结合的IgE的定量使用ProScanArray Express 3. O版软件获取突光信号。针对内部阴性对照校正各个点的PMC读取值，以确定高于背景的信号。对各个变应原进行一式两份的测量。通过具有在每个微阵列上所印记的内部校准曲线的插值确定变应原结合的IgE的浓度(IU/ml)。校准曲线由递减的链霉亲和素的量(80 μ g/ml ；53. 3 μ g/ml ；35. 6 μ g/ml ；
23.7 μ g/ml ；15.8yg/ml ；10. 5yg/ml ；7. 02 μ g/ml)组成，其捕获加入至封闭溶液的骨髓瘤生物素化的IgE。为了将IU/ml值赋给校准曲线，使用由微阵列载玻片产生的外部参考曲线对不同量的经印刷链霉亲和素下所收集的平均信号进行插值处理，该微阵列载玻片用重复的山羊抗人IgE印刷并用递增浓度的人IgE(WH0参考标准0. 35IU/ml, I. 0IU/ml,3. 5IU/ml, 10. 0IU/ml,50. OlU/ml)孵育。使用校准曲线对从变应原收集的信号进行插值处理，以获得IU/ml值并转化成在标准反应性等级中通过绘制数据的分类得分。分类得分值分类0(少于0.35IU/ml);分类 1(0. 35 0. 71IU/ml);分类 2(0. 71 3. 5IU/ml);分类 3(3. 51 17. 5IU/ml);分类4(17. 51 50IU/ml);分类 5(50. 01 100IU/ml)。使用荧光免疫测定分析血清IgE反应性，其作为基础并入103种变应原的微阵列，这些变应原代表了从欧洲中南部与特应性疾病最频繁相关联的变应原中选择的11个独特的变应原分类。分析血清反应性特征谱在用103-维载体(每个变应原I维)编码每个血清反应性特征谱之后，使用Cluster 3. 035软件通过k_均值聚类分析来分析通过血清与阵列免疫测定一起孵育而产生的反应性特征谱，以及使用MapleTree来显现聚类结果。通过使用不同数目的聚类进行特征谱分配的尝试，以鉴定使得聚类内相似性和聚类间差异最大化的条件。为此，我们分析了具有数个性能指标的聚类谱，如由Machaon37、38软件提供，以验证每种分配尝试的统计学显著性。在k = 3的条件下(即设置成获得3个聚类的k-均值聚类分析)，5个性能指标中有4个，如由Machaon得到的最高值所计算的。分析在k = 3时使用k_均值聚类分析产生的聚类以寻找与年龄，性别和病理状态(哮喘、鼻炎等)存在、其持久性和/或严重程度，发作年龄等的相关性。在SPSS软件内进行统计检验，如皮尔逊(Pearson' s) χ 2检验和Kruskall-Wallis非参数检验，并且制作Excel以调查在聚类中是否病理状态的频率是否有显著差异以及每个聚类是否与作为整体的研究群体有显著差异。聚类分析根据血清反应性特征谱的相似性，我们使用k_均值聚类分析将血清分成明显的·聚类。k_均值算法是一种无监督迭代算法，其将对象分配位固定的用户定义数目(k)的聚类，使得聚类内部相似但是与外部不相似。为了定义血清之间的距离，使用欧几里得距离(Euclidean distance)相似性度量。进行数次迭代以尽可能减小每个聚类内距离的总和以及通过收敛提供最佳的聚类分析解决方案。这个分析显示在算法的10000次迭代内实现了收敛至最佳的解决方案。应用具有不同k值(I至14和20)的多个统计检验，以确定产生彼此显著不同的聚类的划分。它们包括(I)轮廓图验证法(Silhouette Validation method)将轮廓图(silhouette)的概念定义为聚类紧密度和隔离度的指标。良好的划分过程导致聚类紧密(即每个聚类内的对象彼此接近)并且良好的分离(即聚类彼此远离)，而糟糕的划分产生彼此太接近(接近到它们可能会部分重叠的程度)的聚类并且聚类内的对象可能较分散，从而使得难以将一些样品分配到特定的聚类。对于第i个对象的轮廓图的数学模型，S(i)为“，其中a(i)是在同一聚类中第i个对象相对于全部其他对象的平均不相似性；b(i)是第i个对象相对于另一个最接近的聚类中全部对象的最小平均不相似性。S(i)为-1(错误分类的对象)至1(对象的最佳划分结果)。全部聚类对象的S(i)的算术平均数提供了整个聚类过程的整体性能。指数越接近1，聚类结果越好。(2) Dunni s有效性指数。与轮廓图法类似，这个技术也是基于良好划分产生紧密的和良好分离的聚类的概念。模拟此类属性的指数，Dunn' s有效性指数，被定义为
