专利名称：一种含有脱氢延胡索碱的药物组合物及制备方法和测定方法
技术领域：
本发明涉及一种抗心肌缺血和耐缺氧的药物组合物，具体地说，是脱氢延胡索碱及主要含有非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀等在制备治疗抗心肌缺血和耐缺氧药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
延胡索(Corydalis yanhusuo W. T. Wang)习称元胡，始载于《本草拾遗》，具有行气止痛，活血化瘀之功效，在中医药学中为传统的活血、行气、止痛药。延胡索的化学成分目前发现的主要是生物碱，按其氨基氮的性质则可分为叔胺碱和季铵碱两大类，至今共从其块茎中发现的生物碱多为叔胺碱类成分，而针对季铵碱成分的研究尚少报道。
实验研究表明，延胡索中生物碱的药理作用与其氨基氮的性质密切相关，其中叔胺碱类多显示镇痛、镇静及安定作用；而延胡索在抗心肌缺血、减少心肌氧耗等方面的显著作用，主要是缘于季铵碱类成分的存在。邱蓉丽等曾对延胡索总碱抗心肌缺血作用进行过实验研究(中国中医药科技，2001,8(4) :265)，但未明确延胡索总碱的组成。到目前为止， 还没有文献报道脱氢延胡索碱及组合物具有抗心肌缺血和耐缺氧作用。我们在检索文献及专利的基础上，对延胡索中季铵总碱(主要为脱氢延胡索碱及组合物)作为有效成分进行了抗心肌缺血和耐缺氧实验，并且具有良好的药理作用。
本发明完成前未发现有关脱氢延胡索碱及组合物抗心肌缺血和耐缺氧的研究报道，也未发现脱氢延胡索碱及主要含有非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀等的组合物用于治疗抗心肌缺血和耐缺氧药物中的应用。发明内容
本发明的目的提供一种在抗心肌缺血和耐缺氧方面均有良好药理作用的含有脱氢延胡索碱的药物组合物及制备方法和测定方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种含有脱氢延胡索碱的药物组合物，它主要是将延胡索药材通过乙醇热回流提取，大孔吸附树脂纯化方法制得由脱氢延胡索碱以及季铵总碱、非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀组成的组合物，其中，脱氢延胡索碱的含量用高效液相色谱法测得不低于10% ；组合物中含季铵总碱以脱氢延胡索碱计不低于50%。
所述的组合物含季铵总碱57. 40 %，其中脱氢延胡索碱14. 05 %，非洲防己碱 4. 06%, 13-甲基脱氢紫堇达明碱1. ；34%，脱氢紫堇鳞茎碱3. 99%，巴马汀4. 10%。
一种如上所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的制备方法，该方法是选用延胡索药材，经粉碎，加入12-16倍量80%乙醇回流提取3次，每次3-5小时，合并提取液，滤过除去药渣，滤液回收乙醇至无醇味，药液以去离子水适当稀释，通过X-5型大孔吸附树脂， 药液经树脂柱吸附，流速为1-3毫升/分钟，吸附完毕后，先用2%氨水溶液洗去不吸附的杂质，再用50%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩，60°C以下真空干燥，干燥物再用95%乙醇复溶，滤过，滤液回收溶剂至干，得含有脱氢延胡索碱组合物。
所述选用延胡索药材，经粉碎，加入14倍量80%乙醇回流并按6倍、4倍、4倍分别提取3次，每次4小时；所述的得含有脱氢延胡索碱组合物中，含季铵总碱57. 40%，其中脱氢延胡索碱14. 05%，非洲防己碱4. 06%, 13-甲基脱氢紫堇达明碱1. 34%，脱氢紫堇鳞茎碱3. 99%，巴马汀4. 10%。
一种如上所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的脱氢延胡索碱测定方法，它是利用高效液相色谱法测定，包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(含0. 8% 冰醋酸和0.2%三乙胺)( 76)为流动相；检测波长为335nm;理论板数按脱氢延胡索碱峰计算不低于3000 ；
