专利名称：胱氨酸蛋白酶抑制剂c检测试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。
背景技术：
肌酐，到目前为止被广泛作为肾小球滤过滤(GFR)的标志物，它是一种由肌肉产生的小分子物质，因此肌酐形成和分泌的速率和机体内肌肉含量密切相关。众所周知，在一个种群中，个体的肌肉含量是相对不同的，老年人比青壮年的肌肉含量要低，许多病人在他们疾病的进程存在肌肉含量的损失，孩子的肌肉含量也与成人不同，男人的肌肉平均含量要比女人高。当血清肌酐浓度作为肾小球滤过率标志物时，检测到的血清肌酐值要比实际低50%。而且饮食能够显著影响血清肌酐水平，特别是富含蛋白质的饮食。因此，血清肌酐浓度作为肾小球滤过率标志物时，受影响的因素很多，不易检测准确。目前，检测肌酐的方法中，有“金标法”和“静脉内注射放射性物质的方法”两种，但是“金标法” 一般存在检测的可靠性差的不足；而采用在静脉内注射放射性物质的方法目前虽然受到普遍欢迎，但是，该方法昂贵、耗时，并且必须要进行注射、给患者带来痛苦。有文献报道，胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cyS-c，分子量为13kD)，能够滤过正常的肾小球，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物，采用简单的透射比浊法检测血清中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量可以代替目前复杂的肾小球滤过率测定方法。应用最多的就是胶乳增强免疫透射比浊法，其基本原理是将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。而胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体包被到胶乳上，一般可以采用物理吸附法和化学偶联法，采用物理吸附法得到的致敏胶乳颗粒稳定性较化学偶联法要差，抗体容易从胶乳颗粒上脱落下来；而且用物理吸附法得到的胶乳，有可能受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，IgM.IgG型RF可以与包被在胶乳上的抗体的Fc段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假性升高。嗜异性抗体可与啮齿类动物IgG的Fc段结合，这样嗜异性抗体可与包被在胶乳上的抗体结合，造成检测结果假阳性或假性升高。目前采用的化学偶联法多为随机偶联法，因随机偶联的抗体随机偶联到抗体不同部位，将导致抗体损失结合力；所以，完全随机偶联会损失抗体大部分结合力，增加了抗体用量和生产成本。同时，若将上述方法得到的致敏胶乳颗粒用于检测试剂盒中，会造成特异性差、准确性低、抗干扰能力弱或生产成本高的缺陷。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂Rl为适当的缓冲液；所述的试剂 R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。本发明上述试剂盒中Rl与R2的容积比为5 1。本发明所述的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸 (MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。本发明上述试剂盒中Rl所用的缓冲液与配置R2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种任意搭配均可。本发明上面所述的聚苯乙烯胶乳颗粒(该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品)， 其平均粒径在0. 01 1. 5 μ m之间，粒径小于0. 01 μ m时，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，结果很难达到试验敏感度要求，在制备试剂的时候，需要花费过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于1. 5μπι的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的光密度变化超过了检测限，结果很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变。所选择的颗粒粒径最好是介于0. 05 0. 5 μ m之间。本发明上面所述的抗体包括但不限于多克隆抗体(人、羊、兔、鸡)及单克隆抗体。在本发明所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒中，还包括胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品；进一步的，所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量为 0 8mg/L。本发明所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2制备步骤包括(1)胶乳颗粒的激活在带有羧基的胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，混合反应后加入己二酸二酰胼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；(2)抗体的氧化用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；(3)抗体与胶乳颗粒的偶联将步骤⑴激活的胶乳颗粒和步骤⑵氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球。本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料) =0. 5 5 100(重量比)；己二酸二酰胼胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)=50 250 100(重量比)；步骤O)中高碘酸钠胶乳(带有羧基的胶乳颗粒原料)=0.5 3 100(重量比)；步骤(3)中抗体激活的胶乳颗粒=2 22 100 (重量比)，葡萄糖激活的胶乳颗粒=(25 50) 100。加入的是原料胶乳，可以改成抗体胶乳。都是重量比本发明所述胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒， 与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，血清中的胱氨酸蛋白酶抑制剂C与结合在胶乳颗粒表面的抗人胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成聚集；在546nm，700nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量。本发明的优点和有益效果1.本发明的试剂盒是一种灵敏度高、特异性好、准确性高、抗干扰能力强及生产成本低的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒。2.本发明试剂盒中的试剂R2制备是一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于， 本发明采用定向偶联法将胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体包被到胶乳颗粒上；本发明将抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到胶乳颗粒上，不会发生类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰所导致的检测结果假阳性或假性升高，该方法定向偶联的抗体偶联到胶乳颗粒上后，其抗原结合位点指向流动相，抗体偶联部位为Fc片段，因此不会发生抗体结合力损失的情况，保持了抗体的活力，大大减少了抗体的用量，降低了生产成本。3.本发明试剂盒中的R2制备采用定向化学偶联法，得到的致敏胶乳颗粒稳定性较好，抗体不会从胶乳颗粒上脱落，而且由于化学偶联过程中，Fc段发生了结构上的改变， 因此不会受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性。
