专利名称：一种凝血酶原时间测定试剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及临床血液诊断领域中的凝血酶原时间试验，具体涉及ー种凝血酶原时间测定试剂的制备方法。
背景技术：
临床上进行凝血试验的目的有很多，如确定接受外科手术的病人的出血倾向，以及对接受抗凝血治疗的病人进行监测以防止血液凝集等。“凝血酶原时间(PT)”试验即是凝血试验中的ー种。PT试验是通过在需要进行PT试验的血样中加入凝血活酶，从而激活外源性凝血途径而进行的。凝血活酶也称作组织因子(TF)，是ー种膜相关蛋白，它与因子V II a 形成V II a/TF复合物后，会激活一系列凝血途径中所涉及的特异性酶，导致凝血酶和纤维蛋白的形成，血小板的激活，最终形成血块。常规PT试验是在体外及可控条件下，利用上述一系列酶反应，对病人凝血系统的障碍或缺陷进行诊断，血块形成所用的时间即为凝血酶原时间或PT值。通常所称的凝血酶原时间测定试剂，即PT试剂，其主要成分就是凝血活酶(即组织因子)。传统上，PT试剂常用从兔脑、羊脑或牛脑中初歩分离纯化的脑组织制成。脑中的组织因子能够和磷脂协调作用完成血液外源性凝固系统的启动。但是，用初歩分离纯化的脑组织制备的PT试剂具有灵敏度差、有可能存在ー些抑制剂及制品稳定性差的缺点。国外也有报道应用基因工程制备的组织因子，主要是将含有组织因子基因的分子片段提取出并在大肠杆菌、真菌或动物細胞等中表达，从而获得组织因子，这种方法比前述自然取得组织因子的方法更为方便，得到的产品更纯并可大量生产。目前PT试剂中用到的这种基于基因工程的方法得到的组织因子，还主要是人组织因子和兔组织因子，但这种PT试剂及其制备方法也有缺陷，或稳定性差，或敏感性不高，或制备过程复杂エ艺难控制等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的凝血酶原时间测定试剂的制备方法。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案 ー种凝血酶原时间测定试剂的制备方法，包括如下步骤
(1)、通过基因工程的方法制备纯度在90%以上的牛或羊组织因子，并将所述组织因子溶于水或磷酸缓冲液中形成组织因子溶液；
(2)、将适量磷脂溶于含有表面活性剂的磷酸缓冲液中，搅拌6(Γ120分钟后，获得均勻分散的磷脂溶液；所述磷酸缓冲液的PH值在7. 2 7. 6之间，表面活性剂的质量含量为1% ；
(3)、将步骤(1)制备得到的组织因子溶液加入步骤(2)所得的磷脂溶液中，使磷脂与组织因子的质量比在2. 5Χ IO3^XlO3:1之间，然后继续搅拌4(Γ90分钟，得到磷脂/组织因子溶液；
(4)、向步骤(3)所得的磷脂/组织因子溶液中加入体积为所述磷脂/组织因子溶液体积的1/10的完全溶胀的烷基键合硅胶，然后每间隔圹12分钟，进行一次摇勻，摇勻多次后， 得到浑浊液体；
(5)、对步骤(4)所得的浑浊液体进行离心分离，滤除沉淀，取上清液冻干，即得所述的凝血酶原时间测定试剂。优选地，所述的表面活性剂为聚乙ニ醇对异辛基苯基醚，即曲拉通。优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述的磷酸缓冲液为PBS缓冲液。优选地，所述磷脂为自然磷脂或合成磷脂或两者的混合物，且合成磷脂可选用磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺中的ー种或多种的混合。优选地，所述烷基键合硅胶为十八烷基键合硅胶，俗称C18树脂，常用来制作层析柱，但尚未见此种树脂应用在本发明所属领域中。由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点
本发明将通过基因工程方法制备得到的纯度> 90%的牛或羊组织因子与磷脂相结合， 能够得到稳定性和灵敏性更好的PT试剂；用C18树脂能够非常方便和彻底地除去溶解磷脂时所用的表面活性剤，使制得的PT试剂杂质更少，质量更好；另外本发明制备方法还具有 エ艺稳定，可操作性强的优点。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进ー步详细的说明，但不限于这些实施例。实施例1
本实施例的PT试剂的制备方法，包括如下步骤
(1)、用基因工程的方法在大肠杆菌中表达羊组织因子，制备纯度在90%以上的羊组织因子，将该羊组织因子溶于适量PBS缓冲液中形成Mug/ml的组织因子溶液；
(2)、取磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸各0.3g，倒入ー个2L的玻璃烧杯中， 配制曲拉通质量含量为1%、ρΗ值为7. 4、浓度为20mmol的PBS缓冲液800ml，加入上述烧杯中，在15°C 25°C下轻轻搅拌90分钟后，获得均勻分散的磷脂溶液；
(3)、取步骤(1)制备得到的组织因子溶液5ml(含羊组织因子约270ug)加入步骤(2) 所得的磷脂溶液中，并再用PBS缓冲液定容至900ml，继续轻轻搅拌60分钟，使磷脂与组织因子充分结合，得到磷脂/组织因子溶液；
(4)、向步骤(3)所得的磷脂/组织因子溶液中加入90ml完全溶胀的C18树脂，然后每间隔10分钟，进行一次摇勻操作，摇勻5次后，得到含有沉淀的浑浊液体；
(5)、对步骤(4)所得的浑浊液体进行离心分离，用尼龙布滤除沉淀，得到上清液，将该上清液分装入IOml的血清瓶中，每瓶1ml，再通过常规技术冻干，即得PT试剂产品。实施例2
本实施例的PT试剂的制备方法，包括如下步骤
(1)、用基因工程的方法在大肠杆菌中表达羊组织因子，制备纯度在90%以上的羊组织因子，将该羊组织因子溶于适量PBS缓冲液中形成50ug/ml的组织因子溶液；
