专利名称：一种苯二氮卓类药物检测试剂盒及其制备的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及ー种免疫胶体金检测试剂盒，尤其涉及一种苯ニ氮卓类药物相关的免疫胶体金快速检测试剂盒及其制备。
背景技术：
苯ニ氮卓类药物是临床广泛使用的ー类药物，多为1，4_苯并ニ氮的衍生物，主要包括地西洋(安定)、氟西泮(氟安定)、氯氮、奥沙西泮和三唑仑等，具有鎮静催眠、抗焦虑、抗惊厥、肌肉松弛等作用。然而，大剂量使用苯ニ氮卓类药物会致共济失调，过量急性中毒可致昏迷和呼吸抑制，久服会产生身体和精神依赖性，产生依赖性的风险随剂量的増加及治疗期的延长而増加。一旦出现身体依赖性，立即停药会出现戒断症状，包括头痛、肌肉痛、极度焦虑紧张、烦躁、兴奋和谵妄。严重时会出现失眠、意识障碍、失去理智、听觉过敏、 麻木、四肢麻刺感，出现幻觉和癫痫发作。且苯ニ氮卓类药物与酒精和其他鎮静催眠药合用后可导致中毒死亡。鉴于其严重的危害性，苯ニ氮卓类药物已被国家列入精神药品进行管理。苯ニ氮卓类药物最普遍的使用方法为ロ服形式，其代谢速度快，绝大部分在人体内转变为代谢物随尿液排出体外。然而这些代谢物消除缓慢，清除时间很长，数月或数年使用此药物的个体，即使在停止用药后的几周甚至几个月里都能在尿液中持续检测到苯ニ氮卓。目前对苯ニ氮卓类的检测主要使用薄层色谱扫描、气相和液相色谱分析，这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要进ー步的提纯处理才能进行。对于苯ニ氮卓类抗体的研究国外在二十世纪八、九十年代有少数的报道，由于苯 ニ氮卓类药物属于小分子物质，要想得到相应的抗体，首先需将其与载体物质相连接，具有免疫原性，才能够利用免疫学技术得到相应的抗体。目前，苯ニ氮卓类抗体在免疫学方面的应用主要通过酶放大酶免疫实验、荧光偏振免疫測定、放射免疫法等方法。虽然这些检测方法灵敏，但也因所使用的仪器和设备非常昂贵，不易于基层工作的展开。免疫胶体金技术这种检测方法，可直接对血液、尿液、体腔液中的苯ニ氮卓类药物进行检测，不需要对样品进行处理，且具有快速、易于使用、便于指导临床和侦察的特点。国内现有的苯ニ氮卓类药物检测方法的相关专利有专利号200920165271. 7，其提供了ー种定量快速检测苯ニ氮卓类药物的上转磷光检测试剂条，与胶体金方法相比耗时长。
发明内容
本发明的目的是克服现有技木，如酶放大酶免疫实验、荧光偏振免疫測定、放射免疫法等測定方法检测苯ニ氮卓类药物速度慢、操作复杂等缺点，提供ー种快速、方便、灵敏的不依赖专门设备的苯ニ氮卓类药物检测试剂盒及其应用。本发明一方面提供了ー种苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒，它包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金紙片、免疫硝酸纤维素膜和吸水紙，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗苯ニ氮卓单克隆抗体的玻璃纤维垫片，所述免疫硝酸纤维素膜为设有检测线(T线)和质控线(C线)的硝酸纤维素膜，所述检测线上包被有苯ニ氮卓-牛血清白蛋白复合物，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。进ー步的，所述胶体金标记的抗苯ニ氮卓单克隆抗体中，胶体金的粒径为 39-42nm,纳米金与抗苯ニ氮卓单克隆抗体的标记比例为2分子纳米金标记1分子抗苯ニ氮
卓单抗。所述苯ニ氮卓类药物为1，4-苯并ニ氮的衍生物，包括但不限于地西洋(安定)、氟西洋(氟安定)、奥沙西泮、阿普唑仑、氯硝西洋、服利宁、氯甲西洋、利眠宁、羟基三唑仑和普拉西洋。上述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的工作原理，既是利用高度特异的抗体-抗原特异结合反应及免疫膜层析技木，通过免疫竞争抑制法来定性检测人尿液中出现的苯ニ氮卓类药物。检测吋，当尿液从试剂盒加样孔加入，滲透到试剂条的加样垫上，如果尿液中含有苯ニ氮卓类，它们首先与玻璃纤维片上胶体金标记的抗苯ニ氮卓单克隆抗体结合形成苯 ニ氮卓类-抗苯ニ氮卓单克隆抗体-胶体金复合物，在毛细作用下复合物层析至T线区，当苯ニ氮卓类浓度达到产品设计的阈值浓度以上吋，它们将占据抗苯ニ氮卓单克隆抗体上全部的抗原结合位点，阻止了抗苯ニ氮卓单克隆抗体-胶体金和检测区的苯ニ氮卓-载体复合物的结合，检测区不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，为阳性結果。如果尿液中没有苯ニ氮卓类或苯ニ氮卓类的浓度低于阈值浓度，则抗苯ニ氮卓单克隆抗体-胶体金随同尿液运行至检测区，检测区捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，为阴性結果。在试纸条上的质控线(C线)包被有羊抗鼠IgG，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控线的出现与苯ニ氮卓类或其代谢物的存在无关。质控线色带的出现表明①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。本发明的第二方面还提供了上述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；2)采用步骤1制得的胶体金标记抗苯ニ氮卓单克隆抗体获得免疫胶体金；3)采用喷金缓冲液稀释步骤幻的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金紙片；4)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分別喷点苯ニ氮卓-牛血清白蛋白复合物及羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、步骤3制备的免疫胶体金紙片、步骤4制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。步骤1)所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为1 (8-9)，超声振荡2-3 分钟后冷却至室温，既制得14 16nm粒径的胶体金原溶液。b)第二次还原氯金酸溶液
