专利名称：基于非损伤微测技术的水稻生理性青枯病评价方法
技术领域：
本发明涉及水稻生理性青枯病的评价方法，具体涉及一种基于非损伤微测技术的水稻生理性青枯病评价方法。
背景技术：
水稻青枯病是水稻常见病害，多发生于水稻育苗期及晚水稻灌水稻灌浆期，症状表现为叶片卷曲萎蔫，叶片水分含量下降，青灰色，茎秆干瘪柔软。水稻生理性青枯病的发生多由于生理性失水所致，另外土层浅、肥力不够、缺氮肥也容易导致水稻生理性青枯病的发生。水稻发生生理性青枯病时根系枯黄、根生长缓慢，因此，作为吸收水分及营养的主要器官其吸收功能下降，尤其是对无机离子的吸收表现最为明显，因此，检测评价水稻生长期间根系对无机离子的吸收情况可以判别是否会发生水稻生理性青枯病。以往分析植物材料中无机离子含量时都是通过前处理，然后利用原子吸收光谱法检测离子含量，如，王宝山等对小麦叶片中Na+、K+离子含量的测定就采用了原子吸收光谱法(王宝山，赵可夫小麦叶片中Na，K提取方法的比较植物生理学通讯[J]. 1995，31(1)50-52)；陈贵桂林等研究NaCl对白刺离子含量影响时也采用了原子吸收光谱法(陈贵林，王晨霞，陈建英NaCl胁迫对白刺试管苗渗透调节物质及离子含量的影响西北植物学报[J]. 2009,6 :1233-1239)；董桃杏等检测茉莉酸甲酯对水稻叶片无机离子含量的影响时也采用了原子吸收光谱法，以上方法对于检测特定时间点材料中的离子含量是非常有效的，但是对离子进出植物材料的动态检测是无法实现的(董桃杏，蔡昆争酸甲酯对水稻叶片质膜透性及无机离子含量的影响华北农学报[J].2010，25(l)起止页码136-140)。非损伤微测技术(Non-InvasiveMicro-Test ^Technology，NMT)，是通过微电极和微传感器获取离子和分子的信号，基于Nernst方程和Fick' s第一扩散定律计算离子和分子的浓度和流速的技术，可获得10-12mol/Cm2.S数量级的离子流信号，该技术能够以对被测材料无损检测的的方式在细胞、器官、组织外周测量进出的离子或分子的运动速率、方向及浓度信息等。这种技术主要应用在植物学、动物学、微生物学、医学、环境科学、材料科学等领域。2011年澳大利亚的Siabala等人报道了用马铃薯病毒X(Potatc) virusX，PVX)侵染烟草，并暴露在氧化胁迫中，用非损伤性离子流检测技术(non-invasive ionflux measuring technique, MIFE)测定了 Ca2+和K+流速，结合药理学和细胞学方法研究了植物整体的适应性反应，发现病毒对植物的抗逆性具有重要的作用(Plant，Cell andEnvironment, 2011, 34 :406-417)。非损伤微测技术可以实现动态、不间断的对植物材料的检测，从而发现植物材料在不同环境及外界因素影响下的离子转运规律，从而判断植物所处的状态。非损伤微测技术可实现对植物材料无损、动态离子流的测量。Chen等利用非损伤微测技术检测了 NaCl处理下的小麦K+动态离子流，通过该种方法筛选耐盐性小麦品禾中(Chen Ζ.，Newman I.，Zhou Μ.，Mendham N.，Zhang G. Shabala S :Screening plantsfor salt tolerance by measuring K+flux -.a case study for barley [J]. Plant, Cell&Environment，2005，28 :1230-1246) ；Shabala等利用非损伤微测技术研究盐胁迫下Ca2+对拟南芥耐盐性的影响时发现不同浓度的外源Ca2+调节的NaCl引起的拟南芥根部K+外流(Shabala S, Demidchik V, Shabala L, Cuin TA, Smith SJ, Miller AJ,Davies JM, NewmanIA :Extracellular Ca2+ameIiorates NaCl-induced K+Ioss from Arabidopsisroot andleaf cells by controlling plasma membrane K+-permeable channels [J]. PlantPhysiol,2006,141(4) :1653-1665)。目前对植物病害评价报道很少，申请号“200910192176”的中国专利用香蕉组培苗接种香蕉镰刀菌枯萎病(fusarium wilt)，接种对天，按照0_6级的病害评价等级对单株生根试管苗进行病害等级鉴定；申请号“201010164237”的中国专利在室内条件下以一定数量的接种体在水稻特定生育期接种待测水稻一定时间，培养待测水稻至发病显症后，根据病害发生的严重度评价待测水稻对水稻黑条矮缩病的抗性水平，而水稻生理性青枯病发生的评价至今未见公开。
发明内容