'1H- ' +，其中d(ci、cj)是聚类ci和cj之间的距离(聚类间距离)；d’ (ck)是聚类ck
的聚类内距离，η是聚类的数目。在良好的划分处理中，聚类间的距离是最大的(聚类之间的最大分离)，而聚类内的距离是最小的(聚类内的最大紧密)。D越高，聚类结果越好。(3)Davies-Bouldin有效性指数。另外通过DB指数来获得紧密度和隔离度的同一
概念，所述DB指数被定义为’ ·%(- ；, I5其中η是聚类数目，Sn是属于聚类的所有对象到
其聚类中心的平均距离(紧密度的度量)和S(Qi;Qp是聚类中心之间的距离(隔离度的度量)。如果聚类紧密且彼此远离，那么DB很小(良好的聚类结果)。jj(4) C指数。C指数的定义如下·β= _7就单一聚类来说，假设其所有对象组
ijIBm
织成对。假设在给定的聚类中有I对。那么S是那些I对的距离的总和。这可被认为是该聚类紧密度的度量。就整个对象的集合(即所有聚类)来说，通过在所有可能的对中(即聚类内以及聚类间二者)取可见的I最小距离来计算另一个距离总和Smin。类似地，将所有对中I最大距离的总和计算为smax。根据此定义，小的C值是良好聚类结果的指标。(5)分离指数。这个技术是基于以下假设，如果对象隶属于某聚类，那么其最近的邻居也可能隶属于同一聚类。在良好的聚类结果中这个性质应被最大化。为了在数学上获取这个概念，引入了下列表达其中Xi是第i个对象，Vk (Xi)是\的最接近的邻居的一部分，已被正确地分配到同一聚类，以及η是数据集中对象的总数。对于良好的聚类结果，每个聚类中每个对象具有高的Ik值是理想的。对于每个个体，我们得到了针对103种独特的变应原的IgE反应性特征谱，这些变应原选自欧洲中南部最常见与特应性疾病相关联的那些。在分类得分和所识别的变应原的组合方面，个体特征谱的分析显示出很高的IgE识别模式多样性水平。极少数的特征谱是相同的，并且许多在其他方面健康的个体显示出针对许多变应原的出人意料复杂的模式。这一多样性有可能反映了变应原暴露与研究群体遗传多样性方面的差异。为了鉴定在IgE血清反应性方面显示出相似性的组，按照我们通过实验验证使得聚类间相似性和聚类内差异性最大化的设置，我们使用k-均值聚类分析来处理特征谱。每个聚类的IgE反应性特征谱或节点在图5a、5b和5c中所示。这个分析产生了 3个聚类，其在所识别的变应原的组合以及受不同特应性疾病(包括哮喘、鼻炎和结膜炎)影响的个体比例方面彼此有显著差异。特别地，哮喘的个体贡献了聚类I反应性特征谱的83%。与研究群体中哮喘的个体的那些百分比相比，这个百分比显示了非常高的统计学显著性差异(P< 1E-8)(表 3)。有意思的是，尽管聚类O和聚类2在哮喘的和非哮喘的个体比例上不显示显著性差异，但是它们的组成分析证明了，与聚类I相反，它们富含同一家族核心的成员。我们认为，聚类O和2的组成反映了家族成员暴露于包含在微阵列中的常见变应原集合。尽管这些变应原具有强大致敏能力，但是它们与哮喘无关，而是贡献于形成反应性特征谱，因此可掩盖额外的相关性。鉴定哮喘相关的变应原通过使用Mann-Whitney检验比较哮喘的和非哮喘个体针对每个变应原的反应性，以鉴定在两个组中显示最显著差异的那些变应原。研究样品满足下列要求以应用Mann-Whitney检验i)哮喘的和非哮喘的组被认为是独立的；ii)血清反应性值可被认为是定序型随机变量；iii)有足够数目的可比较案例。另外，这个检验不需要特定的值的分布(例如高斯分布(Gaussian))并且可使用具有不同个体数目的两组(但是相似性给出了较好的执行)来进行。数据分析根据所指个体的哮喘状况，在输入文件中标记每个变应原的反应性数据。哮喘的(对应于标记“2”)，非哮喘的(对应于标记“I”)。从文件中手动删除对应于具有未证实的哮喘临床状况之个体的血清(5. 16% )。在排除未证实的诊断的个体之后，用于该分析的血清总数为827。所存在的变应原的起始数目为103。每种变应原的反应性值为O至5(微阵列记录的分类得分)。使用SPSS，在进行分析之前，将数据转换成定序型数据(ordinal)。这个分析产生了 51种变应原的列表(表4)，其被用以建立使用k-均值进行聚类分析的新的反应性特征谱的集合。节点3、4和5的反应性特征谱分别在图6a、b和c中所示。