将第一歩制得的胶体金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比1 (1. 9-2. 0)加入4. 0-4. 5 °C的0. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0-4. 5°C的抗坏血酸与PVP (聚乙烯醇吡咯烷酮) 的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为05- ) 1，加入的 PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为1 O. 0-2. 1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液。两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L。步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴ム。步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的浓度为 0. 137-0. 139g/L。步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。步骤2、所述胶体金标记抗苯ニ氮卓单克隆抗体的主要改进在于将抗苯ニ氮卓单克隆抗体与胶体金溶液分別采用磷酸盐缓冲液稀释后，按照1分子抗苯ニ氮卓单克隆抗体标记2分子纳米金的比例进行混合反应制得胶体金标记的抗苯ニ氮卓单克隆抗体。这样既减少单克隆抗体用量，节约生产成本，又能提高检测灵敏度。具体的，步骤2、所述胶体金标记抗苯ニ氮卓单克隆抗体方法包括下列步骤A.将抗苯ニ氮卓单克隆抗体用0. IM pH7. 6的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1. Omg/ ml的抗体稀释溶液；B.将胶体金溶液与0. IM pH7. 6磷酸盐缓冲液以体积比10 1混合，搅拌并将稀释的抗苯ニ氮卓单克隆抗体溶液加入其中，胶体金溶液与稀释的苯ニ氮卓单克隆抗体溶液体积比为125 1，搅拌反应；C.反应结束后，在上述反应液中快速加入1/50倍反应液总体积的10wt%的牛血清白蛋白溶液，室温搅拌反应；将制备好的免疫胶体金离心收集沉淀，用含有0. Iwt % BSA 的硼酸缓冲液复溶，制得的纯化免疫胶体金为1分子抗苯ニ氮卓单克隆抗体标记了 2分子纳米金。具体的，步骤幻免疫胶体金紙片的制备包括下列步骤I.用喷金缓冲液稀释步骤2、的免疫胶体金，获得OD54tl值为1. 2 2. 0的免疫胶体金溶液；II.用预处理液浸泡玻璃纤维紙，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维紙， 干燥，制得免疫胶体金紙片。较佳的，步骤I所述喷金缓冲液的组分为8 12v% 1. OM Tris液、0. 2 0. 4w/ 乂％聚乙ニ醇20000、0. 15 0. 25w/v%牛血清白蛋白，0. 1 0. 3w/v%脱脂牛奶、0. 25 0. 35W/v%酪蛋白，和0. 02 0. 08w/V%叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 5士0. 05，余量为水。最优的，步骤I中喷金缓冲液配方为10v% 1.0M 1Tris液、0. 3w/v %聚乙ニ醇 20000,0. 2w/v%牛血清白蛋白，0. 2w/v%脱脂牛奶、0. 3W/V%酪蛋白，和0. 05w/v%叠氮化钠，用盐酸调节PH至8.5士0. 05，余量为水。较佳的，步骤II所述预处理液的组分包括0. 5 0. 8v% Tween-20，12 18w/v% 蔗糖，溶剂为水。最优的，步骤II中预处理液配方为0. 7% Tween-20，16w/v%蔗糖，余量为水。较佳的，步骤II中，用预处理液浸泡玻璃纤维纸吋，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸^lmmX 220mm ；用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸吋，每^lmmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金紙片。本发明中，为重量百分比，指体积百分比；指重量体积百分比，Iw/ 即为IOOml溶液中含lg。苯ニ氮卓-牛血清白蛋白可市购或采用常规方法将苯ニ氮卓类化合物与牛血清白蛋白复合制得。本发明试剂盒的使用方法为将试剂盒放置在水平台面上。用加样吸管吸取尿样，然后滴3滴(约120ul)尿样到试剂盒的加样孔中。每检测 ー份不同的样品注意要使用不同的吸管。观察结果在滴加样品后3-8分钟判读結果。检测结果的判断方法阴性在结果观察窗口内出现两条色帯。即检测线(T线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条。表示样品中无苯ニ氮卓类存在。阳性只在结果观察窗ロ的质控线(C线)位置出现一条红色线条，检测线(T线) 未出现任何线条，表示样品中有苯ニ氮卓类存在。无效质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。 C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。本发明的有益效果在干(1)本发明采用的两步还原法，使得到的胶体金分子呈大小均一的约40nm球形颗粒，由于胶体金颗粒大小适中、整体均一，使其与单克隆抗体的结合效率更高、效果更稳定， 这保证了标记步骤的可控性、降低了试剂盒的批间差异。