专利名称：一种丙型肝炎病毒重组蛋白及基因序列的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是一种丙型肝炎病毒重组蛋白及基因序列，可用于同时检测HCV抗体和核心抗原。
背景技术：
丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)引发的传染性疾病， 感染者一般无症状或者症状不明显，但是一旦感染，大多将转变慢性HCV感染，导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，甚至发展成为肝癌。目前全球有超过1. 7亿人感染丙型肝炎病毒，在美国每年新感染HCV者近4万人，其中约85%为急性感染者。在中国，HCV感染率约为3. 2%， 人数超4000万。由此可见，HCV造成了对人类健康的极大危害，因此，从某种程度上说HCV 感染已成为严重的公共卫生和社会问题。HCV的传播途径主要有以下几种第一，母婴传播，具有感染HCV母亲在围产期传播给新生儿的概率在洲左右；第二，性传播，有多位性伴侣者及男同性恋者HCV感染率大约1% ；第三，经血液传播，主要集中在输血，献血的过程中感染HCV，这是HCV感染的主要途径。因此，有效的控制及遏制HCV在血液中的传播能够极大的降低新感染病例。对HCV的检测主要集中在核酸即HCV RNA和HCV抗体两个方面，但在RNA检测上不仅需要有专业人员及相关精密仪器设备等，还需要花费大量的时间，另外，RNA的不稳定性也造成了很多漏检。目前在HCV抗体筛查方面，主要为酶联免疫(ELISA)诊断试剂盒和胶体金试剂条，其中ELISA诊断试剂盒经历了三代产品，第三代ELISA诊断试剂盒虽然比第一、第二代试剂有明显的改进，但其采用间接法原理进行HCV抗体检查，无法避免由于方法学所带来的低灵敏度和假阳性等问题，而且HCV感染的“窗口期”通常还需要平均70 多天，因此，第三代HCV抗体检测试剂仍需要提高和改进。而在胶体金试剂条方面大多也为间接法原理，和ELISA诊断试剂盒存在相同的缺点，虽然也有采用双抗原夹心法检测HCV 抗体，但也解决不了“窗口期”的问题，对早期的诊断仍然效果很差，因此亟待开发同时检测 HCV抗原和抗体的诊断试剂，才能及早的发现感染者，以期能极大地降低HCV感染病例。体外诊断核心原料的开发则是开发相应诊断试剂的先决条件，只有开发出具有高活性，高性能的抗原抗体，体外诊断试剂产品才能成为现实，因此，针对HCV抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫，从某种程度上说，原料的开发也必将成为降低HCV感染首要解决的问题。目前大多生产原料公司在HCV重组抗原中所取片段为NS3，NS4, NS5, core部分片段，且为连续片段。存在诸多方面的缺点，如1)缺少了其他蛋白El，E2主要抗原表位，这样极容易造成最终诊断产品的漏检现象；2)由于大多取的是连续片段，不可避免地加入了一些非抗原表位的序列，这样又给快诊产品带来假阳性风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒重组蛋白，其特征在于，所述丙型肝炎病毒重组蛋白是丙型肝炎病毒主要抗原决定簇和丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的融合蛋白。进一步地，上述丙型肝炎病毒重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明的另一个目的在于提供丙型肝炎病毒重组蛋白在制备丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒上的应用。本发明还有一个目的在于提供丙型肝炎病毒重组蛋白在制备丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒上的应用。本发明还提供了编码SEQ ID NO. 1的丙型肝炎病毒重组蛋白基因，其碱基序列如 SEQ ID NO. 2 所示。本发明提供了一种含有丙型肝炎病毒重组蛋白基因的重组载体，其特征在于，在质粒pET30a中包含有SEQ ID NO. 2核苷酸序列。本发明最后提供了一种利用权利要求6所述重组载体构建的大肠杆菌表达载体。 本发明的表达系统为大肠杆菌表达系统，它具有周期短，费用低，表达量大等特点。为了使得重组蛋白更好的保持活性位点，本发明选择比较温和的培养和诱导条件，其表达时的诱导温度为25度，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0. ImM。这样使得重组蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成。表达产物具有两个结构部分，一为丙型肝炎病毒主要抗原决定簇，二为丙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体。本发明利用基因工程重组技术，在大肠杆菌系统中表达丙型肝炎病毒主要抗原决定簇一核心蛋白单链抗体的融合蛋白，具有生产周期短，产量高，成本低的优点。本发明的重组蛋白可做为丙型肝炎病毒免疫诊断试剂盒的一部分。