专利名称：一种提高免疫层析检测灵敏性及特异性的方法
一种提高免疫层析检测灵敏性及特异性的方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种提高疫层析法灵敏性及特异性的方法。
背景技术：
免疫层析(immunochromatography，ICA)技术已被广泛应用于生物学检测，包括多种病原微生物。免疫层析技术以其简便快速，特异性强、敏感性高，肉眼判断，试验结果易保存，无需特殊仪器设备和试剂等优点，这些特点都是其他免疫学方法所无法比拟的。但现有免疫层析技术在实际研究及应用过程中存在灵敏性差的问题，容易导致假阴性的发生。 另外，由于样品中存在有各种各样的物质，容易干扰免疫层析检测，导致假阳性发生。
发明内容为了解决现有免疫层析技术存在的灵敏性及特异性差的问题，本发明提出了一种技术方案以提高该方法的检测灵敏性及特异性在进行检测前，首先对样品中的目标物质进行富集，然后再对富集所得产物进行免疫层析检测。如上所述的技术方案，其特征是在进行免疫层析检测前，对样品中的目标物质进行选择性富集或者浓缩以提高待检样品中目标物质的浓度，从而减小假阴性及假阳性的产生。如上所述的技术方案，其特征是所提供的选择性富集方法是采用纳米免疫磁珠将目标物质进行富集。如上所述的纳米免疫磁珠，其特征是粒径在20nm-60nm之间的颗粒；如上所述的纳米免疫磁珠，其特征是具有超顺磁性的颗粒。如上所述的纳米免疫磁珠，其材料为纳米纯铁或纳米碳包纯铁微球；如上所述的纳米免疫磁珠，其特征是磁珠表面包裹有一层或多层有机或无机材料，氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、纳米金等。如上所述的纳米免疫磁珠，其特征是可以是具有超顺磁性的颗粒，还可以是具有超顺磁性和荧光的复合颗粒。如上所述的纳米免疫磁珠，其特征是磁珠表面具有能将样品中目标物质特异性结合的抗体、抗原、受体、半抗原、生物素、亲和素等分子。如上所述的技术方案，其特征是纳米免疫磁珠对样品中的目标物质进行富集后， 再将磁珠与目标物质进行解离后进行免疫层析检测，也可不进行解离直接进行免疫层析检测。如上所述的技术方案，其特征是免疫层析检测可以以磁珠作为标记物，还可以是纳米金、纳米硒、纳米银、彩色乳胶、荧光物质等。如上所述的免疫层析检测，其特征是其免疫层析检测试纸条由背衬、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫等部件组成，还可以由背衬、样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫等部件组成。如上所述的技术方案，其特征是纳米免疫磁珠捕获目标物质，在磁场作用力下将磁珠与样品分离，实现目标物质的快速分离。如上所述的技术方案，其特征是可以对富集后的浓缩物进行洗涤，再进行免疫层析检测；还可以不进行洗涤，直接进行免疫层析检测。本发明的灵敏性比传统的免疫层析的灵敏性高1-2个数量级，经过选择性富集的样本，更适于用于免疫层析检测，检测结果更为准确可靠，操作简便快捷。
具体实施方式本实例以检测E. coli 0157:H7为例对本发明进行说明。尽管本发明的内容是结合本实例进行说明，但是不能认为是对本发明专利的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样属本发明的保护范围。实施例IE. coli 0157:H7免疫磁珠制备E. coli 0157:H7免疫磁珠制备参照已经建立的方法进行(Kong et al. ,2010), 反相微乳法制备磁性微球，在连接抗Ε. coli 0157:H7多克隆抗体(Abcam，美国)后，制备 E. coli 0157:H7纳米免疫磁球，加入储存液4°C保存。并用透射电子显微镜(TEM)和光镜进行形貌的定性检测。实施例2胶体金的制备按照Frens方法(Frens et al.，1973)，柠檬酸三钠还原法制备纳米金溶胶。将 IOOmL 0.01% (W/V)的HAuCl4溶液加热至沸腾，高速搅拌条件下快速加入1 % (W/V)柠檬酸三钠5mL，继续加热搅拌30min，自然冷却，0. 22 μ m滤膜过滤，4°C避光保存备用。实施例3免疫胶体金的制备调节胶体金至pH 8.0，逐滴加入E. coli 0157:H7单克隆抗体溶液，搅拌2_;3min， 10% BSA 封闭。40C 1500r/min 离心 20min，弃沉淀，上清于 4°C 10000r/min 离心 30min，沉淀以TBS(0. 005mol/L ρΗ7· 6，含0· BSA,0. 05%叠氮钠)重新悬浮，4°C保存备用。实施例4E. coli 0157:H7胶体金免疫层析试纸条的制备1)结合垫的制备将标记好的金标抗体吸附在玻璃纤维膜上放置37°C烘干半小时，2)检测线和质控线制备E. coli 0157:H7多克隆抗体(Abcam，USA)和兔抗鼠 IgG(Tingguo，China)以0. 