( 本发明在制备苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒时，采用了 2分子纳米金标记1分子抗苯ニ氮卓单抗的免疫胶体金，实验证实将之用于苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒，比之已公开的技术，虽然减少了单克隆抗体用量，但由于1分子抗苯ニ氮卓单抗标记了更少的纳米金，使得显色反应更为灵敏，从而不仅有效地节约了生产成本，而且还获得了更为灵敏的苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒；(3)免疫胶体金紙片制备步骤中，通过采用合理配方的预处理液对玻璃纤维膜进行预处理并选配合适的喷金缓冲液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效减慢检测时免疫胶体金的释放层折，有利于抗原抗体充分反应结合，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。(4)本发明制备的苯ニ氮卓检测试剂盒具有批间差异小，灵敏度高；特异性强，不影响检测结果；临床符合率高；操作简单；检测结果肉眼判断，无需特殊仪器和专业技术人员；检测快速，5-8分钟显示检测结果；而且检测费用低廉，存储和运输方便等优点。
图1 胶体金透射电镜2 苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒试剂条示意图1 滤样纸2 免疫胶体金纸3 免疫硝酸纤维素膜4 吸水纸5 检测线(T线)6 质控线(C线)图3 苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒示意图1 加样孔2 判读框
具体实施例方式以下结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例1苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备试剂来源抗苯ニ氮卓单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体、苯ニ氮卓-牛血清白蛋白复合物 (BZO-BSA)购自美国美迪生物技术有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)硝酸纤维素薄膜、玻璃纤维纸购自德国赛多利斯公司(SART0RIUS)试剂配制0. IM pH7. 6 的磷酸盐缓冲液分别称取 10. 2gNa2HP04, 3. 4gNaH2P04,加 900ml 纯化水溶解，用盐酸调节溶液PH值为7. 6，用纯化水定容至1000ml。10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液称取IOOgBSA用纯化水溶解并定容至1000ml。0. 1 % BSA的硼酸缓冲液称取硼砂9. 535g溶解于900ml纯化水中，用盐酸调pH 值至8. 6士0.05，定容至1000ml，即得0. IM硼酸盐缓冲液。称取IgBSA用0. IM硼酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，即为0. BSA的硼酸缓冲液。制备步骤1、胶体金的制备a)第一次还原氯金酸溶液将6ml 0. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml双蒸水中，加热煮沸30分钟，之后缓慢搅动并准确加入50ml 0.016mol/L柠檬酸三钠水溶液。 25KHZ超声振荡2分钟后冷却至室温，既制得约15nm粒径的胶体金原溶液。b)第二次还原氯金酸溶液取第一歩制得的胶体金原核溶液沈ml，并放置干4°C 水浴锅中稳定温度，随后加入50ml预冷为4. O0C的0. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即缓慢滴加250ml预冷为4. O0C的含0. 018mol/L的抗坏血酸与0. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度为1-2滴/s，搅拌反应1小吋，溶液呈透明的酒红色，既制得40nm粒径的胶体金溶液。制得的胶体金采用紫外分光光度计扫描有単一吸收峰，峰形窄，Xmax约为 525nm，采用透射电镜观察，如图1所示，粒径范围约为40nm，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。2、免疫胶体金制备2. 1将抗苯ニ氮卓单克隆抗体用0. IM pH7. 6的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为 1. Omg/ml的抗体溶液。
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2. 2取IOOOml的胶体金溶液，往里加入1/10倍胶体金体积的0. IM pH7. 6磷酸盐缓冲液混合3分钟。在快速搅拌下，再缓缓将稀释的抗苯ニ氮卓单克隆抗体溶液8ml加入其中。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。2. 3反应结束后，在上述反应液中快速加入20ml的10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。2. 4将制备好的免疫胶体金8000转/分钟离心20分钟，保留沉淀，并收集上清 12500转/分钟离心30分钟，弃上清。收集两次离心沉淀用含有0. 1% BSA的硼酸缓冲液复溶到OD54。在13-15之间。2. 5制得的纯化免疫胶体金为1分子抗苯ニ氮卓单克隆抗体标记了 2分子纳米金。3、免疫胶体金纸制备分别采用方法1、2、3制备。方法1 3. 1预处理液的制备准确称取7ml Tween-20，160g蔗糖，加纯化水定容至 1000ml。3. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入IOOml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取3. Og聚乙ニ醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脱脂牛奶，3. Og酪蛋白溶液和0. 5g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加纯化水至总体积1000ml。3. 3用喷金缓冲液稀释步骤2制备的免疫胶体金，至溶液OD540值为1. 5，获得免疫胶体金溶液。3. 4用预处理液浸泡玻璃纤维紙，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 ^lmmX220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金紙片。方法2:3. 1预处理液的制备准确称取5ml Tween-20，180g蔗糖，加纯化水定容至 1000ml。3. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入120ml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取2. Og聚乙ニ醇20000、1. 5g牛血清白蛋白，3. Og脱脂牛奶，2. 5g酪蛋白溶液和0. Sg叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加纯化水至总体积1000ml。3. 3用喷金缓冲液稀释步骤幻的免疫胶体金，至溶液OD54tl值为1.5，获得免疫胶体金溶液。3. 4用预处理液浸泡玻璃纤维紙，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 ^lmmX220mm，浸泡25min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金紙片。方法3 3. 1预处理液的制备准确称取8ml Tween-20,120g蔗糖，加纯化水定容至 1000ml。3. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入80ml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取4. Og聚乙ニ醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，1. Og脱脂牛奶，3. 5g酪蛋白溶液和0. 2g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加纯化水至总体积1000ml。3. 3用喷金缓冲液稀释步骤幻的免疫胶体金，至溶液OD54tl值为1.5，获得免疫胶体金溶液。3. 4用预处理液浸泡玻璃纤维紙，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 ^lmmX220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金紙片。4、免疫硝酸纤维素膜的制备4. 1将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0. 5mg/ml，制得质控线(C线)溶液。4. 2将苯ニ氮卓-BSA复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0. lmg/ml制得检测线(T线)溶液。4. 3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每Im长硝酸纤维素膜各包被有Iml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为5. 0mm。5、将滤样纸、免疫胶体金紙片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条(如图2所示)。6、将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒(如图3所示)。实施例2苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的灵敏度实验检测方法1、取实施例1制得的苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。2、用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每检测ー份不同的样品使用不同的吸管。3、观察结果在滴加样品后3-8分钟判读結果。检测样品配置奥沙西泮浓度为150ng/ml、300ng/ml、600ng/ml的质控參考品作为样品，每种试剂盒每个浓度重复6次。灵敏度试验结果表ng/ml
奥沙西泮浓度试剂盒检测结果150阴性300阳性600阳性苯ニ氮卓类药物的检测灵敏度结果ng/ml
权利要求
1.ー种苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金紙片、免疫硝酸纤维素膜和吸水紙，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗苯ニ氮卓单克隆抗体的玻璃纤维垫片，所述免疫硝酸纤维素膜为设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线上包被有苯ニ氮卓-牛血清白蛋白复合物，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。
