专利名称：一种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物检测领域，特别是涉及分子识别的探针，该探针适于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原的浓度。
背景技术：
1990年Henry等提出了免疫传感器的概念，免疫传感器利用抗原、抗体作为分子识别原件，把抗原-抗体特异性反应过程中产生的信号通过换能器转变成电信号，从而对被测物进行定量分析。与传统的检测技术相比较，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、分析速度快、价格低廉等优势，且易于实现自动化操作，在临床诊断、医疗保健、环境监测、食品安全等领域显示出良好的应用前景。然而已报道的电化学安培传感器在使用中也存在以下不足①多采用“一步法”即采用抗原抗体结合后形成的免疫复合物导致电极表面电流下降，根据下降电流来进行定量，这样就不可避免的难以克服非特异性吸附的影响；②当电极表面的抗原/抗体发生免疫结合后生成物很难除去，电极无法更新，使用多为一次性；③尽管安培免疫传感器有诸多优点，但是面对背景非常复杂的具体检测对象(如血清样品)，往往需通过一定的样品提纯处理后再进行检测，影响了其易用性。所以，上述问题在一定程度上限制了免疫传感器的优势。近年来，基于夹心免疫的纳米修饰电化学传感器由于其卓越的灵敏度引起人们的广泛关注。由于夹心免疫传感器与“一步法”传感器相比具有较高的敏感性和特异性， 制备此类传感器最关键的就在于对二抗的富集。已经有报道采用多种纳米材料对二抗进行富集，如碳纳米球、二氧化硅、纳米Pt、二氧化锰、石墨烯(GS)、碳纳米管(CNTs)、纳米金 (nano-Au)、量子点等。然而这些富集过程繁琐，需要离心才能分离探针和未结合抗体；有研究使用磁性纳米材料(如四氧化三铁、金磁纳米颗粒)等富集抗体，避免了繁琐的离心过程，但是其合成的磁性材料容易团聚，稳定性差，且单个纳米颗粒对抗体的富集效果有限。 袁若等报道了通过抗坏血酸的还原作用形成一种“链状金线”，由多个纳米金原子形成串珠状，由此可大量富集抗体，但是此“链状金线”的合成过程至少需要5天时间，且无磁性，依然需要通过离心来进行分离，探针的分离过程繁琐。因此研发一种新的具有分离简便、富集率高的抗体富集材料并应用到电化学免疫传感器中具有重要的意义。ZrO2作为一种Lewis强酸，通过与蛋白分子上的羧酸和DNA上的磷酸等基团 (Lewis强碱)特异性取向结合，可被直接用来固定酶及抗体。由于抗体和酶包被在极细 (1 2 μ m)且表面积很大的纳米^O2上，标记量显著增加且能较长时间地保持生物活性。 但是单个纳米颗粒对二抗抗体的富集效果有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种二抗探针，该探针适于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原的浓度，且具有富集抗体效果优异和检测限低的优点。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是
—种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针，该探针由小牛胸腺DNA 分子链和附着在小牛胸腺DNA分子链上的纳米球构成，其中所述的纳米球的表面为酶标记的抗体蛋白，内部为磁性纳米颗粒，该颗粒为在四氧化三铁纳米颗粒表面沉积一层无定形氧化锆形成。本发明所述的二抗探针，其中所述的磁性纳米颗粒为公知材料，具体制备方法可参照公开号为CN 101302361A的发明专利申请所述方案进行。本发明所述的二抗探针的制备方法由以下步骤组成1)将磁性纳米颗粒加入pH 7. 0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为磁性纳米粒子0. 