这些新的聚类显示了一些有意思且新的特征。在IgE识别模式和血清组成方面，聚类4与聚类I非常相似，但是在哮喘的个体百分比上显示出进一步增加至88%以及统计学显著性进一步增加。两个剩余的聚类也在其组成上显示出特别显著的统计学差异。聚类3富含非哮喘个体(69% )，而聚类5含有高百分比的哮喘患者(82% )。聚类中哮喘和结膜炎(但湿疹并非如此)的分布非常接近地反映了哮喘的分布，其与其他观察结果(建立了这些特应性疾病中的关联)一致。如预期地，我们没有观察到在聚类3、4和5中富含同一家族核心的成员，从而表明相应的特征谱与哮喘临床状况而不是与接触变应原密切相关。包含最高比例的哮喘的个体的两个聚类(聚类4和5)具有重叠的IgE识别特征谱的特征。聚类4的谱显示了针对9个另外的主要来自食物和禾本科的变应原的特异性反应性。值得注意地，聚类4而不是聚类5显示了与哮喘严重程度的显著相关性，从而揭示一方面的疾病严 重程度与另一方面的IgE应答复杂性和特异性之间的令人意外的相关性。其他数据存在于在图7a和b中。我们的数据证明了哮喘与针对单一变应原的IgE抗体应答之间的相关性显著低估了针对变应原库的个体反应性的内在相似性和差异性，这可以与理解疾病的原因、严重程度和进展有关。这也解释了为什么抗体应答与疾病之间的关联性为何难以鉴定。与此相反，通过分析针对大的变应原集合的IgE血清反应性特征谱，我们可证明，哮喘的和非哮喘的个体在所识别的变应原数目和分类方面具有显著差异。人工神经网络使用具有ANN专用模块的专业软件应用程序，如RBF(径向基函数算法(RadialBasis Function Algorithm) -SPSS 17. 0),来开发分类器。RBF是设计用于在SPSS统计学软件应用程序内进行有监督训练，SPSS提供了一整套强大的函数用于训练专用于分类任务的神经网络，例如针对我们的情况。通过使用作为输入数据的包含51种变应原和827个个体的血清反应性特征谱的样品数据集合来完成神经网络分析。在该样品中，485个是哮喘阳性个体，342个是阴性。为了评估通过减少分类器所考虑的变应原数目而实现的实际改善(通过Mann-Whitney检验的方法，如之前所示例的)，对整个变应原集合训练分离的RBF，然后其结果与对过滤的集合进行的RBF进行比较。样品首先是随机的(参见样品章节的处理)并且所使用的训练样品的大小为整个群体的约60%，留下剩余的个体用于验证目的(10%测试，以及30%保留(holdout))。使用随机化标准选择训练子集，确保样品相对于整个群体的代表性。这是为了确保RBF复制了代表全部群体的行为。全部有监督训练过程重复10次，每次都在一个新的之前未训练过的网络上进行，而且每次用初始群体的一个新的随机化子集。这是为了观察可与训练样品代表性中的变异性相关联的的任何执行中的变异性。RBF网络中有3个层(输入层、RBF层和输出层)。有许多类型的径向基函数；我们使用归一化的RBF(NRBF)。为了评估神经网络的真实效率，神经网络运行不同的10次。网络的总效率为这10次不同试验的平均值。哮喘被视为因变量，分类得分变应原为协变量。所使用的案例划分的具体相对数目由以下组成训练6(60%)，试验1(10%)和维持3(30%)。图8示例了 RBF网络的图示，其分别由3层组成输入层(框I 51)、隐层(圈I 8)和输出层(在黑框中的哮喘分类)。样本数据的处理为了避免样本定向偏差，首先将血清随机化。通过在Matlab中使用RAND变量实现随机化，得到随机数目I至827，并且用其标记每个血清。之后使用字母顺序对最初的血清顺序重新取样。使用的设置为了评估神经网络的真实效率，神经网络运行不同的10次。网络的总效率为这些10次不同试验的平均值。
分析、神经网络、径向基函数变量因变量哮喘协变量C2、D01、D02、D03、D70、D71、D72、D73、E01、E03、E081、E082、F04、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G01、G02、G03、G04、G05、G06、G08、G12、G14、G15、G18、106、K87、MOUM03、M04、M05、M06、T04、T06、T07、T09、T14、T901、W01、W06、X902、X903、X904、X905、X907、X910协变量的重标度无划分指定相对案例数目训练6(60% )，试验 1(10% )和维持 3(30% )结构隐层中单元数目激活发现范围内最佳的单元数目范围激活自动计算范围隐层的激活功能标准化径向基函数隐藏单元中的重叠自动计算重叠的量以使得输出网络结构选择说明、图表、突触权重网络性能选择模型概要、分类结果、Roc曲线、由所观察到的图表的预测激活案例的处理概要存储存储每个因变量的预测值或种类存储每个因变量的预测假概率
