专利名称：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用乳胶增强免疫比浊法测定入血清中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白含量的试剂盒。
背景技术：
人类中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL)分子量约为25kDa，共价结合于中性粒细胞明胶酶。NGAL生理状态下是一种生长因子，主要参与了早期肾脏上皮的发生、生长。在正常组织包括肾脏，肺，胃及结肠的上皮组织中表达量较低。肾脏缺血再灌注损伤后，近曲小管上皮大量表达NGAL，是近来发现的早期诊断AKI的敏感的生物学标志物。尿NGAL是肾脏缺血再灌注损伤的一个敏感的 指标，同时其表达量与肾脏缺血时间相关。在寻找AKI早期诊断标记物的研究中，人们发现NGAL是一个很好的预测及诊断指标。有学者在急性缺血再灌注和顺钼诱导的AKI小鼠模型中，发现在损伤发生数小时之内即可检测到NGAL的表达明显增高[6-7]。尿NGAL是缺血性肾损伤的一个早期、敏感的指标，即AKI时血、尿NGAL水平均升高，尿NGAL水平升高更为显著。并且NGAI升高较早期肾脏损伤的其他指标如肾脏损伤分子(kidney injury molecular I,KIM 一 I)、Cyr61 (cysteinriChprotein61)、132—微球蛋白等出现得要早。同时，NGAL水平与肾脏损伤程度呈正相关，血和尿NGAL可作为诊断AKI的早期、敏感、特异性的早期生物学标记物，并在一定程度上可以反映AKI严重程度及判断预后。NGAL已被证实作为小儿心脏搭桥手术后，预测急性肾损害的早期可靠指标。NGAL也是反映肾脏慢性损害的一种有潜力的新标记物,在慢性肾脏病(chronickidney dis-ease, CKD)患者中，NGAL能确切反映肾脏损害的程度，是CKD进展的一个强力和独立的风险指标。Suzuki等发现与血NGAL水平相比，尿NGAL是儿童SLE患者LN活动度和肾损害的一个新的标记物，且LN病理分型不同其NGAL水平亦不同(依据WHO的LN分型，IV型患儿NGAL水平明显高于V型)。在对抗中性粒细胞胞衆抗体(antineutrophilcytoplasmican-tibodies,ANCA)相关性血管炎的研究中，Chen等发现患者血清NGAL水平在疾病初期和复发期均较缓解期显著升高，提示循环NGAL水平可作为评价ANCA相关性血管炎疾病活动的一个有用指标。目前在临床上使用的NGAL检测方法只有酶免疫法(ELISA)，此方法存在操作繁琐，标本需要预处理，检测时间长等缺点。而胶乳增强免疫比浊法具有操作简便，快速，检测灵敏度高、特异、定量准确等优点，在临床应用能得到广泛认可。
发明内容
本发明的目的是建立一种新的检测方法，通过鼠抗人的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体(或者单抗)与胶乳颗粒偶联，采用胶乳增强比浊法来测定人体血清/尿液中NGAL的含量，运用该方法的试剂具有不需要预处理标本，操作简单，准确度高，重复性好，且能够在全自动生化分析仪或者特种蛋白仪以及分光光度计上使用。为了解决上述的技术问题，本发明实现了以下技术I. 一种采用胶乳增强免疫比浊法检测NGAL含量的试剂盒，其特征在于，包含试剂Rl，R2以及校准品；所述试剂Rl PH值为7. 2-8. 6的缓冲液，所述试剂R2为抗人NGAL抗体胶乳试剂；所述标准品为含有定量的NGAL的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然 NGAL。2.所述的NGAL检测试剂盒中的Rl试剂主要包含缓冲液,无机盐,加速剂和防腐剂。3.所述的NGAL检测试剂盒中R2试剂主要包含稳定剂，抗人单(多)克隆抗体胶乳颗粒，缓冲液，稳定剂和防腐剂。其中乳胶微球直径为80-200nm。 4.试剂Rl所述的无机盐选自氯化钠，氯化钾，硫酸钾一种或几种。缓冲液为=Tris缓冲液，MES缓冲液，磷酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中一种或几种。加速剂为聚乙二醇4000，聚乙二醇6000，聚乙二醇8000中一种或几种。5.试剂R2所选用的抗体为鼠抗人NGAL单克隆抗体，羊抗人NGAL单克隆抗体，兔抗人NGAL单克隆抗体一种或者几种混合。也可以选鼠抗人NGAL多克隆抗体，羊抗人NGAL多克隆抗体，兔抗人NGAL多克隆抗体其中一种。6.试剂R2中的稳定剂选自小牛白蛋白，明胶，甘氨酸，吐温20，曲拉通中的一种或者几种。7.本发明所述的试剂R2为抗人NGAL抗体胶乳试剂，采用的是抗人的NGAL抗体与胶乳颗粒相偶联。经过离心(过滤)的方法去掉未反应的偶联剂以及未反应的抗体，在含有稳定剂和防腐剂的缓冲液中分散而成。8.所述抗人NGAL抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤。步骤I :将胶乳在PH7. 0的溶液中活化。步骤2 :洗涤去掉溶液中的碳化二亚胺，加PH7. 5-9. 0的缓冲液，加入NGAL抗体，在37度反应4小时。步骤3 :将步骤2所得的液体用PH7. 5-9. 0的固定液固定6小时。步骤4 :将步骤3所得的液体用PH7. 5-9. 0的封闭液体封闭12小时。步骤5 :将步骤4所得的液体洗涤去掉未结合抗体，溶液用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散即得。9.作为优选，步骤I中所用的缓冲液为PBS缓冲液，MES缓冲液，Tris缓冲液中的任何一种缓冲液，且浓度在20-100mmol/L，PH在6. 5-7. 5之间。10.作为优选，步骤I中所用的胶乳可以是羧基化的聚苯乙烯胶乳或者是氨基化的聚苯乙烯胶乳。其孔径在80nm-200nm均可。11.作为优选，步骤I中含有I-(3_ 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺、I-(3_ 二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或者多种。12.作为优选，在步骤2中，去掉溶液I中所含的未反应的物质，采用的是高速冷冻离心机或者超微孔径的过滤膜进行过滤。
