专利名称：一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法
一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法技术领域
一种紫菜可控酶解产抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，属于生物制品分离纯化技术领域。
背景技术：
酶制剂已广泛应用在食品、酿造、制药、有机酸、淀粉糖、饲料工业、纺织、皮革、洗涤剂及保健品等各个领域，应用领域越来越广泛，食品与人们的生活密切相关，因此酶在食品工业中的应用价值越来越重要，目前在烘焙、奶制品、肉类加工、新型营养食品和蛋白质的水解中得到很大的体现。
酶解蛋白质生产多肽已成为当今研究热门，通过不同的酶切方式可以获得不同功能的活性多肽，尤其是开发一些寡肽物质，成为蛋白质研究中的一个新领域。
紫菜具有较高的食疗药用价值，紫菜提取液具有降血脂，防止动脉粥样硬化的功能。我国沿海大量养殖紫菜，一般末水条斑紫菜因口感较差往往售价很低。但其蛋白质含量仍然在25%左右、另外还含有多糖、琼脂、VC、各种矿物质等。目前紫菜的主要利用途径是制成海苔休闲食品，深加工产品较少，不断开展对紫菜的深加工和综合利用显得尤为迫切和必要。
由紫菜蛋白经过酶解产生紫菜多肽，分子量介于蛋白质与氨基酸之间，是以小分子肽为主、多种功效成分共存的蛋白质水解产物，可100%吸收入血液循环。将紫菜的各类功能因子用来加工功能性食品已经成为紫菜深度开发利用的重要方向。
本实验室研究制备的固体氨肽酶为外肽酶，可以从多肽链的N端解离氨基酸，该枯草芽孢杆菌所产氨肽酶酶系较为单一，它具备与多种内切性蛋白酶复配应用的潜力。经本实验室研究该氨肽酶与中性蛋白酶复合酶解末水条斑紫菜，可得到相对较高的水解度， 具有较小分子量，稳定性好，能够有效清除自由基的抗氧化活性肽。发明内容
本发明目的是提供一种紫菜可控酶解产抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，该紫菜抗氧化活性肽具有较小分子量，稳定性好，能够有效清除自由基，其抗氧化活性均保持在60%以上，温度耐受性也较好，可作为食源性抗氧化剂，在保健食品，医药和化妆品领域有广泛的应用前景。
本发明的技术方案枯草芽孢杆菌Zj016固体氨肽酶(中国专利201010578579. 1已公开，公开号 CN102078012A，
公开日2011-6-1)和商品化中性蛋白酶复配酶解紫菜，制备紫菜抗氧化多肽粗品。该粗品利用kphadex G-IO、DEAE-52和SOURCE 3RPC等色谱手段分离纯化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通过测定DPPH消除能力、清除超氧自由基能力，清除羟自由基能力和还原力来综合反映紫菜抗氧化肽的抗氧化性。经反相高效液相(RP-HPLC)分析型色谱测定其纯度，超高效液相色谱-质谱法OhTOF-MQ分析鉴定其氨基酸组成，并对其稳定性进行研究。
提取工艺为A一种枯草杆菌固体氨肽酶在紫菜复配酶解中的应用(1)将一种末水条斑紫菜撕成小块，放入培养皿中；将培养皿放入烘箱中，于105°C的条件下烘干MT^i至恒重；取出将干品放入粉碎机中研碎，得到紫菜粉末。
(2)以紫菜粉末为底物，以pH8. 5 Na2HPO4-KH2POdl冲液为介质，底物与缓冲液的比例为1 30，中性蛋白酶加入量为E/S=lX 105-2X 105 U/g，固体氨肽酶加入量为E/ S=IXlO4-2X104U/g。50°C水解6 h，80°C灭酶15 min，加入乙醇至体系乙醇体积分数为 60%。室温静置12 h，10000 r/min离心10 min，得到的上清液为含抗氧化紫菜多肽的混合物。
B酶解紫菜抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法(1)将紫菜多肽混合物通过大孔树脂DlOl脱色后，冷冻干燥得到淡黄色多肽粉末。将该淡黄色多肽粉末经a^phadex G-IO凝胶层析，流动相为0. 1 mol/L NaCl，流速0.1 mL/ min,收集峰组分，冷冻干燥，得到浅黄色多肽粉末。
(2) DEAE-52离子交换层析步骤(1)所得多肽粉末进行离子交换层析，采用阶段洗脱的方法，流动相0 250 min 0.1 mol/L NaCl, 250^400 min 0.2 mol/L NaCl, 40(T550min 0. 3 mol/L NaCl 和 550 650min 0. 4 mol/L NaCl 的 ρΗ8· 5 Na2HPO4-KH2PO4 缓冲液，进样量为20 mL，流速1 mL/min，检测波长为220 nm，收集峰组分，冷冻干燥；(3)SOURCE 3RPC ST4. 6/100反相层析步骤( 所得多肽粉末进行反相层析，流动相为A 含0. 1%三氟乙酸的10%-15%乙腈溶液；B 含0. 1%三氟乙酸的80%-75%乙腈溶液；梯度洗脱程序0 20 min 100% A ;20 40 min 100%A 100%B ;40 60 min 100%B，进样量为 2 mL，流速1.5 mL/min，检测波长为220 nm，收集浓缩的峰组分，得到酶解紫菜抗氧化活性肽；(4)利用反相高效液相(RP-HPLC)分析型色谱测定该白色的酶解紫菜抗氧化活性肽纯度达87. 44%。超高效液相色谱一质谱法Ο -TOF-MS)分析鉴定为一种六肽DGVGYG (Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly) 结果如图 2。
C酶解紫菜抗氧化活性肽的稳定性紫菜抗氧化活性肽分别在60°C，8(TC及100°C的水浴环境中放置2小时，立即用冰水冷却，其抗氧化活性均保持在60%以上，温度耐受性较好。结果如图3，图4。