对照品溶液的制备精密称取脱氢延胡索碱对照品各适量，用甲醇溶解制成浓度为126. 88 μ g/mL对照品溶液；
供试品溶液的制备取组合物10mg，精密称定，用80%甲醇溶解并定容于IOmL量瓶中，作为供试品溶液；
测定方法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ L，注入液相色谱仪，测定，即得。
一种如上所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的延胡索季铵总碱测定方法，它是利用如下紫外比色法测定，包括
对照品溶液的制备取脱氢延胡索碱适量，加甲醇溶解，配制成0. lmg/mL对照品溶液；
供试品溶液的制备取组合物适量，加80%甲醇超声溶解，配制成0. ang/mL供试品溶液；
测定方法分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各0. 5mL，加pH8磷酸盐缓冲液 5mL,溴麝香草酚蓝试液lmL，再加氯仿6mL，密塞，剧烈振摇^iin转移至分液漏斗中，静置 lh，分取氯仿层于放有0. Ig无水硫酸钠的试管中，振摇静置后，分取上层氯仿，以空白为对照，于415nm处测定吸光度，计算。
本发明的特点在于，延胡索用含水乙醇提取后，提取液不浓缩直接回收溶剂后，在经大孔吸附树脂柱纯化，可获得高含量的含有脱氢延胡索碱的组合物；整个生产工艺仅用乙醇和水，不使用易燃易爆和有毒溶剂，生产工艺简单，生产周期短，安全，不污染环境，成本低，收率高，特别适合产业化大量生产；本发明能够降低心肌梗死程度，具有明显的抗心肌缺血和明显延长小鼠耐缺氧时间的作用。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍本发明所述的一种含有脱氢延胡索碱的药物组合物，它主要是将延胡索药材通过乙醇热回流提取，大孔吸附树脂纯化方法制得由脱氢延胡索碱以及季铵总碱、非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀组成的组合物，其中，脱氢延胡索碱的含量用高效液相色谱法测得不低于10% ； 组合物中含季铵总碱以脱氢延胡索碱计不低于50%。
所述的组合物含季铵总碱57. 40%，其中脱氢延胡索碱14. 05%，非洲防己碱4. 06%, 13-甲基脱氢紫堇达明碱1.；34%，脱氢紫堇鳞茎碱3. 99%，巴马汀4. 10%。
一种如上所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的制备方法，该方法是选用延胡索药材，经粉碎，加入12-16倍量80%乙醇回流提取3次，每次3-5小时，合并提取液，滤过除去药渣，滤液回收乙醇至无醇味，药液以去离子水适当稀释，通过X-5型大孔吸附树脂， 药液经树脂柱吸附，流速为1-3毫升/分钟，吸附完毕后，先用2%氨水溶液洗去不吸附的杂质，再用50%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩，60°C以下真空干燥，干燥物再用95%乙醇复溶，滤过，滤液回收溶剂至干，得含有脱氢延胡索碱组合物。
所述选用延胡索药材，经粉碎，加入14倍量80%乙醇回流并按6倍、4倍、4倍分别提取3次，每次4小时；所述的得含有脱氢延胡索碱组合物中，含季铵总碱57. 40%，其中脱氢延胡索碱14. 05%，非洲防己碱4. 06%, 13-甲基脱氢紫堇达明碱1. 34%，脱氢紫堇鳞茎碱3. 99%，巴马汀4. 10%。
本发明所述的实施例可以在上述选定的范围内任意选取和组合，并构成本发明的多种实施方案，并不限于以后公开的某一种实施例。
一种如上所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的脱氢延胡索碱测定方法，它是利用高效液相色谱法测定，包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(含0. 8% 冰醋酸和0.2%三乙胺)( 76)为流动相；检测波长为335nm;理论板数按脱氢延胡索碱峰计算不低于3000 ；