存储的变量的名称选择自动产生的唯一名称完成输出激活将突触权重评估输出至XML文件选项 用户——遗漏值选择排除结果包含103种最常见变应原的微阵列免疫测定用以研究属于283个家族的872个个体的IgE血清反应性，其中所有的子女(I至3个)都受哮喘影响。参与这个研究的个体包括父母和所有子女(大部分儿童小于27岁(75%的儿童小于27岁))。从每个个体中收集关于哮喘(发作年龄、严重程度和持续性)以及伴随存在的其他特应性疾病的详细临床历史的信息。对于每个血清样品，对免疫测定进行校准以测量与每个排成阵列的抗原相结合的特异性IgE的浓度(O. 35IU/ml至100IU/ml)。将以IU/ml计的反应性值转化为使用经验证的O 5级的分类得分。这个方法产生了 872个独特的IgE反应性特征谱和超过90，000个抗体-抗原测定。对于每份血清，产生了与IgE分类得分(O至5)相匹配的针对排成阵列的变应原的颜色编码的数字特征谱(从黑至白)(图5a、b、c和图6a、b和c)。血清具有显著不同的针对排成阵列的变应原的IgE反应性。许多收集自非哮喘双亲或哮喘儿童的血清与超过40种变应原发生反应，但是哮喘个体显示出平均最高数目的个体变应原抗体反应。为了研究反应性特征谱的结构，我们使用k-均值聚类分析，通常用以鉴定微阵列数据内的组结构的划分方法。聚类算法用不同的k的值(3至14和20)进行，以使特征谱分裂成越来越多的聚类。使用5个特定的指标(Silhouette指数、Dunn指数、Davies Bouldin、C指数和分离指数)进行的统计分析，用Machaon计算,表明k = 3是通过将特征谱排列成3个聚类使得聚类内的相似性和聚类间的差异性最大化的参数。为了寻找IgE反应性特征谱和哮喘之间的关联，我们研究了在k = 3时产生的聚类在哮喘的和非哮喘个体的频率以及其他特征和病理状态(年龄、性别、结膜炎、湿疹、鼻炎、哮喘持久性和严重程度)的分布上是否有显著差异。许多独立的统计分析(皮尔逊χ2检验和Kruskal I-Wal I is检验)用以评估在聚类之间以及每个聚类与整个样品之间的每个特征和病理状态的频率是否具有显著差异。特别地，χ2检验用于分析二元属性(即，哮喘的对非哮喘的)，而Kruskal I-Wal I is检验在离散数字变量上进行(如哮喘发作的年龄)。这个分析结果表明，3个聚类在哮喘、结膜炎、湿疹、鼻炎和性别的频率上具有显著差异。最突出地，聚类I比其他两个聚类和整个研究样品显示出惊人的(83% )显著更高的比例(χ 2 = 33. 480，P = 2. 16E-08)。在对多个比较进行Bonferroni校正后没有影响统计显著性。类似地，显著地关联也可通过聚类I的结膜炎和鼻炎观察到。谱的划分也强调了聚类中家族核心的有趣分布聚类O和2富含同一家族的成员并且显示出哮喘的和非哮喘个体的相似百分比，聚类I包含显著更高比例的儿童，而双亲非常少。这些发现表明，分配到聚类O或2的同一家族的成员具有与哮喘无关的类似IgE识别模式，这可能是因为暴露于排成阵列的变应原特定集合所产生的占优势的作用。与此相反，家族成员的分离没有在聚类I中发现，这是由于相应的IgE血清反应性特征谱与所述疾病紧密相关。在对研究群体的变应原暴露没有详细了解并且对于引发哮喘相关IgE应答的特定变应原之作用没有任何事先猜测的情况下，对阵列进行了设计。因此，一些变应原很少被识别而另一些在哮喘的和非哮喘的个体中显示出类似的反应性百分比，这并不令人惊讶。针对这些变应原的反应性为所述特征谱的形成提供了贡献，并且可代表掩盖一些相关性的“背景噪声”的来源。为了解决这个问题，我们试图通过以下方式鉴定在阵列中对于哮喘的相关性作出最大贡献的变异性，即通过用阈值P < O. 05的曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)过滤所得结果，以摒除在哮喘和非哮喘个体之间的IgE反应性方面 没有显示出差异的那些变应原。