本发明重组蛋白的制备以及表达载体的构建具体方法如下从感染HCV病毒人体血清中提取HCV RNA,设计HCV引物，RT-PCR获得HCV的抗原决定簇以及核心片段(core) 的cDNA，测序分析序列正确后，把核心片段的cDNA插入到表达载体。利用核心片段的重组蛋白免疫小鼠获得高活性的单克隆抗体，再调取单链抗体基因(scFv)。最后将scFv和抗原决定簇的cDNA通过递归PCR技术连接起来，测序分析序列正确后，把重组蛋白的cDNA插入到表达载体。在提取重组蛋白时，可以采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候，为了避免剧烈条件，将破碎条件定为200w，超声6s，间隔3s超声一次，共180次。重组蛋白的纯化方式可以有多种，例如离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法。本发明优选亲和层析，因为重组蛋白中本发明加入了 6XHis标签，一步纯化能够达到较高的纯度。本发明的HCV重组蛋白基因的获取还可以通过人工合成法。本发明的重组蛋白用于丙型肝炎病毒检测具有以下优点
(1)本发明先对HCV各片段进行抗原表位的筛选，得到各蛋白的主要抗原表位图谱，然后再进行融合，这构建成功的嵌合抗原具有多方面的优点1)片段中具有NS3，NS4, NS5， Core主要表位，降低了最终快诊产品的漏检风险；幻本发明首先对各片段进行截短表达获得表位图谱，未加入一些非抗原表位的序列，这样就可以避免了假阳性风险。(2)首次开发针对HCV核心区蛋白(core)的scFv。HCV的核心蛋白即core蛋白在HCV感染后患者体内HCV抗体阳转前即可产生，是HCV复制和HCV载量的重要指标。通过检测患者体内核心蛋白可有效缩短HCV检测窗口期， 因此，开发具有高活力，高效价的核心抗体成为必须解决的问题。现有技术中只有针对核心蛋白的单克隆抗体，而本发明是在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体，单链抗体具有以下优点1)具有完整的抗原结合位点，不含抗体恒定区；2)分子量小，从而减少了抗体的非特异性结合，降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单，易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达，可以在真核或者原核细胞中表达，可大量生产，成本较低。因此scFv更优于完整抗体。因此，本发明的针对核心区蛋白的单链抗体除能特异性结合核心区外序列更加简单，更不容易引起假阳性。(3)本发明首次开发了 HCV主要抗原表位及针对核心区蛋白的scFv融合蛋白。由于HCV的窗口期的存在，致使在此段时间我们检测不到相应的HCV抗体，从而导致漏检，为了解决此问题必须在检测HCV抗体的同时增加对HCV抗原的检测，由于HCV的核心蛋白即core蛋白在HCV感染后患者体内HCV抗体阳转前即可产生，是HCV复制和HCV载量的重要指标，所以，开发针对核心蛋白的抗体成为关键。
在主要抗原表位和针对核心蛋白的抗体开发出后本发明利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(core，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)和针对核心蛋白的scFv融合，制备成具有同时结合HCV抗体和抗原的高活性，高灵敏度和高特异性的重组蛋白，具有以下优点 1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可，这样可以避免多种原料间的交叉反应；2)在原料的生产上，只需要稳定一种原料的生产工艺即可，这样可以减少生产成本的投入，缩短原料生产周期，降低生产批间差；3)节省了开发HCV诊断试剂的成本。
具体实施例方式实施例1 含有丙型肝炎病毒核心蛋白(core)基因的重组载体构建 (I)HCV病毒的提取
用病毒RNA提取试剂盒(上海生工生物工程服务有限公司，货号SK1321)从感染HCV 病毒人体血清中提取HCV RNA。(2)核心蛋白基因的重组载体构建
上游引物为(5’ -3’) GCCCATATGAGCACGAATCCTAAACCT,带有NdeI酶切位点，下游引物为(5’ -3’) :CGCAAGCTTCCTACGCCGGGGGTCTG，带有HindIII酶切位点，采用上述引物，以提取的HCV RNA为模板，用AMV RT-PCR试剂盒(上海生工生物工程服务有限公司，货号BS251)， 按照试剂盒推荐条件，制备HCV核心区序列，PCR(本发明的聚合酶为Τ0Υ0Β0公司产品，货号02510D1)，PCR条件为94度，2分钟X 1个循环，(98度，15秒，55度，30秒，68度，15 秒)X30个循环，72度，7分钟X 1个循环，测序证明序列正确后，将此PCR产物用NdeI和 HindIII限制性内切酶(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自NEB公司)进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的pET30a(NOVagen产品，货号69909-3)中。实施例2 筛选针对丙型肝炎病毒核心蛋白(core)的单克隆细胞
