专利名称：一种基于免疫磁珠富集的甲型流感病毒检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物技术应用领域，更具体涉及一种甲型Hmi流感病毒的检测试剂盒，同时还涉及一种甲型Hmi流感病毒的检测方法，可应用于各级疾病预防控制机构，流感监测网络实验室，哨点医院等对发热病人鼻咽拭子等标本的甲型Hmi流感病毒的检测和监测。
背景技术：
2009年3月墨西哥爆发“人感染猪流感”疫情，造成人员死亡。研究发现，此次疫情的病原为变异后的新型甲型Hmi病毒，包括猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。该病毒具有较强的传染性、可通过近距离飞沫和接触传播。临床主要表现为流感样症状，少数病例病情重，进展迅速，可出现病毒性肺炎，合并呼吸衰竭、多脏器功能损伤， 严重者导致死亡。目前，甲型Hmi流感疫情已在全球较大范围内传播，这场持续了一年多的疫情造成约1. 85万人死亡，出现疫情的国家和地区达到了 214个。截止至2010年3月 31日，中国31个省份累计报告甲型Hmi流感确诊病例12. 7余万例，，死亡病例800例。已有的甲型流感病毒监测方法主要包括病毒分离培养、病毒核酸检测和血清学检查。其中病毒分离培养费时费力，无法满足疾病流行期间同时处理大量标本的需要，而甲型流感病毒特异性中和抗体在体内的产生大约需要1-2周，因此血清学的检查无法实现早起诊断的目的。目前最为常见的诊断方法是病毒核酸检测，通常是用RT-PCR法在检测呼吸道标本，尽管该方法灵敏度高，检测时间短，但是需要昂贵的实时定量PCR仪，很难在偏远、贫穷的地市普及。近年来发展的环介导等温扩增技术在病毒检测方面已发挥较大的优势，主要体现在可操作性、设备要求等方面。然而目前所有的核酸检测方法都需要借助商业化试剂盒提纯临床样本中的核酸后才能进行体外扩增，否则很容易产生假阴性，降低弱阳性临床标本的检出率。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种甲型Hmi流感病毒的检测试剂盒，该试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，可广泛应用于各级疾病预防控制机构，流感监测网络实验室，哨点医院等对发热病人鼻咽拭子等标本的甲型Hmi流感病毒的检测和监测。本发明的另一个目的是在于提供了一种甲型Hmi流感病毒的检测方法，该方法无需单独的核酸提纯步骤，借助一个水浴锅，即可实现复杂样本中甲型Hmi流感病毒的快速、高灵敏检测。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
一种甲型Hmi流感病毒的检测试剂盒，试剂盒包括以下部分 用于特异性富集检测样本中甲型Hmi流感病毒的免疫磁珠及所需溶液；用于扩增检测样本中甲型Hmi流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。具体组分如下
A、免疫富集反应体系组分标记甲型Hmi流感病毒特异性单克隆抗体的磁珠(直径100-300 nm ；工作稀释浓度1 10-1 20)；0. 1 M 磷酸盐缓冲液(PBS) pH 7. 2- pH 7. 4 ；无菌超纯水
B、环介导的等温核酸扩增体系组分Bst DNA聚合酶(8 U/μΙ, New England Biolabs)、10XBst DNA 聚合酶缓冲液(New England Biolabs)、AMV 反转录酶(10 U/μΙ, Invitrogen)> Calcein (0. 5 mM, Sigma-Aldrich )、 dNTP (10 mM , Takara)、Betaine (250 mM, Sigma-Aldrich),MgSO4 (150 mM,国产分析纯)10X 引物混合物(F3: 2 μΜ;Β3: 2 μΜ ；FIP: 16 μΜ ；ΒΙΡ: 16 μΜ ；Loop-I 8 μΜ ；Loop-2: 80 μΜ)。试剂盒组分制备方法
Α、 抗体的制备采用标准B淋巴细胞杂交瘤技术[Kohler G，Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495 - 497]制备抗甲型Hmi流感病毒的单克隆抗体，并用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对制备出的抗体进行纯化[Perosa F, Carbone R, Ferrone S, Dammacco F (1990) Purification of human imunoglobulins by sequential precipitation with caprylic acid and ammonium sulphate. J Immunol Methods 128: 9 - 16.]；