为克服目前尚无水稻生理性青枯病有效评价方法的缺陷，本发明的目的是提供一种高效、快速、准确的水稻生理性青枯病评价方法。本发明所述的水稻生理性青枯病评价方法采用非损伤微测技术检测水稻苗根部无机离子的离子流，所述离子流流向处于外流状态的水稻苗即为发生了生理性青枯病，所述无机离子为K+、NH4\ Ca2+中的一种或两种以上。在非损伤微测技术检测植物离子流时，通常，植物体对离子的外排，即离子由植物体流向测试液称为外流；相反地，植物体对离子的吸收，即离子由测试液流向植物体则称为内流。所述非损伤微测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度为0. 05 0. 15mM。所述水稻苗为2叶1心期水稻苗，测量位置为距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生区的外表面20 50 μ m处。所述评价方法进一步包括以下步骤(1)向微电极末端灌入测试离子灌充液至充满所述电极尖端0. 8 1. 5cm，再将所述电极的前端吸入测试离子的液体离子交换剂；(2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；(3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡20 50min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10 20min ；(4)对检测结果进行处理和分析。步骤(1)所述电极的前端吸入液体离子交换剂的长度为K+::150 -200 μ m
NH4+ 30 -、50 μ m ；
Ca2+ 10 -、30 μ m。 步骤⑴所述灌充液为
K+ 80 120mM KCl ；NH4+ 80 120mM NH4Cl ；Ca2+ 80 120mM CaCl2。步骤( 所述的校正液通常与测试缓冲液的成分相似，由低浓度校正液和高浓度校正液组成，具体为K+ 0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ :0· 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ 0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；校正后电极的Nerst方程计算理想值是K+:55 60mV;NH4+ 55 60Mv ；Ca2+ 25 30mV。步骤(3)所述的测试缓冲液为K+或 Ca2+ 0. 05 0. 15mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMMgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0. 1 0. 3mM Na2SO4^O. 2 0. 5mM MES ；NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2、0· 05 0. 15mMNH4Cl。所述K+离子流的流速为3 IOpmol. cm"2, s4，NH4+离子流的流速为100 150pmol.cm_2. Ca2+ 离子流的流速为 50 IOOpmol. cm_2. s—1。非损伤微测技术(^T)是以无损、活体、动态实时监测的方式获得进出水稻根系的净离子浓度、流速及方向信息的技术。将水稻冲洗根至干净后置于测试液中利用该技术测试水稻根部无机离子的离子流，通过无机离子流的变化规律可评价生理性青枯病的发生。K+在植物体内参与多种代谢途径，调控细胞的膨压，参与离子运输调控，因此正常水稻苗对K+是吸收的，而青枯病苗K+处于明显的外排；NH4+作为植物氮素吸收的主要形式对于植物的生长发育都很重要，氮元素参与机体内各种代谢途径，尤其在蛋白质的合成中是必须的无机元素，正常水稻苗对NH4+是吸收的，而青枯病苗NH4+处于明显的外排；钙是植物必须的营养元素，同时也是植物体内信号转导途径的第二信使，正常水稻苗对Ca2+是吸收的，而青枯病苗Ca2+则处于明显的外排。因此，K+、NH4+或Ca2+的吸收和外排可作为判别水稻是否发生了生理性青枯病的依据。生理性青枯病苗中K+、NH4+、Ca2+等无机离子在流向发生变化的同时，其流速也与正常稻苗有很大的不同，因此，在明确的测试条件下，离子流速也可作为判断水稻苗是否发生了生理性青枯病的依据之一。本发明的另一项技术方案是提供了非损伤微测技术在评价水稻生理性青枯病中的用途。本发明所述的检测方法能够实现对水稻生理性青枯病的无损、活体、快速检测，发病水稻苗与正常水稻苗净离子流对比明显，检测一个样本只需要几分钟最多十几分钟，耗时短；相对于感官识别的评价方法，检测准确性高。总之，本发明所述的检测方法简单、可靠，具有广泛的应用前景。