具体实施例方式下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例1胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的制备本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下1.胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体采用间接ELISA法测定效价为1 100000。2.胶乳本发明仅示例性的采用直径为100 200nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验。本实施例的主要试剂的配制如下试剂Rl 含1. 5% PEG6000(聚乙二醇6000)，0. 8% NaCl的氯化铵缓冲液。该试剂为无色透明溶液。试剂R2 用抗人胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。 具体步骤如下1.取 Iml (100mg/ml)胶乳，用 0. lM(mol/L)，ρΗ5· O 的 MES 溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，超声分散；2.加入0. 2ml用0. 1M，pH5. O的MES溶液新鲜配制的EDAC (10mg/ml)混合完全， 室温混和15min ；3.加入0. 8ml用0. 1M，ρΗ5· O的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰胼(83mg/ml)， 4 °C反应过夜；4.用0. 1M，ρΗ5· O的MES溶液洗涤2次，0. 1Μ，ρΗ7· 5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声分散备用；5.取1. 5ml抗体(3. 9mg/ml)溶液，加入0. 2ml用0. 1Μ，ρΗ7· 5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml)，室温混合15min，6.将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中已激活的胶乳溶液中，4°C反应过夜；
7.加入0. 32ml 10% BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4°C混合4h ；8.加入0.鈿1 10%葡萄糖溶液，4°C混合过夜；9.用 0. 1M, pH7. 5Tris 溶液洗涤 3 次，加入 0. 1M, pH7. 5Tris 溶液(含 1 % BSA, 0. 2% NaN3的Tris缓冲液)至胶乳终浓度为0. 25%。胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品在缓冲溶液中加入不同含量的胱氨酸蛋白酶抑制剂C蛋白，除菌过滤，所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量控制在0 8mg/L之间，这些校准品均为无色透明液体。实施例2胱氨酸蛋白酶抑制剂C的测定检测工具日立7060型自动分析仪。分析方法两点终点法；主波长546nm，副波长700nm 样品量3. Oul ；Rl 250ul ；R2 :50ul ；校准方式样条函数Spline ；反应方向上升；测定温度37°C ；样品与Rl 混勻后，于第30秒读取吸光度A1 ；于5分钟时加入R2，于5分钟时读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。计算方法多点定标，以样条函数作为计算模式，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。参考范围0·55 1. 05mg/L实施例3胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒各项性能指标测试1.灵敏度试验测定6种不同胱氨酸蛋白酶抑制剂C含量的样品，每个样品测10次，通过计算均值和SD值(标准差值)，从表1可见，本发明检测试剂盒的灵敏度为0. 08mg/L。表 权利要求
1.一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括试剂R1、试剂 R2，所述的试剂Rl为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。
2.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的Rl与R2的容积比为5 1。
3.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于所述的缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0. 01 1. 5 μ m。
5.根据权利要求4所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0. 05 0. 5 μ m。
6.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒中，还包括胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品。
8.根据权利要求7所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C校准品中胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量为0 8mg/L。
9.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成， 该试剂R2的制备步骤包括(1)胶乳颗粒的激活在带有羧基的胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺， 混合反应后加入己二酸二酰胼，继续混合反应，得到激活的胶乳颗粒；(2)抗体的氧化用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基；(3)抗体与胶乳颗粒的偶联将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤( 氧化的抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球。
10.根据权利要求9所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于步骤(1) 中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺胶乳=0. 5 5 100(重量比)；己二酸二酰胼胶乳 =50 250 100 (重量比)；步骤O)中高碘酸钠胶乳=0. 5 3 100 (重量比)；步骤(3)中抗体激活的胶乳颗粒=2 22 100(重量比)，葡萄糖激活的胶乳颗粒= 05 50) 100。
全文摘要
本发明公开一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述的试剂R1为适当的缓冲液；所述的试剂R2是用胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成。本发明具有灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
文档编号G01N33/531GK102353770SQ20111015112
公开日2012年2月15日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者夏佳音, 邹炳德 申请人:宁波美康生物科技有限公司