(1)免疫BALB/C小鼠，6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司，每只小鼠免疫50ug core抗原，第一针采用弗式完全佐剂乳化，第二，第三针和第四针采用弗式不完全佐剂乳化，第五针采用脾脏注射，每针间隔14天。(2)融合脾脏注射后3天，取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，比例5:1。
(3)筛选采用ELISA方法筛选阳性细胞，阳性细胞进一步克隆筛选，直至单克隆稳定。具体方法以实施例(1)和实施例(4)的核心抗原lug/ml，每孔50ul分别包被酶标板，P/oBSA封闭酶标板后，取50ul细胞培养上清检测，将对实施例(1)核心抗原有强阳性反应，并对实施例(4)核心抗原反应阴性的细胞继续克隆筛选，直到细胞稳定。实施例3 构建针对丙型肝炎病毒核心蛋白(core)的单链抗体 (1)细胞RNA的提取
用TRIzol LS (invitrogen产品，货号1(^96-010)试剂，按照说明书操作步骤提取细胞总RNA。(2) cDNA第一链的合成取Wg RNA做逆转录模板，Oligo (d) T μ 做逆转录引物，加DEPC水至总体积12μ1，混勻；70°C变性5min，迅速冰浴冷却；依次加入5X缓冲液 4μ1, RNase 抑制剂 μ ，dNTP(10mM each) 2μ1，混勻；37°C孵育 5min ；加入 AMV 逆转录酶 μ1，37 反转录60min ；70°C IOmin终止反应；冰上冷却。
(3)以逆转录cDNA为模板，按照以下引物，用RT-PCR扩增重链轻链基因。mHVul GATGTGAAGCTTCAGGAGTC
mHVu2 CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCmHVu3 CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCmHVu4 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCmHVu5 AAGGTCCAGCTGCAACAATCmHVu6 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCmHVu7 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCmHVu8 GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCmHVu9 GAGGTGAAGCTGGTGGAATCmHVulO GATGTGAACTTGGAAGTGTC
mHVdl TGCAGAGACAGTGACCAGAGT
mHVd2 TGAGGAGACTGTGAGAGTGGT
mHVd3 TGAGGAGACGGTGACTGAGGT
mHVd4 TGAGGAGACGGTGACCGTGGT
mKVul GATGTTTTGATGACCCAAACT
mKVu2 GATATTGTGATGACGCAGGCTmKVu3 GATATTGTGATAACCCAGmKVu4 GACATTGTGCTGACCCAATCTmKVu5 GACATTGTGATGACCCAGTCTmKVu6 GATATTGTGCTAACTCAGTCTmKVu7 GATATCCAGATGACACAGACTmKVu8 GACATCCAGCTGACTCAGTCTmKVu9 CAAATTGTTCTCACCCAGTCTmKVdl CCGTTTCAGCTCCAGCTTGmKVd2 CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTmKVd3 CCGTTTTATTTCCAACTTTG用引物mHVul — mHVulO 分别与 mHVdl—mHVd4 组合；mKVul—mKVu9 分别与 mKVdl— mKVd4组合做PCR反应。PCR反应体系25μ1，其中cDNA 0. 5μ1，上游引物0. 25μ1下游引物0. 25μ1，Taq酶 0. 2μ1 dNTP 2μ1 IOXbuffer 2. 5μ1。PCR(本发明的聚合酶为TOYOBO公司产品，货号02510D1)，PCR条件为94度，2分钟X ι个循环，(98度，15秒，55度，30秒，68度，15秒)X30个循环，72度，7分钟X 1个循环。经测序验证后确定重链和轻链基因，然后通过递归PCR将重链和轻链基因连接起来，此融合基因为rscFv。实施例4 含有丙型肝炎病毒主要抗原决定簇基因获得 (I)HCV病毒的提取
用病毒RNA提取试剂盒(上海生工生物工程服务有限公司，货号SK1321)从感染HCV 病毒人体血清中提取HCV RNA。(2)核心蛋白(core)基因的主要抗原决定簇基因