13.作为优选，在步骤5中，所用的稳定剂是小牛血清白蛋白，明胶，甘氨酸，脱脂奶粉一种或者几种相混合。14.本发明检测的原理是利用抗原抗体反应,先加入试剂R1，使血清/尿液中的NGAL的位点暴露，当加入抗人的NGAL胶乳颗粒溶液，使溶液中的抗原抗体反应形成不溶于溶液的抗原抗体复合物，从而产生一定的浊度，在人血清/尿液中NGAL的含量在一定的范围内NGAL的含量与浊度成正比。再通过标准曲线进行计算，从而得到NGAL的含量。15.本发明与现有技术相比，具有如下特点I)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度，最低检测能够达到25ng/mL，操作简单，快速，从检测到出结果最多只需要10分钟，甚至更短。2)本发明的试剂盒R2试剂中的抗体乳胶的制备由于采用的化学偶联法，稳定性好，在2-8度至少可以保存12个月。而采用物理吸附法的胶乳抗体试剂，批间差异比较大， 而且稳定性不好。3)本发明试剂盒与进口试剂盒对样品中NGAL含量检测的数据经统计分析，无显著性差异，检测结果可靠，在临床上可以替代进口试剂，大幅降低成本以及检测时间。
图I为本发明实施例I的校准曲线实施案例本发明公开了一种检测NGAL含量的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明内。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围对本文所述的方法和应用进行改动或者适当变更与组合，本实现和应用本发明技术。下面以具体的实施例对本发明做进一步说明。一、NGAL试剂Rl即样品缓冲液的制备
磷酸二氢钠2. 86g/L
磷酸笔二钠28.65g/L
氣化钠6.87g/L
氧化镁0.34g/L
聚乙二醇 600025g/L
叠氮钠2. Og/L
纯水IL四NGAL试剂中校准品的制备I)校准品稀释液
权利要求
1.一种采用胶乳增强免疫比浊法检测人血清中NGAL含量的试剂盒，其特征在于，包含试剂Rl，R2以及校准液；所述试剂RlPH值为7. 2-8. 6的缓冲液，所述试剂R2为抗人NGAL抗体胶乳试剂；所述标准品为含有定量的NGAL的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然NGAL。
2.根据权利I要求所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人NGAL抗体为本公司自己研制的单克隆抗体。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人NGAL抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤。
步骤I :将羧化的胶乳在PH7. O的溶液活化。
步骤2 :洗涤去掉溶液中的碳化二亚胺，加PH7. 5-9. O的缓冲液，加入NGAL抗体，在37度反应4小时。
步骤3 :将步骤2所得的液体用PH7. 5-9. O的固定液固定6小时。
步骤4 :将步骤3所得的液体用PH7. 5-9. O的封闭液体封闭12小时。
步骤5 :将步骤4所得的液体离心去上清液，取沉淀后用含有稳定剂和防腐剂的缓冲液洗涤分散即得。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤I所述溶液为含有I-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、I-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐或N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或者二种。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤3所述溶液含有6-氨基己酸，甘氨酸。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤2所述的洗涤过程为高速冷冻离心机离心或者是用孔径小于IOOnm的中空纤维管状进行过滤。
7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤4所述溶液含有的稳定剂选自甘氨酸，小牛血清，以及吐温-20、曲拉通等表面活性剂以及氯化钠、氯化镁中的一种或者几种。
8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤4所述溶液含有的甘氨酸，小牛血清的浓度为0. 05-0. 5% (质量分数)吐温-20或者曲拉通浓度为0. 005-0. 01 % (体积分数)氯化镁、氯化钠的浓度为0. 05-0. 15% (质量分数)。
全文摘要
本发明涉及一种测定血清中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)含量测定的试剂盒。所要解决的技术问题是提供一种适用于全自动生化分析仪以及特种蛋白仪使用的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量测定试剂盒。技术方案是检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白试剂盒，包括a、试剂R1缓冲液、加速剂、表面活性剂，其余为纯化水；b、试剂R2缓冲液、结合有抗人的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的乳胶微球c、校准品缓冲液，稳定剂，防腐剂以及根据浓度需要确定的一定量的重组人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白纯品，其余为纯化水。通过以上试剂组合，快速的测定血清中NGAL的含量。
文档编号G01N33/68GK102680698SQ20111021529
公开日2012年9月19日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者何仕钊 申请人:南京诺尔曼生物技术有限公司