2.如权利要求1所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒，其特征在干，所述胶体金标记的抗苯ニ氮卓单克隆抗体中，胶体金的粒径为39-42nm，纳米金与抗苯ニ氮卓单克隆抗体的标记比例为2分子纳米金标记1分子抗苯ニ氮卓单克隆抗体。
3.如权利要求1或2所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；2)采用步骤1制得的胶体金标记抗苯ニ氮卓单克隆抗体获得免疫胶体金；3)采用喷金缓冲液稀释步骤幻的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金紙片；4)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分別喷点苯ニ氮卓-牛血清白蛋白复合物及羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、步骤幻制备的免疫胶体金紙片、步骤4)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂品.ο
4.如权利要求3所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在干，步骤1) 所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为1 (8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，既制得14 16nm粒径的胶体金原溶液；b)第二次还原氯金酸溶液将a)制得的胶体金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与 HAuCl4 水溶液体积比 1 (1. 9-2. 0)加入 4. 0-4. 5°C 的 0. 003-0. 004mol/L HAuCl4 水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0-4. 5°C的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为05- ) 1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为1 0.0-2.1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液；两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。
5.如权利要求4所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在干，步骤a) 中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L ；超声震荡的频率为20-30KHZ。
6.如权利要求4所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在干，步骤b) 中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为0. 017-0. 019mol/L, PVP 的浓度为 0. 137-0. 139g/L。
7.如权利要求3所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在干，步骤2) 中纳米金与抗苯ニ氮卓单克隆抗体的标记比例为2分子纳米金标记1分子抗苯ニ氮卓单克隆抗体。
8.如权利要求3所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在干，步骤3) 免疫胶体金紙片的制备包括下列步骤I.用喷金缓冲液稀释步骤2、的免疫胶体金，获得OD54tl值为1.2 2. 0的免疫胶体金溶液；II.用预处理液浸泡玻璃纤维紙，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维紙，干燥， 制得免疫胶体金紙片。
9.如权利要求8所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在干，步骤I所述喷金缓冲液的组分为8 12v% 1. OM Tris液、0. 2 0. 4w/v%聚乙ニ醇20000、0. 15 0. 25w/v%牛血清白蛋白，0. 1 0. 3w/v%脱脂牛奶、0. 25 0. 35 八％酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v %叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5 士 0.05，余量为水。
10.如权利要求8所述苯ニ氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法，其特征在干，步骤II 所述预处理液的组分包括0. 5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v%蔗糖，溶剂为水。
全文摘要
本发明公开了一种苯二氮卓类药物的检测试剂盒及其制备。本发明的检测试剂盒包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体的玻璃纤维垫片，所述免疫硝酸纤维素膜为设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线上包被有苯二氮卓-牛血清白蛋白复合物，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。本发明还进一步提供了上述苯二氮卓类药物的检测试剂盒的制备方法。采用本发明，可减少单克隆抗体用量，节约生产成本。
文档编号G01N33/558GK102565409SQ20111045771
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者张国华 申请人:上海凯创生物技术有限公司