1 倍的辣根过氧化物酶标记抗体，4°C下反应6h，分离得到负载抗体的纳米微球；2)将所得到的纳米微球加入pH 7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为所述纳米微球0. 1倍的过氧化物酶和重量为所述纳米微球1. 0倍的牛血清白蛋白，4°C下反应6h，分离得到纳米球；3)将纳米球加入pH 7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为纳米球1.2倍的小牛胸腺 DNA,室温下反应6h，分离得到二抗探针。本发明所述的探针中，首先制备了具有核壳结构的!^e3O4(核)/&02(壳)磁性纳米粒子，该磁性纳米粒子表面含有&02可以和抗体结合，对抗体进行富集。该探针具有以下优点1)磁性材料的使用，使探针具有磁性，在外加磁场的作用下即可实现分离，省去了探针合成过程中繁琐的离心和洗涤过程；幻该探针呈“串珠状”，每个探针分子上具有10个以上磁珠，增加探针表面标记酶抗体浓度，因此提高免疫传感器的敏感性。3) 二氧化锆具有很好的生物相容性，能够长时间保持抗体的活性，使抗体不易失活，使本探针可以一次制备而长期保存。本发明所述的二抗探针可以用来检测抗原浓度，具体检测由以下步骤组成(a)定量标准曲线的制备(1)配制一系列不同浓度的抗原标准品溶液；(2)按相同的体积分别将每一浓度的抗原标准品溶液加入到安培免疫传感器的反应腔中，先37°C温育30min，洗涤；再将所制备的二抗探针滴加在安培免疫传感器的反应腔中，37°C温育30min，洗涤；然后，反应腔中加入含有浓度为5mmol/L过氧化尿溶液和lmmol/ L邻苯二酚的0. lmol/L磷酸盐缓冲溶液，反应;3min后，在电化学工作站上用循环伏安法 (CV)或示差脉冲伏安法(DPV)记录还原峰电流；(3)将步骤⑵所得到的抗原标准品溶液的浓度及其对应的还原峰电流的一组数据，以还原峰电流对抗原标准品溶液浓度进行线性回归便得到，还原峰电流与抗原标准品溶液浓度对应关系的直线方程，即标准曲线；(b)样品的检测将待测样品加入到安培免疫传感器的反应腔中，以步骤(a)同样的方法和反应条件采用循环伏安法(CV)记录还原峰电流，然后，将检测样品得到的还原峰电流值代入步骤 (a)所得到的直线方程中即可算出待测样品中抗原的浓度。上述检测抗原浓度的方法中所使用的安培免疫传感器可根据待测抗原按公知的方法自行制备。本发明所述的二抗探针适用于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原
4的浓度，由于本发明所述的二抗探针具有一维“串珠状”结构，极大的提高探针表面二抗的负载量，由于电化学免疫传感器的线性范围和灵敏度与二抗富集效果正相关，因此本发明所述检测抗原浓度的方法具有线性范围宽，检测限低的优点。
图1是二抗探针的检测原理及二抗探针合成过程示意图。右侧方框内是二抗探针的合成过程示意图。图2是合成的探针利用外加磁场进行分离结果图。图3是下述实施例1所合成的二抗探针的透射电镜图；图4是不同浓度AFP检测时的电化学CV响应图，其内插图为测定标准曲线。图5是不同浓度HIV pM检测时的电化学DPV响应图，其内插图为测定标准曲线。
具体实施例方式实施例11、二抗探针的制备和表征(1)磁性纳米颗粒的制备磁性纳米颗粒的制备具体制备方法可参照公开号为CN 101302361A的发明专利
申请°磁性纳米颗粒的表征采用X射线荧光光谱(XRF)对!^e3O4AiO2进行表征，出现了 Zr-K0 (17. 8keV)、Zr-Ka (15. 8keV)、Zr-L0 (2. Ike)、Zr-La (2. OkeV)峰和 Fe-K0 (7. IKeV)、 Fe-Ka (6. 4keV)峰，说明该磁性微粒中存在rLx和！^元素。(2)负载抗体的纳米微球的制备和表征负载抗体的纳米微球的制备将IOmg磁性纳米粒子分散在5mL pH 7. 0磷酸盐缓冲液中，加入Img辣根过氧化物标记的甲胎蛋白二抗(HRP-anti-AFP)，搅拌他后，外加磁性条件下磁性分离，得到负载抗体的纳米微球。