专利名称：抗Ku86自身抗体的免疫测定方法、其中使用的试剂盒、及使用其的原发性肝细胞癌的判断方法
抗Ku86自身抗体的免疫测定方法、其中使用的试剂盒、及使用其的原发性肝细胞癌的判断方法
技术领域：
本发明涉及用于测定抗Ku86自身抗体的免疫测定方法及免疫测定用试剂盒。抗 Ku86自身抗体特别是在原发性肝细胞癌患者的血中特异性地出现，从而，本发明不单单仅是提供测定自身抗体的方法，也可在原发性肝细胞癌的判断中利用。
背景技术：
Ku86是与双链DNA切断相关的蛋白质，与Ku70 —起，形成被称为Ku的异源二聚体，该Ku异源二聚体与DNA依赖性蛋白激酶等共同可修复双链DNA切断(非专利文献I)。另一方面，由向琼脂糖2维电泳适用2D-DIGE法(二维荧光示差凝胶电泳， two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis)的改良琼月旨糖2维电泳法(非专利文献2)，通过蛋白质组解析进行原发性肝细胞癌的癌部及周边的非癌部组织的表达蛋白的量的比较，得知被称为Ku86的蛋白质在癌部多表达(非专利文献3)。现有技术文献非专利文献非专利文献I: Li et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 9, No. 2,832-837, 2002非专利文献2:TakeshiTomonaga et al. ,Clin. Cancer Res. 2004 ;10:2007_2014非专利文献3:Masanori Seimiya et al. , Hepatology 2008 ；48:519-30
发明内容发明要解决的技术课题本发明人发现，通过测定在疑似患癌的患者或癌患者来源的组织待测样品中存在的Ku86的表达水平，可进行它们的组织的癌部与非癌部的判别。本发明人再对血液待测样品中的Ku86的存在进彳丁持续研究时，令人惊讶地发现，有在血液待测样品中存在抗Ku86自身抗体的情况，在原发性肝细胞癌患者的情况中，其自身抗体的量特异性地多。从而，本发明的目的是提供，可应用于原发性肝细胞癌判断的，抗Ku86自身抗体的测定方法。解决课题的技术方案本发明人发现，通过使待测样品中的抗Ku86自身抗体与作为试剂的Ku86抗原反应，并用标记抗人免疫球蛋白抗体测定生成的自身抗体和Ku86抗原的免疫复合物，可测定其自身抗体，由此可使癌判断成为可能，从而完成本发明。从而，本发明涉及抗Ku86自身抗体的免疫测定方法，其特征在于，通过使待测样品中的抗Ku86自身抗体与作为试剂的Ku86抗原反应，并测定生成的抗Ku86自身抗体和 Ku86抗原的免疫复合物来测定其自身抗体。再者，本发明涉及抗Ku86自身抗体免疫测定用试剂盒，其特征在于，作为试剂成分含至少Ku86抗原。再者，本发明涉及原发性肝细胞癌判断方法，其通过测定抗Ku86自身抗体，判断是原发性肝细胞癌。再者，本发明涉及原发性肝细胞癌判断用标记物，其含抗Ku86自身抗体。发明效果在本发明中，可简单地测定待测样品中，特别是，血液来源待测样品中存在的抗 Ku86自身抗体，对于原发性肝细胞癌患者的判断有效。
图I是使用致敏Ku86抗原的ELISA板而测定健康人待测样品、C型肝炎患者血清待测样品、C型肝硬变患者血清待测样品、初发原发性肝细胞癌(以下，也称之为初发 HCC)患者血清待测样品及再发原发性肝细胞癌(以下，也称之为再发HCC)患者血清待测样品中抗Ku86自身抗体的结果。再有，图中，横轴示疾病名，纵轴示对波长450nm光的吸光度。另外，星号示在进行与健康人血清待测样品组、C型肝炎患者待测样品组或C型肝硬变患者血清待测样品组的比较的全部的情况中，存在通过Wilcoxon的2标本检验的显著差异 (P < O. 0001)的血清待测样品组。图2是使用致敏Ku86抗原的ELISA板而测定健康人血清待测样品、初发HCC 患者血清待测样品、大肠癌患者血清待测样品、胃癌患者血清待测样品、胰腺癌患者血清待测样品、乳腺癌患者血清待测样品、肺癌患者血清待测样品及食道癌患者血清待测样品中 Ku86和其自身抗体的复合物的结果。