该分析产生了 51个相关变应原的列表，其用以产生新的特征谱并在k = 3时进行聚类关联分析。对新的聚类(聚类3、4和5)进行的相关性研究揭示了 IgE识别特征谱与哮喘之间相关性的进一步增强。聚类4在其结构和组成方面显示了与聚类I高的相似性，但是与哮喘相关性的统计学显著性以及相应的反应性特征谱进一步增加(X 2 = 35. 145，P=9. 18E-09)(图2B)。其他两个聚类与用整个变应原集合所产生的那些有显著差异。这次，没有在聚类I中所包含的大多数哮喘的个体与聚类5的反应性特征谱显著相关(χ2=22.958，P = 4.97E-06)，而聚类2包含了大多数非哮喘的个体(χ2 = 31. 172，p =
7.08E-08)。甚至在对多个比较进行Bonferroni校正后，哮喘的和非哮喘个体分布的差异仍保持高度的显著性。与其他聚类相比，在聚类I中观察到针对结膜炎和鼻炎的强相关性。值得注意的是，由过滤的变应原集合所产生的聚类没有显示出家族成员的共分离。有趣地，两个独特的反应性特征谱4和5与哮喘显著相关。这两个特征谱具有共同的IgE反应性模式，51种变应原中的20种被这两个聚类的血清所识别，而聚类4的血清还与主要来自食物和禾本科的9种变应原(变应原19 23和17 30)发生反应。值得注意的是，与所有其他的聚类和群体研究样本相比，聚类4显示了显著更高比例的被诊断有严重哮喘的个体(严重程度分类3和4)。使用参考谱的预测将一些聚类的反应性特征谱与哮喘相关联的异常强的相关性促使我们生成了人工神经网络(ANN)分类器，其设计用于根据哮喘的和非哮喘个体的反应性特征谱来区分二者。这是通过使用径向基函数(RBF)而开发的，其支持通过样品教导(teaching-by-example)的训练方法(又称监督式训练/监督式学习)。在监督式训练中所使用的每个特征谱样品包含关于51种经过滤的变应原的反应值和关于哮喘状况的个体的健康状况的信息(期望的分类结果)。用于训练RBF(训练集合)的特征谱由整个研究血清样品的60%组成。另外10%的谱被保留用以评估在训练期间(测试集合)的预测精度。留下剩余的个体(即整体群体的30% )并用于评估在10次独立运行中网络的性能(保留集合(holdout set))。ANN将82%哮喘的患者正确地分为“哮喘的”，约72%非哮喘患者分为“非哮喘”。RBF的整体性能符合特征谱相关性分析由RBF分类器将哮喘的患者正确的识别为哮喘的平均百分比接近在聚类4和5中所存在的哮喘的患者之组合的百分比。图9a显示了 ANN通过预测-观察性能图。框线图代表了 RFB输出种类的预测的假概率(predicted-pseudo-probability);对合并的训练和测试样品，针对已知临床状况的哮喘⑴哮喘(2)，绘制哮喘的(灰色)和非哮喘的(白色)。图9b :针对合并的训练和测试样品计算ROC曲线，其中哮喘(黑色)、非哮喘(灰色)。图10示例了 ANN哮喘分类器一致性性能。针对选择的个体的已知临床状况，基于皮尔逊X2检验评估保留样品的ANN预测的哮喘状况。构建来自哮喘患者的组合文库为了分离和表征对与哮喘、结膜炎或鼻炎相关的抗原具有特异性的人IgE抗体， 在本研究中构建来自哮喘的患者的IgE组合文库。外周血单个核细胞从150ml肝素化的血液样品(获自患者)中获得。简要地，通过菲克帕克(FicolΙ-Paque)密度梯度离心制备细胞。通过Davis等，1986的异硫氰酸胍法制备RNA。进行数个独立的cDNA合成以及使用RNA PCR试剂盒(Perkin-Elmer)进行PCR扩增反应。简言之，方案与Steinberger等，1996所使用的相同。将总RNA(20 60 μ g)与对ε 链的恒定区(Cl，5’ -GCT ACT AGT TTT GTT GTC GACCCA GTC;C2，5’ -CGA CTG TAA ACTAGT CAC GGT GGG CGG GGT G)和对轻链(Ckla，5，_GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCCTGT TGAAGC TCT TTG TGA CGG GCA AG ;Ckld，5’ -GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACTCTC CCCTGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G;C2，5’ -CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACATTC TGT AGG)特异的10 20pmol寡核苷酸引物混合，在65°C加热5分钟，之后根据供应商的方案用于2小时的逆转录反应。