(3)纳米球的制备将IOmg负载抗体的纳米微球分散在5mL的pH 7. 0磷酸盐缓冲液中，依次加入5mg 辣根过氧化物酶、IOmg牛血清白蛋白(BSA)，4°C搅拌他，利用外加磁场分离磁性纳米颗粒， 洗涤，得到纳米球。(4) 二抗探针的制备将IOmg纳米球分散在5mL的pH 7. 0磷酸盐缓冲液中，加入12mg小牛胸腺DNA，室温下搅拌他，磁性分离即获得二抗探针。二抗探针的表征采用透射电镜对探针制备过程进行了表征(图幻。由图3可见二抗探针具有一维“珠链状”线性结构。采用X射线荧光光谱(测定元素范围为9F 5^)对二抗探针进行了表征，显示了 Zr-ka 峰 2. lkeV、Fe-ka 峰 6. 4keV、P_ka 峰 1. 13keV 和 S_k α 峰 2. 3keV，由于 DNA 含有大量磷酸基团，故而P峰的出现进一步说明了磁性纳米粒子表面包覆了 DNA。测定磁性纳米颗粒与DNA作用后的紫外光谱，发现DNA特征吸收峰由520nm红移至524nm，说明DNA与磁性纳米颗粒子发生了相互作用，使吸收峰发生红移。由图2可见，在0. 3mTde外磁场作用下二抗探针磁性探针具有良好的超顺磁性。2.安培免疫传感器的制备对商品化的丝网印刷电极进行修饰(a)石墨烯/壳聚糖(GS/CS)在丝网印刷电极表面修饰成膜在5mL离心管中加入2mL pH5. 0的0. 2%的壳聚糖(CS)醋酸溶液和Img的GS，混合得到悬浊液；将5mL悬浊液滴在丝网印刷电极中的工作电极表面，室温下自然干燥，然后用pH7. 0磷酸盐缓冲溶液洗涤除去结合不牢固纳米颗粒。(b)采用电流时间曲线法在丝网印刷电极的工作电极表面直接电镀金将20 μ L 的HAuCl4滴加在工作电极表面，施加-0. 2V恒电位30S。电镀后用PBS充分洗涤。(c)在丝网印刷电极的反应腔中加入10 μ L AFP单克隆一抗后，丝网印刷电极放入4°C冰箱低温温育12小时后用PBS充分洗涤未结合和结合不牢固抗体。(d)用3mg/mL牛血清白蛋白(BSA)封闭未结合电极表面未结合活性位点，得到安培免疫传感器。3.抗原浓度的检测对抗原的检测过程是利用固定好一抗的传感器依次与样品和制备的二抗探针进行温育，若样品中含有所待测抗原，则制备的二抗探针通过免疫复合物的形式固定在电极表面，加入底物后可以催化底物发生氧化还原反应，产生电信号。其检测原理如附图1.(1)定量标准曲线制备(a)将 AFP 抗原溶液标准品稀释成 0. 01ng/ml，0. 05ng/ml,0. lng/ml，lng/ml，5ng/ ml, 10ng/ml,50ng/ml, lOOng/ml, 150ng/ml，200ng/ml，在安培免疫传感器的反应腔中分别加入10 μ L不同浓度的AFP抗原溶液标准品，并在37°C下温育30min。反应完后用PBS小心洗去未反应抗原。(b)将步骤1合成的二抗探针配成lmg/ml悬液，在安培免疫传感器的反应腔中滴加IOmL 二抗探针悬液，37°C温育30min，PBS小心洗涤；(c)在安培免疫传感器的反应腔中加入含有浓度为5mmol/L过氧化尿溶液和 lmmol/L邻苯二酚的0. lmol/L磷酸盐缓冲溶液反应^iin ；在电化学工作站上，用循环伏安法(CV)记录还原峰电流I (扫描范围从-0. 3V至-0. 8V)。(d)步骤(C)所得到还原峰电流与对应抗原标准品溶液的浓度一组数据，采用平均斜率法以还原峰电流对抗原标准品溶液浓度进行线性回归分析，便得到还原峰电流与抗原标准品溶液浓度对应关系的直线方程，即标准曲线。CV还原峰电流和AFP抗原浓度数值见图4内插图。线性方程为IogI = 0. 661og[CAFP]-5. 15。将待测样品加入到安培免疫传感器的反应腔中，以步骤(1)同样的方法和反应条件采用循环伏安法(CV)记录还原峰电流，然后，将检测样品得到的还原峰电流值代入步骤 (a)所得到的直线方程中即可算出待测样品中抗原的浓度。采用10个空白样品进行检测， 计算平均值X和标准差s，以作为检测限。在本例中，对AFP的检测范围为0. 01 200ng/mL，检测限为4pg/mL。实施例2 (对比实验1)一、实验材料1.抗原和抗体:AFP抗原标准品、甲胎蛋白单克隆一抗(anti-AFP)、辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白多克隆抗体(HRP-anti-AFP)和AFP ELISA试剂盒均购置郑州博赛生物技术股份有限公司。