B、免疫磁珠的制备选用直径为100-300 nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将抗对甲型Hmi流感病毒的单克隆抗体共价交联到超顺磁颗粒上，交联后的超顺磁颗粒用BSA封闭；
C、设计甲型Hmi流感病毒的特异性引物，用于环介导的等温(65°C)扩增反应，包括两条外引物(F3、B3)、两条内引物(FIP、BIP)以及两条环结合引物(Loopl、Loop2)，序列分别如下
F3 :CCGGAGACAAAATAACAT
B3 GTATATTCTGAAATGGGAG
FIP GATCGAGCATTTCCTTCCAAAGCATCTGGAAATCTAGTGG BIP TCAGTACACCAGTCCACGATTGCTGTTTATAGCTCCCTTG Loopl: GCAATACAACTTGTCAAACACC Loop2 TGCGAATGCATATCTCGGT 本发明的试剂盒工作原理本试剂盒采用免疫磁珠富集与环介导等温扩增技术相结合的方法检测具有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒基因片段的新型甲型流感病毒 (Hmi)，并用于该甲型流感病毒感染的辅助诊断。具体是将标记甲型Hmi流感病毒特异性单克隆抗体的磁珠与待检测样品孵育反应，若样品中含有甲型Hmi流感病毒，则病毒粒子会与抗体结合，吸附于免疫磁珠表面，经磁力架分离、热裂解后，其核酸在65°C恒温条件下可被特异性扩增，扩增产物呈现出肉眼可观测的淡绿色荧光及白色沉淀。反之，则无荧光和白色沉淀的产生。一种甲型Hmi流感病毒的检测方法，其步骤是
1)免疫富集利用标记甲型Hmi流感病毒特异性单克隆抗体的磁珠富集标本中的甲型Hmi流感病毒，富集后产物经PBS缓冲液洗涤1-2次，用无菌水重悬待用。2)热裂解上述产物、经磁力架分离，将含有病毒核酸的上清作为环介导等温扩增反应的模板。
3)环介导等温扩增反应建立环介导等温扩增反应体系，65°C孵育30 min。4)结果判定肉眼观察到白色沉淀和有绿色荧光产生即为阳性，反之则为阴性本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
本发明通过将免疫磁珠富集与环介导等温扩增技术相结合，检测了 96份鼻咽拭子临床标本(80份阳性标本、15份阴性标本，1份空白标本)，检测过程耗时1 h，准确率100%。 本发明省略了单独的商业化试剂盒提取核酸步骤，仅借助水浴锅即可在1小时内特异、高灵敏检测出鼻咽拭子等复杂样品中的甲型Hmi流感病毒，其检测结果可通过肉眼观察颜色变化和白色沉淀产生来判读。因此，本发明与现有甲型Hmi流感病毒检测方法相比，具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，可广泛应用于各级疾病预防控制机构，流感 监测网络实验室，哨点医院等对发热病人鼻咽拭子等标本的甲型Hmi流感病毒的检测和监测。
具体实施例方式实施例1
一种甲型Hmi流感病毒的检测试剂盒，使用本试剂盒检测了 96份鼻咽拭子临床标本 (80份阳性标本、15份阴性标本，1份空白标本)，检测过程耗时1 h，准确率100%。本试剂盒包括用于特异性富集检测样本中甲型Hmi流感病毒的免疫富集反应体系；用于扩增检测样本中甲型Hmi流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系，具体如下
A、免疫富集反应体系组分标记甲型Hmi流感病毒特异性单克隆抗体的磁珠(直径 100-300 nm ；工作稀释浓度1 10-1 20)；0. 1 M 磷酸盐缓冲液(PBS) pH 7. 2- pH 7. 4 ；无菌超纯水
B、环介导的等温核酸扩增体系组分BstDNA聚合酶(8 U/μΙ, New England Biolabs)、10XBst DNA 聚合酶缓冲液(New England Biolabs)、AMV 反转录酶(10 U/μΙ, Invitrogen)> Calcein (0. 5 mM, Sigma-Aldrich )、 dNTP (10 mM , Takara)、Betaine (250 mM, Sigma-Aldrich),MgSO4 (150 mM,国产分析纯)10X 引物混合物(F3: 2 μΜ;Β3: 2 μΜ ；FIP: 16 μΜ ；ΒΙΡ: 16 μΜ ；Loop-I 8 μΜ ；Loop-2: 8 μΜ)。试剂盒组分制备方法