之后,将逆转录反应和对重链Y,5' -CAC TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCTGG ；V,5/ -GTC CTG TCC CAGGTC AAC TTA CTC GAG TCT GG ；V,5/ -GTC CAGGTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG ；V,5' -GTC CTG TCC CAG GTGCAG CTG CTC GAG TCG GG ；V,5/ -GTC TGT GCC GAG GTG CAGCTG CTCGAG TCT GG ；V,5/ -GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG ；V,5/ -AGGTG CAG CTG CTC GAG TCT GG ；V,5/ -CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCGGG 和 κ-或-链(Vkl,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC CAG ATGACC CAG TCT CC ；Vkla,5/ -GAC ATC GAGCTC ACC CAG TCT CCA ；Vk2a,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG ATG AC(C/T)CAG TCTCC ；Vk3a,5/ -GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA ；Vk3,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAGCTCGTG(A/T)TG AC(A/G)CAG TCT CC;VI，5' -AAT TTT GAG CTC ACT CAGCCC CAC ；V3,5/ -TCTGTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG)的可变区特异的寡核苷酸引物用于100 μ I下列条件的热启动PCR扩增一个循环的95°C变性5分钟、54°C退火50秒和72°C延伸50秒，然后40个循环的92°C变性I分钟、54°C退火50秒和72°C延伸50秒。使用每个恒定区和可变区引物的组合完成PCR反应并合并以构建文库。根据(Kabat等，1987)合成ε链和轻链的寡核苷酸引物的序列。根据Persson等(1991)和Kang等(1991b)合成对重链的可变区和κ -或-链的可变和恒定区特异的寡核苷酸引物。构建IgE组合文库分别对编码IgE Fd和轻链的PCR产物进行乙醇沉淀、凝胶纯化并且用Spe I/XhOI和Sac I/Xba I (Boehringer Mannheim)酶切。经消化的PCR产物经乙醇沉淀并经凝胶纯化。为构建IgE组合文库,首先将轻链连接至pComb3H的Sac I/Xba I位点并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)XL-IBlue以产生3X IO7独立克隆的轻链文库。之后分离包含轻链文库的质粒DNA，用Spe I/XhOI酶切以释放重链填充片段，并经凝胶纯化。将编码IgE Fd的cDNA连接至轻链质粒，产生了 5 X IO7独立初级克隆的轻链文库。
