专利名称：敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法
技术领域：
本发明涉及一种敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法，属于食品安全检测技术领域，特别是一种敌百虫的快速灵敏检测方法。
背景技术：
敌百虫(trichlorphOn，0，0-二甲基_(2，2，2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯)是一种有机磷光谱杀虫剂，1952年由德国拜耳公司合成并开始生产。它具有高效、低毒、低残留、 水溶性好等特点，因此被广泛应用于农林、园艺、畜牧、卫生等方面。也正因为其应用广泛， 滥用现象日趋严重，敌百虫对动物神经系统的损害以及致癌性和致突变性也越来越引起人们的重视。GB 16319-1996规定食品中敌百虫最大残留量不得高于0. 1 mg Kg—1。目前国内外有关食品中敌百虫检测方法大都采用分光光度法、液相色谱法或液相、气相色谱与质谱联用的方法进行定性、定量的检测，但上述几种检测方法所使用的设备价格昂贵且在敌百虫含量较低(痕量)时很难检出，通常需要复杂样品前处理技术。而酶联免疫法虽然具有高灵敏度和低检出限，但是其存在生物抗体制备周期长，保存不当易失活等问题。分子印迹聚合物作为仿生抗体，不但对敌百虫具有高选择性，而且印迹聚合物制备周期短，不存在失活问题，因此作为人工抗体应用于酶联免疫分析，建立仿生免疫吸附检测技术，用于检测农产品及食品中的敌百虫，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服传统的敌百虫检测方法存在的检测时间长、仪器价格昂贵、准确度差、前处理烦琐等缺陷，提供一种敌百虫的快速检测方法。本发明采取的技术方案是
一种敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法，是按以下步骤完成的
1)将敌百虫(溶于乙腈和水)、功能单体(甲基丙烯酸，MAA)和交联剂(二甲基丙烯酸乙二醇酯，EGDMA)按照1:2:2的摩尔比例和一定量偶氮二异丁腈(AIBN)充分混勻，然后96孔酶标板上每孔加入200 μ L上述混合液聚合反应18h ；用1:9 (ν/ν)冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱他以除去敌百虫，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物膜；
2)以分子印迹聚合物膜作为仿生抗体，将96孔酶标板第1行酶标孔设为空白组，每孔只加 200 μ LPBS 溶液(5 倍 PBS =Na2HPO4* 12H20 68. 8 g，NaH2P04 :6. 9 g，NaCl :45 g，加双蒸水至lL，pH值6. 7);第2行酶标孔设为对照组，每孔只加200μ Ll:3000 (ν/ν)辣根过氧化物酶标抗原稀释液；第3-8行酶标孔依次加入100 μ L标样梯度稀释液(5倍稀释)，然后立即加入100 μ Ll 3000辣根过氧化物酶标抗原稀释液；
3)将上述96孔酶标板室温孵育1h后用磷酸盐吐温缓冲液PBST (5倍PBS :200 mL, 10%的Tween-20 :5mL，加双蒸水定容至1L。)洗板五次。再在每孔中加入150 μ L底物液 (底物A :8. 2 g无水醋酸钠，2. 5 g β-环糊精，150 mg过氧化氢脲，加双蒸水至1000 mL, 调pH至5.0，4°C保存；底物B :50 mg 3，3，5，5-四甲基联苯胺溶于5 mL 二甲基亚砜，室温避光保存。使用前15分钟，14. 6 mL底物A和0. 45 mL底物B混合成底物液)，室温下反应
330 min，每孔再加入50 μ L 1.25 mol Γ1硫酸，终止反应；
4)在双波长方式(450-650 nm)下用酶标仪读取96孔酶标板第1_8行吸光度值A ； 按照下列公式计算不同浓度敌百虫对抗原抗体结合反应的抑制率值
权利要求
1. 一种敌百虫仿生免疫吸附检测方法，其特征在于包括以下步骤1)将敌百虫溶于乙腈和水后与功能单体甲基丙烯酸MAA和交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EGDMA按照1:2:2的摩尔比例和偶氮二异丁腈AIBN充分混勻，然后96孔酶标板上每孔加入200 μ L上述混合液聚合反应18h ；用v/vl :9冰乙酸-甲醇溶液连续洗脱他以除去敌百虫，再用100%甲醇洗至中性，干燥后得分子印迹聚合物膜；2)以分子印迹聚合物膜作为仿生抗体，将96孔酶标板第1行酶标孔设为空白组，每孔只加 200 μ LPBS 溶液(5 倍 PBS =Na2HPO4* 12H20 :68. 8 g，NaH2P04 :6. 9 g，NaCl :45 g，加双蒸水至lL，pH值6. 7);第2行酶标孔设为对照组，每孔只加200μ Ll:3000 (ν/ν)辣根过氧化物酶标抗原稀释液；第3-8行酶标孔依次加入100 μ L标样梯度稀释液，所述的标样梯度稀释液浓度分别为50000，10000，2000, 400，80和16 Pg L-1，用PBS稀释，然后立即加入 100 μ Ll 3000辣根过氧化物酶标抗原稀释液；3)将上述96孔酶标板室温孵育1h后用磷酸盐吐温缓冲液PBST (5倍PBS :200 mL, 10%的Tween-20 :5mL，加双蒸水定容至IL ；)洗板五次；再在每孔中加入150 μ L底物液， 室温下反应30 min，每孔再加入50 μ L 1.25 mol L—1硫酸，终止反应；所述的底物液由底物A和底物B组成；所述的底物A为8. 2 g无水醋酸钠，2. 5 g β -环糊精，150 mg过氧化氢脲，加双蒸水至1000 mL,调pH至5. 0，4°C保存；所述的底物B为50 mg 3，3，5，5-四甲基联苯胺溶于5 mL 二甲基亚砜，室温避光保存；使用前15分钟，14. 6 mL底物A和0.45 mL 底物B混合成所述的底物液；4)在双波长方式450-650nm下用酶标仪读取96孔酶标板第1_8行吸光度值A ；按照下列公式计算不同浓度敌百虫对抗原抗体结合反应的抑制率值
全文摘要
本发明涉及一种敌百虫仿生酶联免疫吸附检测方法，是以敌百虫分子印迹聚合物膜作为人工抗体代替生物抗体，利用酶联免疫吸附测定原理，建立对敌百虫具有高灵敏度的仿生酶联免疫吸附检测方法。该方法的最低检出限为7μgL-1，大大低于最高残留限量值，且大大缩短了分析时间(比传统生物免疫分析缩短1.0h)，适用于快速检测敌百虫。本发明制备的仿生抗体可以重复使用50次以上，成本大大降低；并且前处理简单，灵敏度高，实验操作简单，适用于各种食品中敌百虫的快速检测。
文档编号G01N33/543GK102288749SQ201110213929
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者乔旭光, 孟玲, 徐志祥 申请人:山东农业大学