上游引物为(5，-3，) :ATGAGCACGAATCCTAAACCTC,下游引物为(5，-3，) GGAAGTCTTCCTAGTCGC，采用上述引物，以提取的HCV RNA为模板，用AMV RT-PCR试剂盒(上海生工生物工程服务有限公司，货号BS251)，按照试剂盒推荐条件，制备HCV核心蛋白序列，PCR酶(本发明的聚合酶为Τ0Υ0Β0公司产品，货号02510D1)，PCR条件为94度，2分钟X 1个循环，(98度，15秒，55度，30秒，68度，15秒)X30个循环，68度，7分钟X 1个循环，测序证明序列正确。基因命名为rCore。(3)NS3基因的主要抗原决定簇基因
上游引物为(5，-3，):ATGTCCAAGGCACATGGTAC,下游引物为(5，-3，) ATCACATATAATGATGTCATAGGC，采用上述引物，以提取的HCV RNA为模板，用AMV RT-PCR试剂盒(上海生工生物工程服务有限公司，货号BS251)，按照试剂盒推荐条件，制备HCV NS3序列，PCR酶(本发明的聚合酶为Τ0Υ0Β0公司产品，货号02510D1)，PCR条件为94度，2分钟X 1个循环，(98度，15秒，55度，30秒，68度，15秒)X30个循环，68度，7分钟X 1个循环，测序证明序列正确。基因命名为rNS3。G)NS4基因的主要抗原决定簇基因
上游引物为(5’-3’) :GCTATCATTCCCGACAGG,下游引物为(5’-3’) CTCCACCACGGGAGCAGCAGC，采用上述引物，以提取的HCV RNA为模板，用AMV RT-PCR试剂盒 (上海生工生物工程服务有限公司，货号BS251)，按照试剂盒推荐条件，制备HCV NS4序列，PCR酶(本发明的聚合酶为Τ0Υ0Β0公司产品，货号02510D1)，PCR条件为94度，2分钟X 1个循环，(98度，15秒，55度，30秒，68度，15秒)X30个循环，68度，7分钟X 1个循环，测序证明序列正确。基因命名为rNS4。(5)NS5基因的主要抗原决定簇基因
上游引物为(5，-3，):AGAGAGGGAAGTATCCGTT,下游引物为(5，-3，) CCCGTGTACCACCGGAGGGACG,采用上述引物，以提取的HCV RNA为模板，用AMV RT-PCR试剂盒(上海生工生物工程服务有限公司，货号BS251)，按照试剂盒推荐条件，制备HCV NS5序列，PCR酶(本发明的聚合酶为Τ0Υ0Β0公司产品，货号02510D1)，PCR条件为94度，2分钟X ι个循环，(98度，15秒，55度，30秒，68度，15秒)X30个循环，68度，7分钟X 1个循环，测序证明序列正确。基因命名为rNS5。
实施例5 含有丙型肝炎病毒重组蛋白的表达载体构建本实验例所用的引物序列如下
Pl (5，-3，；ATCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAACC ；P2(5'-3，；GCCGCTGCCGCTGCCGGAAGTCTTCCTAGTCGCG ；P3(5'-3，:GGCAGCGGCAGCGGCATGTCCAAGGCACATGGTAC ；P4(5'-3，:GCCGCTGCCGCTGCCATCACATATAATGATGTCA ；P5(5'-3，:GGCAGCGGCAGCGGCGCTATCATTCCCGACAGG ；P6(5'-3，:GCCGCTGCCGCTGCCCTCCACCACGGGAGCAGC ；P7(5'-3，:GGCAGCGGCAGCGGCAGAGAGGGAAGTATCCGT ；P8(5'-3，:GCCGCTGCCGCTGCCCCCGTGTACCACCGGAGG ；P9(5'-3，:GGCAGCGGCAGCGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTPlO (5-3，)CTTGTCGACCAGCACGGTCAGCTTGGTGCC。利用引物P1，P2 以 rCore 为 PCR 模板；P3，P4 以 rNS3 为 PCR 模板；P5，P6 以 rNS4 为PCR模板；P7，P8以rNS5为PCR模板；P9，P10以rscFv为PCR模板；PCR条件为94度， 2分钟X 1个循环，(98度，15秒，55度，30秒，68度，30秒)X30个循环，68度，7分钟X 1 个循环，获得的PCR产物命名分别为，PCRl, PCR2，PCR3，PCR4，PCR5。然后将上述五个PCR 产物混合进行第二次PCR，利用引物Pl和P10，用五种PCR混合产物为模板，PCR条件为94 度，2分钟X 1个循环，(98度，15秒，55度，30秒，68度，50秒)X30个循环，68度，7分钟X 1个循环，测序证明序列正确后，将此PCR产物用BamHI和MlI限制性内切酶(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自NEB公司)进行双酶切之后，插入到用相同两个酶切处理的 pET30a (Novagen 产品，货号 69909-3)中。实施例6 含有丙型肝炎病毒重组蛋白的表达