氨肽酶的酶活LNA法测定。测定时，首先配1Tris-HCl缓冲液，取6. 075g 1Tris溶于900mL蒸馏水，用浓 HCl调至pH8. 5，然后定容至1L。以L-亮氨酸对硝基苯胺L-leu-pNA作为底物，取0. Ig底物溶于ImL酒精，然后用Tris-HCl缓冲液定容到100mL。取0. Ig固体氨肽酶粉用Tris-HCl 缓冲液定容到IOOmL作为待测酶液。加入2mL的Tris-HCl缓冲液和ImL底物(L-亮氨酸对硝基苯胺L-leu-pNA)，一个加入ImL酶液，另一个加入ImL Tris-HCl缓冲液作为对照， 在50°C水浴反应IOmin后，405nm比色测定酶活。
酶活公式酶活=AX105.7X4Xn/10其中A为待测酶液的吸光度；η为待测酶液的稀释倍数。
酶活力定义50°C，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1微摩尔的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。
测定样品对DPPH (二苯代苦味胼基)自由基的清除率采用消除DPPH自由基法。取2mL待测样品，加入2mL质量浓度为0. 04g/L的DPPH 无水乙醇溶液，混合均勻后反应20min，在转速3500 r/min下，离心lOmin，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Ai ；另取2mL待测样品于试管中，分别加入无水乙醇2 mL，反应 20min,在转速3500r/min下离心lOmin，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Aj ；以2mL 质量浓度0. 04g/L的DPPH ·无水乙醇溶液和2mL无水乙醇反应作为参比，其在波长517nm 处吸光度记为Atl，按照下列式子计算样品对DPPH自由基的清除率
权利要求
1. 一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的分离纯化、鉴定方法，其特征在于(1)以烘干到恒重的末水条斑紫菜粉末为底物，以PH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液为介质，底物与缓冲液的质量比例为1:30，中性蛋白酶加入量为E/S=lX 105-2X 105U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=lX 104 -2X 104U/g，5(rC水解6 h，80°C灭酶15min，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60%，室温静置12h，10000 r/min离心lOmin，得到的上清液为含紫菜抗氧化多肽粗品；(2)将紫菜抗氧化多肽粗品通过大孔树脂DlOl脱色后，冷冻干燥得到淡黄色多肽粉末，将该淡黄色多肽粉末依次经过kphadex G-10、DEAE-52和SOURCE 3RPC ST4. 6/100进一步分离纯化后，得到紫菜抗氧化活性肽；a)Sephadex G_10凝胶层析脱色后的多肽粉末进行凝胶层析，流动相为0. 1 mol/L NaCl，流速0. 1 mL/min，收集峰组分，冷冻干燥，得到浅黄色多肽粉末；b)DEAE-52离子交换层析步骤a)所得多肽粉末进行离子交换层析，采用阶段洗脱的方法，流动相:0 250 min 0. 1 mol/L NaCl,250^400 min 0.2 mol/L NaCl，400 550min 0.3 mol/L NaCl 和 550 650min 0.4 mol/L NaCl 的 pH8. 5 Na2HPO4-Iffl2PO4 缓冲液，进样量为 20 mL，流速1 mL/min，检测波长为220 nm，收集峰组分，冷冻干燥；c)SOURCE 3RPC ST4. 6/100反相层析步骤b)所得多肽粉末进行反相层析，流动相为 A 含0. 1%三氟乙酸的10%-15%乙腈溶液；B 含0. 1%三氟乙酸的80%-75%乙腈溶液；梯度洗脱程序0 20 min 100% A ；20 40 min 100%A 100%B ；40 60 min 100%B，进样量为 2 mL, 流速1. 5 mL/min，检测波长为220 nm，收集浓缩的峰组分，得到酶解紫菜抗氧化活性肽；当其浓度为100 μ g/mL时，对超氧自由基、DPPH和羟自由基的清除率依次为超过20%， 45%，45%，还原能力为VC的1倍以上，有很强的抗氧化性；(3)分析鉴定将所得酶解紫菜抗氧化活性肽进行反相高效液相RP-HPLC分析型色谱测定，其纯度达85%以上；超高效液相色谱一质谱法Q-TOF-MS分析鉴定为一种六肽 DGVGYG=Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly ；(4)温度耐受性将所得酶解紫菜抗氧化活性肽分别在60°C，80°C及100°C的水浴环境中放置2小时，立即用冰水冷却，其抗氧化活性均保持在60%以上。
全文摘要
一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，属于生物制品分离纯化技术领域。本发明涉及枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶和中性蛋白酶复配酶解一种成本低廉的末水条斑紫菜，得到紫菜抗氧化多肽粗品。该粗品利用SephadexG-10、DEAE-52和SOURCE3RPC等色谱手段分离纯化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通过测定DPPH消除能力，清除超氧自由基能力，清除羟自由基能力和还原力来综合反映紫菜抗氧化活性肽的抗氧化性。经RP-HPLC分析型色谱测定其纯度，Q-TOF-MS分析鉴定其氨基酸组成，并对其抗氧化活性的稳定性进行研究。该紫菜抗氧化活性肽具有较小分子量，稳定性好，能够有效清除自由基，可作为食源性抗氧化剂，在保健食品，医药和化妆品领域有广泛的应用前景。
文档编号G01N1/34GK102495169SQ20111036265
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者姚翔, 田亚平 申请人:江南大学