专利名称：游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位(F-β-hCG)定量测定试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位(F-i3-HCG)含量的试剂盒及其测试方法。
背景技术：
人绒毛膜促性腺激素(HCG)是一种胎盘滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，由α亚基和β亚基组合而成。两种亚基均可以游离态出现在血液中。HCGa亚基与垂体糖蛋白激素的α亚基相同，用免疫学方法无法将它们区别开，而HCG的β亚基是HCG的特有结构，也决定了其分子的生物学和免疫学特性，分子量为22. 2KD。在整个怀孕过程中，游离F-β-hCG 通常是随完整的hCG —起出现和增长，所以游离β -HCG是诊断早孕的一项重要的检测指标，其分泌与滋养细胞的数量密切相关。血清F-β-hCG测定还能诊断异位妊娠、先兆流产、 葡萄胎及滋养细胞肿瘤，而且也是治疗后的及预后观察的重要检测指标，对其他疾病如卵巢生殖细胞肿瘤、男性肇丸肿瘤，非滋养细胞疾病、非生殖细胞也有辅助诊断意义。从检测角度上来说，目前临床上用于测定F-B-HCG的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。过去以放免为代表的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位(F-B-HCG)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场， 目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80 年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性， 同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法， 抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统 ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位 (F-B-HCG)定量测定试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行F-B-HCG检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
权利要求
1.一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位F-β-HCG的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含F-B-HCG磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，F- β -HCG校准品、 F-β -HCG质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的F-β -HCG磁分离试剂含有标记有抗F- β -HCG单克隆抗体的磁性微球；所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗F-β -HCG单克隆抗体；所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液；所述稀释液是含有BSA的溶液；所述的校准品及质控品是含有一定量的F- β -HCG抗原的BSA溶液；所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和ftOclin-300的缓冲液；所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
3.如权利要求1-2任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得一、磁分离试剂的制备过程一)、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制IL·1、称取TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，称取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；·2、用移液器将ftx)Clin-300量取0.2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；·3、调节PH,控制PH在7.95-8. 05之间；·4、称取BSA3g倒入上述IL容器中；·5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；二)、磁分离试剂的制备过程·1、将1.Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗F- β -HCG单克隆抗体溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为Iml ；·2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温 90min ；·3、将步骤2的溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下离心 30min 浓缩至 0. 5ml ；·4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清，然后加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步骤3获得的抗体溶液，混勻后室温反应4小时；·5、加入0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分钟，然后加入 1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB 清洗已经标记的磁珠，混勻30秒；·6、用IOOml磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶；·7、将步骤6获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照1 1的体积比例混勻，即得权利要求 1或2所述试剂盒中的磁分离试剂；二、酶反应物的制备过程一)、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制IL ·1、取 Tris 6.06g、NaCl 13. Og^Zncl2 0. 05g、Proclin_300 0. 2ml 和 MgCl2 0. 05g 于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；·2、调PH,控制PH在7.35-7. 45范围内;·3、称取BSA3g倒入上述烧杯中；·4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；二)、碱性磷酸酶ALP与抗F- β -HCG单克隆抗体的偶联·1、取IOmgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升；·2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0. IM NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，收集保留液；·3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗F- β -HCG单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0. Iml的4mg/ml NaBH4溶液，混勻，置4°C下2小时；·4、将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保留液；·5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0. 15M PH7. 4的 PBS 中；·6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7. 4的PB缓冲液透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10，OOOrpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶ALP与抗F- β -HCG单克隆抗体的偶联物；将收集到的碱性磷酸酶ALP与抗F- β -HCG单克隆抗体的偶联物用上述步骤一)获得的酶反应物稀释液以1 1000的体积比混合均勻，即得酶反应物。三、反应增强剂的制备过程，配制IL·1、取TRIS1. 56g 和 NaCl 4. 23g 于 IL 容器中，取 0. 2ml Proclin-300 于 IOml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；·2、取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.35-7. 45之间；·3、称取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um滤器过滤即得；四、稀释液的制备过程，配制IL:·1、称取NaC19.Og和BSA 60g于IL的容器中；·2、取0.5ml Proclin-300加IOml纯化水溶解，倒入上述IL的容器中；·3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；五、F-β -HCG校准品和F- β -HCG质控品的配制F-^-HCG 校准品中 F-β-HCG 抗原的浓度分别为 5，15，40，80，200mU/ml ；F-^-HCG 质控品中F-β-HCG抗原的浓度分别为15，80mU/ml ；六、清洗液浓缩液的制备过程，配制IL·1、取TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；·2、取5gTween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；·3、取0.2ml Proclin-300于盛有IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；·4、取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解；·5、调PH,控制其范围在7.35-7. 45之间；·6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得； 七、底物溶液的制备过程，配制IL ·1、取TRIS 2. 35g,NaCl 6. 41g、Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 IL 烧杯中；·2、取600ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.95-8. 05之间；·3、加入250mlLumi-Phos 480，用0. 2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混勻后即得。
4、如权利要求1-3任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下1)、加15μ 1 F-β -HCG校准品、F- β -HCG质控品、待测标本至对应试管底部；2)、加45μ 1酶反应物至每一试管中；3)、加45μ 1反应增强剂至每一试管中；4)、加30μ 1磁分离试剂至每一试管中；5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混勻器轻轻振荡试管架30s后，置37°C水浴30分钟；6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟，倒转分离器倒出上清液；7)、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μ 1稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混勻器上轻轻振荡混勻30s ；8)、加200μ 1底物溶液至试管中混勻3秒，发光检测仪检测。
5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述待测标本为高值HOOK样本时，根据需要使用稀释液对标本进行稀释。
全文摘要
本发明公开了一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位F-β-HCG的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含F-β-HCG磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，F-β-HCG校准品、F-β-HCG质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少10分钟，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。
文档编号G01N33/577GK102338804SQ201110257470
公开日2012年2月1日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者不公告发明人 申请人:内蒙古科慧生物科技有限责任公司