再有，图中，横轴示疾病名，纵轴示对波长450nm光的吸光度。另外，星号示在进行与健康人血清待测样品组、大肠癌患者血清待测样品组、胃癌患者血清待测样品组、胰腺癌患者血清待测样品组、乳腺癌患者血清待测样品组、肺癌患者血清待测样品组或食道癌患者血清待测样品组的比较的全部的情况中，存在通过Wilcoxon 的2标本检验的显著差异(P < O. 0001)的血清待测样品组。实施方式本发明的抗Ku86自身抗体的免疫测定方法的特征在于，通过使待测样品中的抗 Ku86自身抗体与作为试剂的Ku86抗原反应，并测定生成的抗Ku86自身抗体和Ku86抗原的免疫复合物来测定抗Ku86自身抗体。在本发明中，作为待测样品，以活体来源的样品为适宜，特别是，以血液来源待测样品为适宜，作 为血液来源待测样品，可例示全血、血浆、血清。本发明的免疫测定方法的测定对象是抗Ku86自身抗体。如上所述，Ku86是与双链DNA切断相关的蛋白质，其正式名是ATP-依赖性DNA解链酶2亚基2 (ATP-dependent DNA helicase 2subunit 2)，作为别名也称之为XRCC5。另外，Ku86是在美国的国立生物工程学信息中心(NCBI)的登录号(accession No)是gi_10863945的，由732个的氨基酸构成的82kDa的蛋白质。若实施本发明的免疫测定方法，则使用作为试剂的Ku86抗原。作为作为试剂的 Ku86抗原，只要是可与抗Ku86自身抗体发生抗原抗体反应的抗原，则不特别限定，可例示 Ku86全长蛋白质、作为Ku86全长蛋白质的变体的,有可和与该蛋白质同样的抗Ku86自身抗体发生抗原抗体反应的功能，并且与该氨基酸序列有90%以上的相同性的蛋白质或有在 Ku86全长蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代或附加I个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质的变体、作为Ku86的片段肽的可与Ku86的自身抗体发生抗原抗体反应的肽。Ku86全长蛋白质可从Abnova公司得到,但由于全氨基酸序列是如上所述已知,Ku86全长蛋白质或其变体也可根据基因重组技术合成。在本发明中，在使用Ku86的片段肽之时，可将Ku86 全长蛋白质通过酶分解等切成各种的肽片段而制成，使用市售的自动肽合成装置也可容易地制成。另外，也可将目标的Ku86的片段肽通过基因重组技术制成。在本发明中，可使如此得到的Ku86全长蛋白质的变体或片段肽与抗Ku86自身抗体进行反应而选择发生抗原抗体反应的当作作为试剂的Ku86抗原而使用。在本发明中，除了上述的各肽片段的全体之外，也可使用其一部分，也可使用它们的混合物，这些也包括在作为试剂的Ku86抗原中。在本发明中，免疫测定抗Ku86自身抗体时，例如，将作为试剂的Ku86抗原固相化到微板或其他载体，向得到的水不溶化载体适用预计含有该自身抗体的待测样品而使与作为试剂的Ku86抗原进行抗原抗体反应而结合，接下来，适用用酶等标记的抗人免疫球蛋白抗体而反应结合到该自身抗体。水不溶化载体的制备可使用将蛋白质结合到固相面的已知的方法容易地进行。例如，作为固相化载体，通常用到珠、微板、管等。作为向这些固相面结合作为试剂的Ku86抗原的方法，可适宜利用物理吸附、化学结合等已知的固定化技术。 使如此固相化的Ku86抗原和含有该自身抗体的待测样品接触，则仅抗Ku86自身抗体与作为试剂的Ku86抗原特异性地结合。从而，当加标记的抗人免疫球蛋白抗体时，由于抗人免疫球蛋白抗体与抗Ku86自身抗体结合，所以可利用此标记进行测定。作为标记，可适宜使用酶、放射性同位素、FITC、若丹明、亮氨醇之类的荧光物质、 化学发光物质等常用的标记。使用这些各种标记，可由酶联免疫测定方法、放射免疫测定方法、荧光免疫测定方法、化学发光免疫测定方法等的方法，测定抗Ku86自身抗体。