根据Carlos F. Barbas 和 Dennis R. Burton 的 Cold Spring Harbor Course onMonoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries进行用于构建IgE组合文库的分子生物学操作。分离表达具有与哮喘相关的抗原之特异性的Fab片段的噬菌体克隆用展现与哮喘特征谱有相关性的51种变应原制品(O. 2 μ g/孔)分别包被ELISA板(Costar 3690, Cambridge, MA)。孔用含有3% (w/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水封闭。将新鲜制备的噬菌体悬液(大约10个噬斑形成单位)添加至每个孔，然后在室温下孵育2小时。将噬菌体移出，然后将孔用含有O. 05% (v/v)吐温20的Tris缓冲盐水洗涤一次。噬菌体用含有lmg/ml牛血清白蛋白的O. IM甘氨酸-HCI，pH 2. 2洗脱，然后将洗脱液用2M Tris中和。之后，用该洗脱的噬菌体侵染新鲜生长的大肠杆菌XL-lBlue。一份用以确定侵染的大肠杆菌的滴度。将培养物在含有50 μ g/ml氨苄青霉素和10 μ g/ml四环素的SB培养基中生长。通过使用辅助噬菌体VCS M13侵染，产生了丝状噬菌体用于下一轮淘选。淘选重复四次。在随后的淘选期间，对孔进行额外地洗涤，之后通过ELISA分析各个克隆以产生抗原特异性Fab。编码IgE Fd和轻链的cDNA的序列分析测序前，通过ELISA检查克隆的抗原特异性Fab生产以及通过限制性分析检查克隆中编码重链片段和轻链的cDNA的正确插入。使用Qiagen tips (Hilden, Germany)从重组大肠杆菌XL-IBlue中制备质粒DNA。将两条DNA链进行测序。生产具有抗原特异性的可溶性重组Fab片段为了生产可溶性Fab片段，在第五轮淘选之后，从数个独立的克隆分离DNA。将质粒DNA用Spe I和Nhe I消化、回收自I %琼脂糖凝胶、自连并再转化至大肠杆菌XL-lBlue。包含正确再连接的质粒的大肠杆菌用以生产可溶性Fab片段。简言之，将单克隆接种至含有20mM MgCl和50 μ g/ml羧苄青霉素的SB培养基中。将培养物在37°C培养6小时，然后通过添加异丙基-I-硫代-3-D-吡喃半乳糖苷至终浓度为4mM进行诱导。之后将经诱导的大肠杆菌在30°C培养过夜，然后通过在4°C以3000Xg离心10分钟收集细胞。大肠杆菌上清液用于ELISA测定、免疫印迹和亲和纯化抗原特异性Fab0通过对经纯化的抗原的亲和性纯化抗原特异性IgE
根据制造商说明书,将2. 5mg经纯化的抗原偶联至AminoLinkO柱子(Pierce)。将大约200ml包含抗原特异性Fab的大肠杆菌上清液以20，000 X g离心，然后通过折叠滤器(Macherey-NageI, Duren, Germany)过滤以从溶液中移除沉淀。
将上清液于4°C施加于该柱子，之后用磷酸盐缓冲盐水彻底地洗涤柱子直到在洗涤级分中通过光度法在280nm检测不到蛋白质。用IOOmM甘氨酸-HCl，pH 2. 7洗脱结合的抗原特异性Fab，然后用3M Tris, pH 9中和。
权利要求
1.一种鉴定与哮喘、结膜炎或鼻炎相关的抗原的方法，其包括 (a)测定分离自无症状对象组的多个第一样品中针对多种抗原的IgE反应性水平； (b)测定分离自以具有哮喘、结膜炎或鼻炎为特征的对象组的多个第二样品中针对多种抗原的IgE反应性水平； (c)鉴定在对象组之间显示IgE反应性水平显著差异的所述多种抗原的子集，其中针对所述子集的IgE反应性水平与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关。
2.根据权利要求I的方法，其中基本上同时测定每个个体样品中的针对所述多种抗原的反应性水平。
3.根据权利要求2的方法，其中所述第一和/或多个第二样品包含30至800个样品。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述多种抗原包含30至400种抗原。
5.根据权利要求4的方法，其中所述抗原选择为在特定区域中最常见的抗原。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过将所述多种抗原与分离自所述对象组的血清相接触以及使用抗IgE抗体测定与每种抗原结合的IgE的量来确定IgE反应性水平。
7.根据权利要求6的方法，其中所述抗IgE抗体是带标记的抗体。
8.根据权利要求6的方法，其中所述抗IgE抗体是非标记的并且使用带标记的抗体对其进行检测。