Α、抗体的制备采用标准B淋巴细胞杂交瘤技术[Kohler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495 - 497]制备两种抗甲型Hmi流感病毒单克隆抗体，并用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对制备出的抗体进行纯化[Perosa F, Carbone R, Ferrone S, Dammacco F (1990) Purification of human imunoglobulins by sequential precipitation with caprylic acid and ammonium sulphate. J Immunol Methods 128: 9 - 16.]；
B、免疫磁珠的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将抗甲型Hmi流感病毒的单克隆抗体共价交联到超顺磁颗粒上，交联后的超顺磁颗粒用BSA封闭；
C、设计甲型Hmi流感病毒的特异性引物，用于环介导的等温(65°C)扩增反应，包括两条外引物(F3、B3)、两条内引物(FIP、BIP)以及两条环结合引物(Loopl、Loop2)，序列分别如下
F3 :CCGGAGACAAAATAACAT
B3 GTATATTCTGAAATGGGAG
FIP GATCGAGCATTTCCTTCCAAAGCATCTGGAAATCTAGTGG BIP TCAGTACACCAGTCCACGATTGCTGTTTATAGCTCCCTTG Loopl: GCAATACAACTTGTCAAACACC Loop2 TGCGAATGCATATCTCGGT 本试剂盒检测样品具体操作如下
1、将100—200 μ 的待检测样品与5_10 μ 免疫磁珠混合，37° C孵育25 min。2、磁力架分离，弃上清，用200 ul PBS洗涤1_2次。3、磁力架分离，弃上清，用20 ul无菌水重悬，95°C水浴3-5 min。4、磁力架分离，取上清，作为核酸扩增模板待用。5、建立扩增体系Bst DNA聚合酶(8 U/μΙ) 1 μ UOXBst DNA聚合酶缓冲液 2.5 μ 、AMV 反转录酶(10 U/μΙ) 1 μ 、Calcein (0.5 mM) 1 μ 、dNTP (10 mM) 2.5 μ 、 Betaine (250 mM)8 μ ,MgSO4 (150 mM)l μ1、10Χ 引物混合物(F3: 2 μΜ;Β3: 2 μΜ ；FIP: 16 μΜ ；ΒΙΡ: 16 μΜ ；Loop-I 8 μΜ ；Loop-2: 8 μΜ) 2. 5 μ ，加入核酸模板并定容至 25 μ 体系。6、65°C 水浴孵育 30 min,
7、结果判定肉眼观察到白色沉淀和有绿色荧光产生即为阳性，反之则为阴性。实施例2
一种甲型Hmi流感病毒的检测方法，其步骤是
A、抗体制备采用标准B淋巴细胞杂交瘤技术[KohlerG, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495 - 497]制备甲型Hmi病毒特异性单克隆抗体，并用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对制备出的抗体进行纯化[Perosa F, Carbone R, Ferrone S, Dammacco F (1990) Purification of human imunoglobulins by sequential precipitation with caprylic acid and ammonium sulphate. J Immunol Methods 128: 9 - 16.]
B、免疫磁珠的制备使用含0.1% (体积/体积)Tween20的50 mM、pH4. 7的醋酸钠缓冲液洗涤磁珠，加入EDC和NHS使终浓度均为20 mM,室温反应一小时，洗涤磁珠，加入甲型 HlNl病毒特异性单克隆抗体使其与磁珠含有的羧基的数量比例是1:300到1:400，37°C摇床120 rpm反应2小时，洗涤磁珠，加入含有5% (质量/体积)BSA的0. 02 M、pH7. 2的PBS， 37°C摇床120rpm封闭2小时，使用含0. 1% (体积/体积)Tween20的50 mM、pH4. 7的醋酸钠缓冲液反复洗涤磁珠，并将抗体偶联磁珠转移至含1% (质量/体积)PVP、1% (质量/体积)BSA、0. 5% (体积/体积)Tween20,5% (质量/体积)蔗糖的50 mM pH8. 5硼酸缓冲液中保存，置于4°C备用。C、设计如下引物，并于上海生工生物工程有限公司合成、纯化。F3 :CCGGAGACAAAATAACAT B3 GTATATTCTGAAATGGGAGFIP: GATCGAGCATTTCCTTCCAAAGCATCTGGAAATCTAGTGG BIP TCAGTACACCAGTCCACGATTGCTGTTTATAGCTCCCTTG Loopl GCAATACAACTTGTCAAACACC Loop2 TGCGAATGCATATCTCGGT D、免疫富集反应将100— 200 μ 的待检测样品与5_10 μ 免疫磁珠混合，37°C孵育 25 min，磁力架分离，弃上清，用200 ul PBS缓冲液(0. 1M)洗涤1_2次；磁力架分离，弃上清，用20 ul无菌水重悬。