图1是本发明所述评价方法的流程图；图加是生理性青枯病与正常水稻苗的K+离子流分析图(实时流速)；图2b是生理性青枯病与正常水稻苗的K+离子流分析图(平均流速)；图3a是生理性青枯病与正常水稻苗的NH4+离子流分析图(实时流速)；图北是生理性青枯病与正常水稻苗的NH4+离子流分析图(平均流速)；图如是生理性青枯病与正常水稻苗的Ca2+离子流分析图(实时流速)；图4b是生理性青枯病与正常水稻苗的Ca2+离子流分析图(平均流速)；其中，图h、3a3a中纵坐标为离子流速，单位为pmol. cm_2. s—1，横坐标为时间，单位为s ；图2b、3b、4b中纵坐标为离子流速，单位为pmol. cm—2· s\
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。1、秧苗培养材料及培养条件为水稻品种龙粳沈(由黑龙江省农科院佳木斯水稻研究所提供)，种子经过晒种3天，盐水04斤食盐/100斤水)筛选后，20°C浸种2天，25°C催芽1天，播种在育苗秧盘中，土壤营养土 = 3 1，施底肥硫酸铵(1斤/1000斤土壤)和磷酸二铵O斤/1000斤土壤)，自然光照，温度在25-30°C，培养地点在国家农业信息化工程技术研究中心温室，秧苗在2叶1心时青枯病开始发生，此时开始离子流检测。2、仪器及耗材离子流检测用非损伤微测系统(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)，软件imFlux，微电极采用尖端直径为2-4 μ m的玻璃微电极。3、试剂及溶液(1)液态离子交换剂(LIX)K+ :Potassium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, M063103, USA ；NH4+Ammonium ionophore I-cocktail A；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103,USA ；Ca2+ Calcium ionophore I-cocktail A ;Sigma_Aldrich, Louis, M063103, USA。(2)测试缓冲液离子流测试时，测试不同的离子需要不同的测试液，如下K+离子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mMMESNH4+离子lmM KC1、0. ImM CaCl2,0. ImM NH4ClCa2+ 离子0. ImM KCl、0· ImM CaCl2,0. ImM MgCl2、0. 5mMNaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mMMES(3)电极灌充液K+: IOOmM KClNH4+: IOOmM NH4ClCa2+: IOOmM CaCl2
(4)校正液K+ 离子0. ImM 和 ImM KClNH4+ 离子0. ImM 和 ImM NH4ClCa2+ 离子0. ImM 和 ImM CaCl24、操作方法从电极末端灌入Icm左右的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满，电极前端吸入适当长度(K+ 180 μ m、NH4+ :40 μ m、Ca2+ :20 μ m)的液体离子交换剂(LIX)。将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正，其Nerst方程计算理想值分别是K+、NH4+ :58mV，Ca2+ J9mV。测试前，水稻苗测试材料在相应的测试缓冲液中平衡30min，然后在距离水稻根尖分生区(距离根尖400 μ m左右)表面30 μ m的地方振动检测，每个样品检测IOmin。5、数据处理离子流处理基于Fick扩散定律，并通过在线软件MageFluX-3D Ion FluxPlotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)计算得出。由 4 次独立实验所得到的数据做统计分析，利用EXcel2003分析作图。6、结果分析由图加和图2b可以看出，正常水稻苗K+处于内流状态，平均流速为-50. 3pmol.cm-2. S"1 ；发生生理性青枯病水稻苗K+处于明显的外流状态，平均流速为5. 4pmol. cm_2. s—1。由图3a和图北可以看出，正常水稻苗的NH4+处于内流状态，平均流速为-118. 57pmol. cm—2, s—1 ；发生生理性青枯病的水稻苗的NH4+处于外流状态，平均流速为123. 78pmol. cm 2· s 1O由图如和图4b可以看出，正常的水稻苗的Ca2+处于内流状态，平均流速为-105. 68pmol. cm_2. s—1，发生生理性青枯病的水稻苗Ca2+处于外流状态，平均流速为86. 6 lpmol. cm 2. s 1O根据几种离子中的一种或多种流向方向可以判断出水稻苗是否发生了生理性青枯病。虽然上文中已经用一般性说明具体实施方式