对照品溶液的制备精密称取脱氢延胡索碱对照品各适量，用甲醇溶解制成浓度为126. 88 μ g/mL对照品溶液；
供试品溶液的制备取组合物10mg，精密称定，用80%甲醇溶解并定容于IOmL量瓶中，作为供试品溶液；
测定方法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ L，注入液相色谱仪，测定，即得。
一种如上所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的延胡索季铵总碱测定方法，它是利用如下紫外比色法测定，包括
对照品溶液的制备取脱氢延胡索碱适量，加甲醇溶解，配制成0. lmg/mL对照品溶液；
供试品溶液的制备取组合物适量，加80%甲醇超声溶解，配制成0. ang/mL供试品溶液；
测定方法分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各0. 5mL，加pH8磷酸盐缓冲液 5mL,溴麝香草酚蓝试液lmL，再加氯仿6mL，密塞，剧烈振摇^iin转移至分液漏斗中，静置 lh，分取氯仿层于放有0. Ig无水硫酸钠的试管中，振摇静置后，分取上层氯仿，以空白为对照，于415nm处测定吸光度，计算。
实施例
1、含有脱氢延胡索碱组合物的提取制备
延胡索药材，粉碎，加入14倍量80%乙醇回流提取3次(6倍，4倍，4倍)，每次4 小时，合并提取液，滤过除去药渣，滤液回收乙醇至无醇味，药液以去离子水适当稀释，通过 X-5型大孔吸附树脂，药液经树脂柱吸附，流速为2毫升/分钟，吸附完毕后，先用2%氨水溶液洗去不吸附的杂质，再用50 %乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩，60°C以下真空干燥，干燥物再用95%乙醇复溶，滤过，滤液回收溶剂至干，得含有脱氢延胡索碱组合物。此组合物含季铵总碱57. 40%，其中脱氢延胡索碱14. 05%，非洲防己碱4. 06%， 13-甲基脱氢紫堇达明碱1. ；34%，脱氢紫堇鳞茎碱3. 99%，巴马汀4. 10%。
2、本发明所述药物组合物抗心肌缺血和耐缺氧作用的实验
2. 1实验动物
⑶-1/(ICR)小鼠，雌雄各半，体重18_22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号SCXK(京)2007-0001。Wister大鼠，雄性，体重220_M0g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号SCXK(京)2007-0001。
2. 2方法与结果
2. 2. 1对异丙肾上腺素诱发大鼠心肌缺血的影响
2. 2. 1. 1分组、给药与造模
经初筛合格的大鼠随机分为6组，每组8只空白对照组，模型组，给药低剂量组、 中剂量组、高剂量组和粗提物组。实验开始后，给药低剂量组、中剂量组、高剂量组和粗提物组均按10mL/kg体重灌胃给予相应药物，空白对照及模型组灌服同体积蒸馏水，每天给药1 次，连续7天。从实验第5天开始，除空白对照组腹腔注射同体积生理盐水外，其余各组均于灌胃给药后Ih腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)注射液(5mg/kg)，连续注射3天，时间间隔均为Mh。造成大鼠急性心肌缺血模型。
2. 2. 1. 2检测指标与方法
末次注射ISO后池处死大鼠，颈动脉取血，离心提取血清。按试剂盒提供的方法检测血清LDH、CK、N0活性。数据以X士S表示，组间采用t检验进行显著性分析，以P < 0. 05 作为显著性差异的标准。结果见表1。
表1对ISO诱发心肌缺血大鼠血清LDH、CK、NO的影响(χ士 s，η = 8)
权利要求
1.一种含有脱氢延胡索碱的药物组合物，它主要是将延胡索药材通过乙醇热回流提取，大孔吸附树脂纯化方法制得由脱氢延胡索碱以及季铵总碱、非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀组成的组合物，其中，脱氢延胡索碱的含量用高效液相色谱法测得不低于10% ；组合物中含季铵总碱以脱氢延胡索碱计不低于50%。