作为酶联免疫测定方法中使用的标记酶，可适宜使用辣根过氧化物酶、牛小肠碱性磷酸酶、半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等的酶联免疫分析法(EIA)中常用的酶， 可适宜使用适合于这些的酶的在EIA中常用的发色底物。作为发色底物，例如在HRP的情况中，使用 3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺(TMBZ)、TMBZ · HC1、TMBZ · PS、ABTS、ο-苯二胺、 P-羟苯基醋酸等，在碱性磷酸酶的情况中，使用P-硝基苯基磷酸酯、4-甲基伞形花酰磷酸酯等，在β -半乳糖苷酶的情况中，使用ο-硝基苯基-β -D-批喃半乳糖、4-甲基伞形花酰 β-D-吡喃半乳糖等。在放射免疫测定方法、荧光免疫测定方法、化学发光免疫测定方法等中，也可采用通常使用的公知的标记。在本发明的免疫测定方法中，除了上述的方法之外，通过蛋白印迹法、免疫组织染色法、乳胶免疫比浊法及免疫沉降法等的免疫测定法、液相层析法，也可测定抗Ku86自身抗体。本发明的免疫测定方法作为试剂成分含至少Ku86抗原，可由抗Ku86自身抗体免疫测定用试剂盒实施。Ku86抗原，可例如，以结合于微板等的水不溶性载体的形态作为试剂盒的试剂成分。作为试剂盒的其他试剂成分，可举出抗人免疫球蛋白抗体，此抗人免疫球蛋白抗体，根据采用的酶联免疫测定方法、放射免疫测定方法、荧光免疫测定方法、化学发光免疫测定方法等的测定方法，使用经酶、放射性同位元素、荧光物质、化学发光物质等的标记物标记的。作为其他试剂成分，也可适宜加表面活性剂、缓冲剂。
在本发明中，通过测定抗Ku86自身抗体，可进行原发性肝细胞癌的判断。通过本发明的测定方法测定抗Ku86自身抗体对于患者的癌疾病的判别有效。本发明的测定方法的利用对于例如，健康人，和初发原发性肝细胞癌患者或再发原发性肝细胞癌患者的判别有效。另外，通过利用本发明的测定方法，使大肠癌患者、胃癌患者、胰腺癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者或食道癌患者等的癌患者，和初发原发性肝细胞癌患者或再发原发性肝细胞癌患者的判别成可能。再者，通过利用本发明的测定方法，使C型肝炎患者或C型肝硬变等的肝脏疾病患者，和初发原发性肝细胞癌患者或再发原发性肝细胞癌患者等的原发性肝细胞患者的判别成可能。从以上的说明可知，抗Ku86自身抗体是成为原发性肝细胞癌判断用标记物的物质，可作为原发性肝细胞癌的判断用标记物使用。另外，抗Ku86自身抗体可作为使用全血、 血浆、血清等的血液来源待测样品判断原发性肝细胞癌的标记物而适宜。
实施例以下，通过实施例再详细地说明本发明，本发明不受这些实施例的任何限制。实施例I:抗Ku86自身抗体的测定对从健康人、C型肝炎患者、C型肝硬变患者、初发原发性肝细胞癌患者、再发原发性肝细胞癌患者 、大肠癌患者、胃癌患者、胰腺癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者及食道癌患者采集的血清待测样品，用接下来具体说明的酶联免疫测定法(ELISA法)测定抗Ku86自身抗体。I.方法(I) Ku86 的 ELISA 板的制成作为水不溶性载体使用ELISA板(Nunc公司制，Maxisorp),向其作为Ku86将 XRCC5全长体(重组体蛋白质GST标签附带Abnova公司制5 μ g/mL, 100 μ L/孔)于4°C静置I晚而致敏，其后，用含O. 05%吐温20的PBS (200 μ L/孔)进行3次清洗。接下来，用含 I. 5%BSA、10%蔗糖的PBS (200 μ L/孔)包被I晚而制成Ku86的ELISA板。(2)抗Ku86自身抗体的测定将各样品血清用PBS稀释100倍，将其加到各100 μ L/孔Ku86的ELISA板，于37°C 静置I小时，其后，将该板用含O. 05%吐温20的PBS (200 μ L/孔)清洗3次。向该板也加各100 μ L/孔HRP标记免疫球蛋白(将HRP标记的抗-人IgG (Zymed公司制)用含O. 05% 吐温20的PBS稀释4000倍的)，于37°C静置30分钟。