01mol/L ρΗ7· 6的PBS分别稀释，分别包被于检测区和质控区， 作为检测线和质控线，室温干燥，备用。3)E. coli 0157:H7胶体金免疫层析试纸条的组装在塑料底板上分别将已固定有抗E. coli 0157:H7多克隆抗体和兔抗鼠IgG 二抗的硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫及样品垫依次装配、切条，即为E. coli 0157:H7胶体金免疫层析试纸条。实施例5纳米免疫磁珠富集E. coli 0157:H7取ImL菌悬液于EP管中，再加入一定量的Ε. coli 0157:H7纳米免疫磁珠，轻摇混勻后，室温孵育lOmin，磁性分离，弃上清，反复洗两次，所得浓集物即为捕获有E. coli 0157:H7。将捕获有菌Ε. coli 0157:H7的纳米免疫磁珠用0. ImLPBS重悬，用60°C水浴温育15min解离连接，磁分离架分离免疫磁珠，上清即为富集的E. coli 0157:H7。实施例6纳米免疫磁珠与胶体金试纸条检测Ε. coli 0157:Η7将富集后的样本120°C灭活15min，添加于E. coli 0157:H7免疫层析试纸条的样品垫上，IOmin后观察检测结果。对150份模拟食品样本(135例为阳性样本，15例为阴性样本)进行检测 (Tablel)，可得胶体金试纸条检测的灵敏度为四.6%，特异性为93. 3%。胶体金试纸条结合纳米免疫磁性分离测得的灵敏度为95. 5%，特异性为100%。Table 1. The comparison of sentitivity and specificty about two methods examine E. coli 0157:H权利要求
1.为了解决现有免疫层析技术存在的灵敏性及特异性差的问题，本发明提出了一种技术方案以提高该技术的检测灵敏性及特异性在进行检测前，首先对样品中的目标物质进行富集，然后再对富集所得产物进行免疫层析检测。
2.如权利1所述的技术方案，其特征是在进行免疫层析检测前，对样品中的目标物质进行选择性富集或者浓缩以提高待检样品中目标物质的浓度，从而减小假阴性及假阳性的产生。
3.如权利1所述的技术方案，其特征是所提供的选择性富集方法是采用纳米免疫磁珠将目标物质进行富集。
4.如权利3所述的纳米免疫磁珠，其特征是粒径在20nm-100nm之间的微球。
5.如权利3所述的免纳米疫磁珠，其特征是具有超顺磁性的颗粒。
6.如权利3所述的免纳米疫磁珠，其材料为纳米纯铁或纳米碳包纯铁微球。
7.如权利3所述的纳米免疫磁珠，其特征是磁珠表面包裹有一层或多层有机或无机材料，如氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、纳米金等。
8.如权利3所述的纳米免疫磁珠，其特征是可以是具有超顺磁性的颗粒，还可以是具有超顺磁性和荧光的复合颗粒。
9.如权利3所述的纳米免疫磁珠，其特征是磁珠表面具有能将样品中目标物质特异性结合的抗体、抗原、受体、半抗原、生物素、亲和素等分子。
10.如权利1所述的技术方案，其特征是纳米免疫磁珠对样品中的目标物质进行富集后，再将免疫磁珠与目标物质进行解离后进行免疫层析检测，也可不进行解离直接进行免疫层析检测。
11.如权利1所述的技术方案，其特征是免疫层析检测可以以磁珠作为标记物，还可以是纳米金、纳米硒、纳米银、彩色乳胶、荧光物质、荧光颗粒等。
12.如权利1所述的免疫层析检测，其特征是其免疫层析检测试纸条由背衬、样品垫、 结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫等部件组成，还可以由背衬、样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫等部件组成。
13.如权利1所述的技术方案，其特征是纳米免疫磁珠捕获目标物质，在磁场作用力下将磁珠与样品分离，实现目标物质的快速分离。
14.如权利1所述的技术方案，其特征是可以对富集后的浓缩物进行洗涤，再进行免疫层析检测；还可以不进行洗涤，直接进行免疫层析检测。
全文摘要
本发明属生物医学技术领域，公开了一种提高免疫层析检测灵敏性及特异性的方法在进行免疫层析检测之前，先对样品中的目标物质进行特异性富集，然后再将富集后的产物进行免疫层析检测。该方法简便易行，且可以有效提高免疫层析检测的灵敏性及特异性。
文档编号G01N33/558GK102520164SQ20111043364
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者周汉新, 李富荣, 齐晖 申请人:深圳市老年医学研究所