及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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权利要求
1.一种水稻生理性青枯病的评价方法，其特征在于，采用非损伤微测技术检测水稻苗根部无机离子的离子流，所述离子流流向处于外流状态的水稻苗即为发生了生理性青枯病，所述无机离子为K+、NH4+、Ca2+中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述非损伤微测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度为0. 05 0. 15mM。
3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述水稻苗为2叶1心期水稻苗，测量位置为距所述水稻苗根尖300 500 μ m的根尖分生区的外表面20 50 μ m处。
4.根据权利要求1-3任一项所述的评价方法，其特征在于，包括以下步骤(1)向微电极末端灌入测试离子灌充液至充满所述电极尖端0.8 1. 5cm，再将所述电极的前端吸入测试离子的液体离子交换剂；(2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；(3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡20 50min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10 20min ；(4)对检测结果进行处理和分析。
5.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)所述电极的前端吸入液体离子交换剂的长度为K+ 150 ~ 200 μ m ；NH4+ :30 50μπι ；Ca2+ 10 30 μ m。
6.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)所述灌充液为K+ 80 120mM KCl ；NH4+ 80 120mM NH4Cl ；Ca2+ 80 120mM CaCl2。
7.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，步骤(2)所述的校正液为K+ 0. 05 0. 15mM KCl 和 0. 5 1. 5mM KCl ；NH4+ :0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；Ca2+ 0. 05 0. 15mM CaCl2 和 0. 5 1. 5mM CaCl2 ；校正后电极的能斯特方程计算理想值为K+ 55 60mV ；NH4+ 55 60Mv ；Ca2+ 25 30mV。
8.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，步骤(3)所述的测试缓冲液为K+或Ca2+ 0. 05 0. 15mM KC1、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMMgCl2、0. 3 0. 6mMNaCl、0. 1 0. 3mM Na2SO4^O. 2 0. 5mM MES ；NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMNH4Cl。
9.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，所述K+离子流的流速为3 IOpmol.cm_2. S^NH4+离子流的流速为100 150pmol. cm_2. Ca2+离子流的流速为50 IOOpmol.-2 -1cm . s ο
10.非损伤微测技术在评价水稻生理性青枯病中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种水稻生理性青枯病的快速评价方法，所述方法采用非损伤微测技术检测水稻苗根部无机离子的离子流，所述离子流流向处于外流状态的水稻苗即为发生了生理性青枯病，所述无机离子为K+、NH4+、Ca2+中的一种或两种以上。本发明还提供了非损伤微测技术在检测水稻生理性青枯病中的用途。本发明所述的评价检测方法能够实现对水稻生理性青枯病的无损、活体、快速检测，发病水稻苗与正常水稻苗净离子流对比明显，检测一个样本只需要几分钟最多十几分钟，耗时短；相对于感官识别的评价方法，检测准确性高。本发明所述的检测方法简单、可靠，具有广泛的应用前景。
文档编号G01N27/416GK102393416SQ201110246849
公开日2012年3月28日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者于春花, 侯佩臣, 侯瑞锋, 潘大宇, 王成, 王晓冬, 高权 申请人:北京农业智能装备技术研究中心