接下来，将该板用含O. 05%吐温20 的PBS (200 μ L/孔)清洗3次之后，加各100 μ L/孔ΤΜΒΖ，于室温静置10分钟之后，作为反应停止剂加100 μ L/孔的IN硫酸。吸光度是使用酶标仪(BioRad公司制)，在波长450nm 处进行测定。再有，待测样品使用健康人48例、C型肝炎患者16例、C型肝硬变患者21例、初发原发性肝细胞癌患者待测样品35症例、再发原发性肝细胞癌患者52例、大肠癌患者待测样品16例、胃癌患者16例、胰腺癌患者16例、乳腺癌患者20例、肺癌患者10例、食道癌患者 18例。2.结果将使用Ku86的ELISA板测定抗Ku86自身抗体的结果示于图I。显著差异检验使用KaleidaGraph4. O,用Wilcoxon的2标本检验进行统计处理。如图I所示，与健康人组、C型肝炎组及C型肝硬变组比较，初发原发性肝细胞癌患者待测样品组及再发原发性肝细胞癌患者待测样品组的抗Ku86自身抗体量确认明显的显著差异。从而示，血中的抗Ku86自身抗体的免疫测定在肝脏疾病之中，对于原发性肝细胞癌的判别有效。如图2所示，与健康人组或各种的癌患者待测样品组、S卩，大肠癌患者待测样品组、胃癌患者待测样品组、胰腺癌患者待测样品组、乳腺癌患者待测样品组、肺癌患者待测样品组及食道癌患者待测样品组比较，原发性肝细胞患者待测样品组的抗Ku86自身抗体量确认显著差异。从而示，血中的抗Ku86自身抗体的免疫测定对于健康人和原发性肝细胞癌患者的判别有效。再者示，血中的抗Ku86自身抗体的免疫测定对于大肠癌患者、胃癌患者、胰腺癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者或食道癌患者等的癌患者和原发性肝细胞癌患者的判别也有效。工业实用性如以上详细地说明，通过使血液来源待测样品等的待测样品中的抗Ku86自身抗体与作为试剂的Ku86抗原进行反应，并测定生成的自身抗体和Ku86抗原的免疫复合物，可测定其自身抗体，由此，可判断原发性肝细胞癌。
权利要求
1.抗Ku86自身抗体的免疫测定方法，其特征在于，通过使待测样品中的抗Ku86自身抗体与作为试剂的Ku86抗原反应，并测定生成的抗Ku86自身抗体和Ku86抗原的免疫复合物来测定其自身抗体。
2.权利要求I所述的免疫测定方法，其中所述待测样品是血液来源待测样品。
3.权利要求I或2所述的免疫测定方法，其中所述免疫测定方法是酶联免疫测定方法、荧光免疫测定方法、化学发光免疫测定方法、或者放射免疫测定方法。
4.权利要求I 3之任一项所述的免疫测定方法，其用于癌判断。
5.权利要求4所述的免疫测定方法，其中所述癌是原发性肝细胞癌。
6.抗Ku86自身抗体免疫测定用试剂盒，其特征在于，作为试剂成分含至少Ku86抗原。
7.权利要求6所述的试剂盒，其中所述Ku86抗原结合于水不溶性载体。
8.权利要求7所述的试剂盒，其还含抗人免疫球蛋白抗体。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中所述抗人免疫球蛋白抗体经标记物标记。
10.原发性肝细胞癌判断方法，其通过测定抗Ku86自身抗体，判断是原发性肝细胞癌。
11.权利要求10所述的原发性肝细胞癌判断方法，其测定血液来源待测样品中的自身抗体。
12.原发性肝细胞癌判断用标记物，其含抗Ku86自身抗体。
13.权利要求12所述的原发性肝细胞癌判断用标记物，其用于使用血液来源待测样品来判断。
全文摘要
通过使待测样品中的抗Ku86自身抗体与作为试剂的Ku86抗原反应，并用标记抗人免疫球蛋白抗体测定生成的自身抗体和Ku86抗原的免疫复合物，可测定其自身抗体，由此可判断原发性肝细胞癌。
文档编号G01N33/534GK102713624SQ20118000701
公开日2012年10月3日 申请日期2011年1月18日 优先权日2010年1月25日
发明者小岛良, 曾川一幸, 清宫正德, 野村文夫, 野田健太 申请人:日东纺绩株式会社