申请°
2.安培免疫传感器按实施例1所述方法制得。
3.二抗探针
3. 1、样品按实施例1所述方法制得的二抗探针。 3. 2、对照品对照品1
(1)磁性纳米颗粒的制备
磁性纳米颗粒的制备具体制备方法可参照公开号为CN 101302361A的发明专利
(2)负载抗体的纳米微球的制备和表征
负载抗体的纳米微球的制备将IOmg磁性纳米粒子分散在5mL pH 7. 0磷酸盐缓冲液中，加入Img辣根过氧化物标记的甲胎蛋白二抗(HRP-anti-AFP)，搅拌他后，外加磁场分离未结合的抗体，外加磁性条件下磁性分离，得到负载抗体的纳米微球。
(3)磁性探针的制备 将IOmg负载抗体的纳米微球分散在5mL的pH 7. 0磷酸盐缓冲液中，依次加入5mg 辣根过氧化物酶、IOmg牛血清白蛋白(BSA)，4°C搅拌他，利用外加磁场分离磁性纳米颗粒， 洗涤，得到磁性探针用HRP-anti-AFP-ZMPs探针表示。对照品2 参照下述文献报告的方法制备获得Tang J，Su B, Tang D，et al.Conductive carbon nanoparticles-based electrochemical immunosensor with enhanced sensitivity for[alpha]-fetoprotein using irregular-shaped gold nanoparticles-labeled enzyme-linked antibodies as signal improvement[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2010, 25 (12) :2657-26620 所得二抗探针用代号 HRP-anti-AFP-GNGs 表示。对照品3 :参照下述文献报告的方法制备获得Zhuo Y，Yi W J, Lian W B， et al. Ultrasensitive electrochemical strategy for NT-proBNP detection with gold nanochains and horseradish peroxidase complex amplification[J]. Biosens Bioelectron. 2011,26(5) :2188_2193。所得二抗探针用代号 AuNCs-HRP-Ab2 表示。对照品4:以AFP ELISA试剂盒(购自郑州博赛生物技术股份有限公司)中的辣根过氧化物酶标记的AFP多克隆抗作为对照品4。以HRP-anti-AFP表示。二、实验方法1.实验分为5组，每组中实验除加入的二抗探针不同外，其余操作相同。2.实验过程2.1定量标准曲线制备(a)将 AFP 抗原溶液标准品稀释成 0. 01ng/ml，0. 05ng/ml,0. lng/ml，lng/ml，5ng/ ml, 10ng/ml,50ng/ml, lOOng/ml, 150ng/ml，200ng/ml，将制备的安培免疫传感器分为 5 组， 每组含10个传感器，安培免疫传感器的反应腔中分别加入10 μ L不同浓度的AFP抗原溶液标准品，并在37°C下温育30min。反应完后用PBS小心洗去未反应抗原。(b)将本例中制备的样品和对照品配合成的配成lmg/ml悬液，组1中安培免疫传感器的反应腔中滴加10 μ L样品，组2 组5传感器的反应腔中分别滴加加对照品1 4 探针悬液10 μ L，37°C温育30min。