2.根据权利要求1所述的含有脱氢延胡索碱的药物组合物，其特征在于所述的组合物含季铵总碱57. 40%,其中脱氢延胡索碱14. 05%,非洲防己碱4. 06%, 13-甲基脱氢紫堇达明碱1. 34%,脱氢紫堇鳞茎碱3. 99%，巴马汀4. 10%。
3.—种如权利要求1所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的制备方法，该方法是选用延胡索药材，经粉碎，加入12—16倍量80%乙醇回流提取3次，每次3—5小时，合并提取液，滤过除去药渣，滤液回收乙醇至无醇味，药液以去离子水适当稀释，通过X-5型大孔吸附树脂，药液经树脂柱吸附，流速为1一3毫升/分钟，吸附完毕后，先用1氨水溶液洗去不吸附的杂质，再用50%乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩，60°C以下真空干燥，干燥物再用95%乙醇复溶，滤过，滤液回收溶剂至干，得含有脱氢延胡索碱组合物。
4.根据权利要求3所述的含有脱氢延胡索碱的药物组合物的制备方法，其特征在于选用延胡索药材，经粉碎，加入14倍量80%乙醇回流并按6倍、4倍、4倍分别提取3次，每次4小时；所述的得含有脱氢延胡索碱组合物中，含季铵总碱57. 40%，其中脱氢延胡索碱 14. 05%,非洲防己碱4. 06%, 13-甲基脱氢紫堇达明碱1. 34%，脱氢紫堇鳞茎碱3. 99%，巴马汀 4. 10% ο
5.一种如权利要求1所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的脱氢延胡索碱测定方法， 其特征在于它是利用高效液相色谱法测定，包括以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0. 8%冰醋酸和0. 2%三乙胺的乙腈-水为流动相，其中冰醋酸三乙胺=24: 76 ；检测波长为335 nm ；理论板数按脱氢延胡索碱峰计算不低于3000 ；对照品溶液的制备精密称取脱氢延胡索碱对照品各适量，用甲醇溶解制成浓度为 126. 88 μ g/mL对照品溶液；供试品溶液的制备取组合物10mg，精密称定，用80%甲醇溶解并定容于IOmL量瓶中， 作为供试品溶液；测定方法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ L，注入液相色谱仪，测定， 即得。
6.一种如权利要求1所述含有脱氢延胡索碱的药物组合物的延胡索季铵总碱测定方法，其特征在于它利用紫外比色法测定对照品溶液的制备取脱氢延胡索碱适量，加甲醇溶解，配制成0. 1 mg /mL对照品溶液；供试品溶液的制备取组合物适量，加80%甲醇超声溶解，配制成0. ang/mL供试品溶液；测定方法分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各0. 5 mL，加pH8磷酸盐缓冲液5mL， 溴麝香草酚蓝试液lmL，再加氯仿6mL，密塞，剧烈振摇^iin转移至分液漏斗中，静置lh， 分取氯仿层于放有0. Ig无水硫酸钠的试管中，振摇静置后，分取上层氯仿，以空白为对照， 于415nm处测定吸光度，计算。
全文摘要
一种含有脱氢延胡索碱的药物组合物及制备方法和测定方法，所述的药物组合物主要是将延胡索药材通过乙醇热回流提取，大孔吸附树脂纯化方法制得由脱氢延胡索碱以及季铵总碱、非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀组成的组合物，其中，脱氢延胡索碱的含量用高效液相色谱法测得不低于10%；组合物中含季铵总碱以脱氢延胡索碱计不低于50%；所述的测定方法包括对脱氢延胡索碱测定方法和对延胡索季铵总碱测定方法，它具有生产工艺简单，生产周期短，安全，不污染环境，成本低，收率高，特别适合产业化大量生产等特点；它能够降低心肌梗死程度，具有明显的抗心肌缺血和明显延长小鼠耐缺氧时间的作用。
文档编号G01N30/06GK102512416SQ20111037255
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者刑东明, 周海梦, 孟凡国, 李海龙, 石钺, 胡卫江 申请人:浙江清华长三角研究院