9.根据权利要求7或8的方法，其中所述带标记抗体包含荧光标记。
10.根据权利要求9的方法，其中通过荧光检测确定所述与每种抗原结合的IgE的量。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述多种抗原与至少一个具有多个地址的固体支持物结合，其中每个地址具有独特的抗原布置于其上。
12.根据权利要求11的方法，其中所述固体支持物包含多个可分开鉴定的珠子。
13.根据权利要求11的方法，其中所述固体支持物是微阵列。
14.根据权利要求13的方法,其中所述抗原的点样浓度为O.008mg/ml至3mg/ml。
15.一种评估对象是否已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎或者是否具有其发生风险的方法，其包括 (a)测定分离自所述对象的样品中针对生物标志物集合的IgE反应性水平； 其特征在于，所述生物标志物是预先确定与哮喘、结膜炎或鼻炎的临床诊断相关的抗原，并且其中针对生物标志物集合中至少75%的IgE反应性水平高于3. 51IU/ml表明所述对象可能发生或已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎。
16.根据权利要求15的方法，其中所述生物标志物集合包含9至51种抗原。
17.根据权利要求16的方法，其中所述集合选自以下抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907 和 Χ910。
18.根据权利要求15至17的方法，其中通过将所述生物标志物集合与分离自所述对象的血清相接触以及使用抗IgE抗体测定与每种抗原结合的IgE的量来确定IgE反应性水平。
19.根据权利要求18的方法，其中所述抗IgE抗体是带标记的抗体。
20.根据权利要求18的方法，其中所述抗IgE抗体是未标记的并且使用带标记的抗体对其进行检测。
21.根据权利要求19或20的方法，其中所述带标记的抗体包含荧光标记。
22.根据权利要求21的方法，其中通过荧光检测确定所述与每种抗原结合的IgE的量。
23.根据权利要求15至22中任一项的方法，其中所述抗原结合于固体支持物。
24.根据权利要求23中任一项的方法，其中所述固体支持物是微阵列。
25.根据权利要求24的方法,其中所述抗原的点样浓度为O.008mg/ml至3mg/ml。
26.根据权利要求24的方法，其中基本上同时测量与所述生物标志物集合中每种抗原所结合的IgE的量。
27.一种用于确定哮喘、结膜炎或鼻炎的发生风险或对其作出诊断的抗原微阵列，其包含抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18以及任选地一种或更多种选自以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。
28.—种试剂盒，其包含(i)抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15 和 G18 ； (ii)任选地一种或更多种以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 Χ910 ； (iii)抗IgE抗体。
29.根据权利要求28的试剂盒，其在微阵列上包含抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。
30.根据权利要求15至26的方法、根据权利要求27的微阵列或根据权利要求28和29的试剂盒在用于评估对象是否已经发生哮喘、结膜炎或鼻炎或是否具有其发生风险中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于评估对象是否已发生哮喘、结膜炎或鼻炎或者具有其发生风险的方法。本发明还涉及用于此类方法的抗原集合，所述方法包括鉴定与哮喘、结膜炎或鼻炎相关的其他合适抗原。
文档编号G01N33/68GK102893158SQ201180009850
公开日2013年1月23日 申请日期2011年2月16日 优先权日2010年2月16日
发明者安德烈亚·克里桑蒂, 塔尼亚·多托里尼 申请人:微测试矩阵有限公司