将HCV重组蛋白质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含lOOug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司，货号KB0286)的LB平板上，37度过夜培养，挑取单克隆菌落， 用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mlLB培养基37度培养至0D600达0. 6左右，用终浓度为0. ImM的IPTG(生工，货号IB0168)进行诱导表达，诱导条件为37度，转速250rpm， 证。诱导之后，将培养液4度5000rpm离心20min收集菌体。实施例7 含有丙型肝炎病毒重组蛋白的纯化及复性
将菌体用 50ml 包涵体抽提液(20mM Tris-HCl，0. 5MUrea pH 7.5，0. 5M NaCl, 2% Triton X-100)重悬，然后超声破碎，条件为超声3s，间隔6s，共180次，12000rpm，4度离心收集包涵体沉淀。用上样缓冲液 Binding Buffer (50mM Tris，8M Urea，0. 5M Nacl,20mM 咪唑pH8. 0) 50ml破碎包涵体，上柱纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer (50mM Tris,8M Urea,0. 5M NaCl，300mM咪唑pH8. 0)洗脱目的蛋白。将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液 (ImM氧化型谷胱甘肽GSSH，2mM还原型谷胱甘肽GSH，2mMEDTA, 20mM Tris，pH8. 5)透析，每隔4 换一次透析液。取出透析后的蛋白液，经据乙醇-20000进行浓缩，于-20度保存备用。实施例8 本发明的丙型肝炎病毒重组蛋白作为丙型肝炎病毒诊断试剂的免疫反应性
(1)丙型肝炎病毒重组蛋白-HRP复合物的制备
按照 pierce EZ-Iink plus activated peroxidase kit (货号 31489)进行操作。(2)丙型肝炎病毒重组蛋白-HRP复合物用来检测HCV标本
将100个HCV阳性血清和100个HCV阴性血清分别每孔50ul包被酶标板(深圳金灿华)，4°C过夜后(大于 8 小时)，用 PBST (IOmM PB, 150Mm NaCl, 0. 05% tween 20，ρΗ7·4)洗板3次，然后用1%BSA封闭，4°C过夜(大于8小时)，甩掉封闭液，拍干板子。每孔加入用PBST 稀释的)丙型肝炎病毒重组蛋白-HRP复合物(1 :5000)50ul，37°C温育60分钟，用PBST洗板3次，拍干，每孔加入50ul TMB(NEOGEN 304176)，温育30分钟后，每孔加入IN H2S04终止，酶标仪450nm读数。阈值计算(cutoff value, COV) = COV=阴性平均OD值X 2. 5，待测样品OD值彡COV 为阳性，待测样品OD值< COV为阴性。结果阳性检出率100%，特异性100%。
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒重组蛋白，其特征在于，所述丙型肝炎病毒重组蛋白是丙型肝炎病毒主要抗原决定簇和丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的丙型肝炎病毒重组蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
3.权利要求1或2所述丙型肝炎病毒重组蛋白在制备丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒上的应用。
4.权利要求1或2所述丙型肝炎病毒重组蛋白在制备丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒上的应用。
5.编码SEQID NO. 1的丙型肝炎病毒重组蛋白基因，其碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。
6.一种含有丙型肝炎病毒重组蛋白基因的重组载体，其特征在于，在质粒pET30a中包含有SEQ ID NO. 2核苷酸序列。
7.一种利用权利要求6所述重组载体构建的大肠杆菌表达载体。
8.权利要求7所述载体的蛋白表达方法，其特征在于，表达时的诱导温度为25度，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0. ImM。
全文摘要
本发明公开了一种丙型肝炎病毒重组蛋白，其特征在于，所述丙型肝炎病毒重组蛋白是丙型肝炎病毒主要抗原决定簇和丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的融合蛋白，进一步地，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明利用基因工程重组技术，在大肠杆菌系统中表达丙型肝炎病毒主要抗原决定簇-—核心蛋白单链抗体的融合蛋白，具有生产周期短，产量高，成本低的优点。本发明的重组蛋白可做为丙型肝炎病毒免疫诊断试剂盒的一部分。
文档编号G01N33/576GK102321179SQ201110227928
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者吴晓杰, 张海燕, 陈东 申请人:杭州培乐生物技术有限公司