(2)、取磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸各0.3g，倒入ー个2L的玻璃烧杯中， 配制曲拉通质量含量为1%、ρΗ值为7. 4、浓度为20mmol的PBS缓冲液800ml，加入上述烧杯中，在15°C 25°C下轻轻搅拌60分钟后，获得均勻分散的磷脂溶液；(3)、取步骤(1)制备得到的组织因子溶液5ml(含羊组织因子约250ug)加入步骤(2) 所得的磷脂溶液中，并再用PBS缓冲液定容至900ml，继续轻轻搅拌40分钟，使磷脂与组织因子充分结合，得到磷脂/组织因子溶液；
(4)、向步骤(3)所得的磷脂/组织因子溶液中加入90ml完全溶胀的Cw树脂，然后每间隔10分钟，进行一次摇勻操作，摇勻5次后，得到含有沉淀的浑浊液体；
(5)、对步骤(4)所得的浑浊液体进行离心分离，用尼龙布滤除沉淀，得到上清液，将该上清液分装入IOml的血清瓶中，每瓶1ml，再通过常规技术冻干，即得PT试剂产品。实施例3
本实施例的PT试剂的制备方法，包括如下步骤
(1)、用基因工程的方法在大肠杆菌中表达羊组织因子，制备纯度在90%以上的羊组织因子，将该羊组织因子溶于适量PBS缓冲液中形成60ug/ml的组织因子溶液；
(2)、取磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸各0.3g，倒入ー个2L的玻璃烧杯中， 配制曲拉通质量含量为1%、ρΗ值为7. 4、浓度为20mmol的PBS缓冲液800ml，加入上述烧杯中，在15°C 25°C下轻轻搅拌120分钟后，获得均勻分散的磷脂溶液；
(3)、取步骤(1)制备得到的组织因子溶液5ml(含羊组织因子约300ug)加入步骤(2) 所得的磷脂溶液中，并再用PBS缓冲液定容至900ml，继续轻轻搅拌80分钟，使磷脂与组织因子充分结合，得到磷脂/组织因子溶液；
(4)、向步骤(3)所得的磷脂/组织因子溶液中加入30ml完全溶胀的C18树脂，然后每间隔10分钟，进行一次摇勻操作，摇勻5次后，得到含有沉淀的浑浊液体；
(5)、对步骤(4)所得的浑浊液体进行离心分离，用尼龙布滤除沉淀，得到上清液，将该上清液分装入IOml的血清瓶中，每瓶1ml，再通过常规技术冻干，即得PT试剂产品。上述实施例中通过基因工程的方法制备牛或羊组织因子，可以制备整个分子，即包括胞外区域、脂结合区域和細胞内区域，也可以是整个分子的部分片段如胞外区域等。且基因可以在大肠杆菌中表达，也可以在动物細胞或真菌中表达。因此这种方法制备牛或羊组织因子具有容易实现、操作灵活的优点。另外，由于牛或羊组织因子的结构明了，选用牛或羊组织因子可望制备出质量更好的PT试剂产品。上述实施例制备而得的PT试剂与市售PT试剂相比，敏感性显著提高，ISI值为 0. 85 ；稳定性也得到显著改善，冻干品37°C下热稳定时间达5周，预计制品在2°C、で的温度条件下稳定时间可达至少3年。以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.ー种凝血酶原时间测定试剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)、通过基因工程的方法制备纯度在90%以上的牛或羊组织因子，并将所述组织因子溶于水或磷酸缓冲液中形成组织因子溶液；(2)、将适量磷脂溶于含有表面活性剂的磷酸缓冲液中，搅拌6(Γ120分钟后，获得均勻分散的磷脂溶液；所述磷酸缓冲液的PH值在7. 2 7. 6之间，表面活性剂的质量含量为1% ；(3)、将步骤(1)制备得到的组织因子溶液加入步骤(2)所得的磷脂溶液中，使磷脂与组织因子的质量比在2. 5Χ IO3^XlO3:1之间，然后继续搅拌4(Γ90分钟，得到磷脂/组织因子溶液；(4)、向步骤(3)所得的磷脂/组织因子溶液中加入体积为所述磷脂/组织因子溶液体积的1/10的完全溶胀的烷基键合硅胶，然后每间隔圹12分钟，进行一次摇勻，摇勻多次后， 得到浑浊液体；(5)、对步骤(4)所得的浑浊液体进行离心分离，滤除沉淀，取上清液冻干，即得所述的凝血酶原时间测定试剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的表面活性剂为聚乙ニ醇对异辛基苯基醚。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)中所述的磷酸缓冲液为PBS缓冲液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述磷脂为自然磷脂或合成磷脂或两者的混合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述合成磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺中的ー种或多种的混合。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述烷基键合硅胶为十八烷基键合硅胶。
全文摘要
本发明涉及一种凝血酶原时间测定试剂(PT试剂)的制备方法，包括如下步骤通过基因工程的方法制备纯度在90%以上的牛或羊组织因子，将磷脂分散于含表面活性剂的磷酸缓冲液中，然后将所述组织因子与所述磷脂相混合，使两者充分结合，最后用C18树脂吸附分离出表面活性剂，冻干后制得本发明PT试剂产品。本发明制备方法工艺稳定，可操作性强，所制得的PT试剂稳定性和灵敏性更好，且杂质少，质量容易保证。
文档编号G01N33/86GK102565427SQ201110446209
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者王小良 申请人:苏州良辰生物医药科技有限公司