(c)在安培免疫传感器的反应腔中加入含有浓度为5mmol/L过氧化尿溶液和 lmmol/L邻苯二酚的0. lmol/L磷酸盐缓冲溶液反应^iin ；在电化学工作站上，用循环伏安法(CV)记录还原峰电流I (扫描范围从-0. 3V至-0. 8V)。(d)步骤(C)所得到还原峰电流与对应抗原标准品溶液的浓度一组数据，采用平均斜率法以还原峰电流对抗原标准品溶液浓度进行线性回归分析，便得到还原峰电流与抗原标准品溶液浓度对应关系的直线方程，即标准曲线；采用10个空白标本进行检测，计算平均值X和标准差S，以I+3S作为检测限。表1是不同二抗探针检测AFP抗原效果的比较，由表1可以得出，本申请所制备的二抗探针进行电化学检测时，与其他方法制备的二抗探针相比具有线性范围宽、灵敏度高的优点。表1不同二抗探针检测AFP抗原的效果比较
权利要求
1.一种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针，该探针由小牛胸腺DNA分子链和附着在小牛胸腺DNA分子链上的纳米球构成，其中所述的纳米球的表面为酶标记的抗体蛋白，内部为磁性纳米颗粒，该颗粒为在四氧化三铁纳米颗粒表面沉积一层无定形氧化锆形成。
2.权利要求1所述的二抗探针的制备方法，该方法由以下步骤组成1)将磁性纳米颗粒加入PH7. 0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为磁性纳米粒子0. 1倍的辣根过氧化物酶标记抗体，4°C下反应6h，分离得到负载抗体的纳米微球；2)将所得到的纳米微球加入pH7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为所述纳米微球0. 1 倍的过氧化物酶和重量为所述纳米微球1.0倍的牛血清白蛋白，4°C下反应6h，分离得到纳米球；3)将纳米球加入pH7.0磷酸盐缓冲液中，再加入重量为纳米球1.2倍的小牛胸腺 DNA,室温下反应6h，分离得到二抗探针。
3.一种采用权利要求1所述的二抗探针测量抗原浓度的方法，该方法由以下步骤组成(a)定量标准曲线的制备(1)配制一系列不同浓度的抗原标准品溶液；(2)按相同的体积分别将每一浓度的抗原标准品溶液加入到安培免疫传感器的反应腔中，先37°C温育30min ；再将所制备的二抗探针滴加在安培免疫传感器的工作电极表面， 37°C温育30min ；然后，反应腔中加入含有浓度为5mmol/L过氧化尿溶液和lmmol/L邻苯二酚的0. lmol/L磷酸盐缓冲溶液，反应;3min后，在电化学工作站上用循环伏安法(CV)或者示差脉冲伏安法(DPV)记录还原峰电流；(3)将步骤( 所得到的抗原标准品溶液的浓度及其对应的还原峰电流的一组数据， 以还原峰电流对抗原标准品溶液浓度进行线性回归便得到，还原峰电流与抗原标准品溶液浓度对应关系的直线方程，即标准曲线；(b)样品的检测将待测样品加入到安培免疫传感器的反应腔中，以步骤(a)同样的方法和反应条件采用循环伏安法(CV)记录还原峰电流，然后，将检测样品得到的还原峰电流值代入步骤(a) 所得到的直线方程中即可算出待测样品中抗原的浓度。
全文摘要
本发明涉及生物监测领域，具体涉及一种采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应的二抗探针，其中所述的二抗探针由小牛胸腺DNA分子链和附着在小牛胸腺DNA分子链上的纳米球构成，其中所述的纳米球的表面为酶标记的抗体蛋白，内部为磁性纳米颗粒，该颗粒为在四氧化三铁纳米颗粒表面沉积一层无定形氧化锆形成。本发明所述的二抗探针适于采用安培免疫传感器进行夹心免疫反应测量抗原的浓度，且具有检测线性范围宽，检测极限低的优点。
文档编号G01N33/53GK102253194SQ20111017413
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月25日 优先权日2011年6月25日
发明者巫远招, 干宁, 李博, 王前, 贾立永, 郑磊 申请人:南方医科大学