E、热裂解95°C水浴3-5 min，磁力架分离，取上清，作为核酸扩增模板待用。F、建立扩增体系Bst DNA聚合酶(8 U/μΙ) 1 μ UOXBst DNA聚合酶缓冲液 2.5 μ 、AMV 反转录酶(10 U/μΙ) 1 μ 、Calcein (0.5 mM) 1 μ 、dNTP (10 mM) 2.5 μ 、 Betaine (250 mM)8 μ ,MgSO4 (150 mM)l μ1、10Χ 引物混合物(F3: 2 μΜ;Β3: 2 μΜ ；FIP: 16 μΜ ；ΒΙΡ: 16 μΜ ；Loop-I 8 μΜ ；Loop-2: 8 μΜ) 2. 5 μ ，加入核酸模板并定容至 25 μ 体系。G、65。C 水浴孵育 30 min,
H、结果判定肉眼观察到白色沉淀和有绿色荧光产生即为阳性，反之则为阴性。一种甲型Hmi流感病毒的检测方法，其实验结果是检测了 96份鼻咽拭子临床标本(80份阳性标本、15份阴性标本，1份空白标本)，检测过程耗时1 h，准确率100%。
权利要求
1. 一种甲型Hmi流感病毒的检测试剂盒，其特征在于Α、免疫富集反应体系组分标记甲型Hmi流感病毒特异性单克隆抗体的免疫磁珠，直径:100-300 nm ；工作稀释浓度=1:10-1:20 ；0. 1 M磷酸盐缓冲液pH 7. 2- pH 7. 4 ；无菌超纯水；B、环介导的等温核酸扩增体系组分BstDNA聚合酶、IOXBst DNA聚合酶缓冲液、AMV 反转录酶、Calcein、dNTP、Betaine、MgS04、10X 引物混合物F3: 2 μΜ;Β3: 2 μΜ ；FIP: 16 μΜ ；ΒΙΡ: 16 μΜ ；Loop-I 8 μΜ ；Loop-2: 80 μΜ ；C、抗体的制备采用标准B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗甲型Hmi流感病毒的单克隆抗体，并用正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对制备出的抗体进行纯化；D、免疫磁珠的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺和琥珀酰亚胺共价偶联的方式将甲型Hmi流感病毒单克隆抗体共价交联到超顺磁颗粒上，交联后的超顺磁颗粒用BSA封闭；E、设计甲型Hmi流感病毒的特异性引物，用于环介导的等温65°C扩增反应，包括两条外引物F3、B3、两条内引物FIP、BIP以及两条环结合引物Loopl、Loop2，序列分别如下F3 :CCGGAGACAAAATAACAT ；B3 GTATATTCTGAAATGGGAG ；FIP: GATCGAGCATTTCCTTCCAAAGCATCTGGAAATCTAGTGG ； BIP: TCAGTACACCAGTCCACGATTGCTGTTTATAGCTCCCTTG ； Loopl: GCAATACAACTTGTCAAACACC ； Loop2 TGCGAATGCATATCTCGGT。
2.权利要求1所述的一种甲型Hmi流感病毒的检测方法，其步骤是A、免疫富集利用标记甲型Hmi流感病毒特异性单克隆抗体的磁珠富集标本中的甲型Hmi流感病毒，富集后产物经PBS缓冲液洗涤1-2次，用无菌水重悬待用；B、热裂解上述产物、经磁力架分离，将含有病毒核酸的上清作为环介导等温扩增反应的模板；C、环介导等温扩增反应建立环介导等温扩增反应体系，65°C孵育30min ；D、结果判定肉眼观察到白色沉淀和有绿色荧光产生即为阳性，反之则为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种基于免疫磁珠富集的甲型流感病毒检测试剂盒及方法，试剂盒包括A、免疫富集反应体系组分；B、环介导的等温核酸扩增体系组分；C、抗体的制备；D、免疫磁珠的制备；E、设计甲型H1N1流感病毒的特异性引物，用于环介导的等温65oC扩增反应。检测方法是a、免疫富集；b、热裂解上述产物、经磁力架分离，将含有病毒核酸的上清作为环介导等温扩增反应的模板；c、环介导等温扩增反应；d、结果判定。该试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，可广泛应用于各级疾病预防控制机构，流感监测网络实验室，哨点医院等对发热病人鼻咽拭子等标本的甲型H1N1流感病毒的检测和监测。
文档编号G01N33/577GK102230938SQ201110168589
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者危宏平, 张先恩, 张治平, 王殿冰 申请人:中国科学院武汉病毒研究所