专利名称：一种检测牛奶及肉制品中磺胺类药物残留量的方法
技术领域：
本发明属于食品安全检验技术领域，涉及动物源食品中残留抗生素的检测方法， 特别是涉及一种检测牛奶及肉制品中磺胺类药物残留量的方法。
背景技术：
磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类传统的人工合成抗菌药物。它与对氨基苯甲酸(PABA)的化学结构相似，二者竞争二氢叶酸合成酶，抑制细菌二氢叶酸的合成，影响细菌核酸生成，进而阻止了细菌的生长繁殖。磺胺药物抗菌谱较广，对大多数革兰阳性菌有抑制作用。磺胺类药物根据其应用情况可分为三类，即用于全身感染的磺胺药(如磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶)、用于肠道感染内服吸收的磺胺药和用于局部的磺胺药(如磺胺醋酰)。在动物饲养过程中，磺胺类药物常用于治疗家畜子宫炎、呼吸道和消化道感染、猪萎缩性鼻炎、禽霍乱、伤寒、副伤寒和球虫感染。磺胺类药物在动物体内的作用时间和代谢时间较长，往往造成动物可食性组织中有磺胺类药物残留，而长期食用有磺胺类药物残留的食品，就可能引起磺胺类药物在体内的逐渐蓄积，对人体的健康有害。主要表现为变态反应与过敏反应、急慢性中毒、三致(致畸、致突变和致癌)、 细菌耐药性、激素样作用以及菌株失调等。磺胺类药物引起过敏反应比较常见，尤以长效磺胺多见。过去50年中，有关动物奶及奶制品中青霉素和磺胺类药物残留引起人过敏反应的情况时有发生，轻者引起皮肤挠痒、皮炎或荨麻疹，重者引起急性血管性水肿、休克甚至死亡。这主要是由于在用青霉素或磺胺类药物治疗奶牛、奶山羊乳房炎和全身性感染时，不遵守弃奶期规定造成奶中药物残留引起的。而且食品、饲料中的残留极易引发细菌的耐药性和环境污染。动物排泄物中的抗菌药物和耐药性菌株被释入环境后，将污染水源和土壤，在污泥中细菌可长期保持耐药性。同时，磺胺类药物残留也是目前动物性食品贸易的主要技术问题，严重影响了畜牧业的正常发展。现有检测技术中，已应用的磺胺类抗生素残留检测技术有微生物检测法如TTC 法，理化检测方法包括紫外分光光度法、薄层色谱法、永停滴定法、高效液相色谱法等技术， 以及酶联免疫分析法等。上述方法在检测精密度等方面各有所长，但也各有缺点，有的灵敏度低、选择性差；有的操作步骤较为繁琐，有的需配备昂贵仪器，大多都存在检测耗时长、 成本高的缺点，给磺胺类抗生素的检测带来诸多不便。中国发明专利200710066347. 6 (CN 101430325)公开的“磺胺二甲嘧啶残留快速显色方法”涉及用显色反应进行磺胺药物测定， 在选择性、灵敏度等方面与本发明有巨大差距，尤其在残留检测方面难以实施；虽然酶联免疫检测试剂盒在残留检测方面有较大优势，但与本发明也有本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、检测结果准确、灵敏度高、稳定性强的检测牛奶及肉制品中磺胺类药物残留量的方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。—种检测牛奶及肉制品中磺胺类药物残留量的方法，包括以下步骤
(1)荧光衍生体系的形成配制磺胺类药物浓度0. 001 50mg/L的标准水溶液，用pH 缓冲液调节体系至PHl 6，再与浓度为0. 001 20g/L的醛类物质在40 100°C下反应 5 40min，最后使用萃取剂萃取1 3次，取萃取液有机相得到衍生体系，备用；其中，所述的醛类物质为邻苯二甲醛、苯甲醛、间硝基苯甲醛、2，4_ 二氯苯甲醛、戊二醛、糠醛、水杨醛、 香草醛、肉桂醛、柠檬醛中的一种，所述的萃取剂为正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、 四氯化碳、乙醚、异丁醇中的一种。(2)测定波长的确定将步骤(1)得到的衍生体系在荧光分光光度计下确定其荧光的最大激发波长和最大发射波长，荧光激发发射波长的扫描范围为220 770nm ；
(3)确定上述衍生体系荧光强度与磺胺类药物的线性范围、工作曲线，同时计算方法的标准偏差、检测限及样品的回收率；
(4)样品前处理
I、牛奶取5.0 25.Og牛奶，加入三氯乙酸、无水乙醇、浓度为5% 10%V/V的高氯酸、 pH2. 0 4. 4的酸化乙腈或是浓度为0. 01 100g/L乙酸铅水溶液中的一种，加入量10 30mL，混勻，在转速2000 10000r/min条件下离心分离5 20min，取上清液备用；
II、肉样取5.0 25. Og剁碎的肉样，加入三氯乙酸、无水乙醇、甲醇、乙腈或是浓度为5% 10% V/V的高氯酸、或是浓度为0. 05 0. 5 mol/L的盐酸中的一种，加入量10 30mL，超声5 15min后，在3000 10000r / min条件下离心分离5 20min，取上清液备用；
(5)样品测定取经步骤(4)处理后所得牛奶或是肉样的上清液，按照步骤(1)所述的条件进行荧光衍生反应，得到样品的荧光衍生体系；在步骤(2)所确定的荧光激发发射波长下，测定样品衍生体系的荧光强度，再对照步骤(3)所得的衍生体系工作曲线，计算出样品中的磺胺类药物残留量。同现有技术相比，本发明具有以下优点或积极效果
1、由于磺胺类药物本身具有较弱荧光，不能直接进行荧光测定。本发明利用磺胺类药物与醛类试剂发生衍生反应，产生具有强荧光发射的衍生物质，通过对衍生物质的萃取，实现了对磺胺类药物的高灵敏度检测，从而满足低残留量时的检测要求，同时显著提高了体系稳定性，弥补了荧光检测稳定性差的不足，在实际检测应用中更具可行性。2、该方法所需样品量及各种试剂用量少，成本低；
3、该方法具有检测速度快，操作简便，灵敏度高，准确率高，选择性好等优点；4、该方法检测费用低，用于牛奶及肉制品中磺胺类抗生素残留检测具有较大应用前
旦
ο
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定。实施例1
1、制备浓度为40mg/L的磺胺嘧啶钠标准水溶液500mL，使用时逐级稀释。
2、取浓度lmg/L的磺胺嘧啶钠水溶液0. 5mL置于IOmL比色管中，先后加入pHl. 8 的三酸缓冲溶液2mL，10g/L的邻苯二甲醛甲醇溶液0. lmL，用水定容到刻度，摇勻后在90°C 水浴中加热lOmin，再使用2. 5mL正丁醇萃取2次，取萃取有机相得到衍生化合物。3、将上述衍生化合物溶液在220 770nm波长范围内扫描，在最大激发波长 305nm，最大发射波长415nm下测定荧光强度，同时做试剂空白。4、取浓度 0. 01,0. 1,0. 5,1. 00,5. 00,10. 00mg/L 的磺胺嘧啶钠标准液各 ImL 置于IOmL比色管中，先后加入pHl. 8的三酸缓冲溶液2mL和10g/L的邻苯二甲醛甲醇溶液 0. lmL，用水定容到刻度，摇勻后在90°C水浴中加热lOmin，再使用2. 5mL正丁醇萃取2次， 取萃取有机相得到不同浓度标准品衍生化合物。将衍生化合物在激发波长305nm，发射波长 415nm下测定不同浓度标准品衍生化合物对应荧光强度F，对其线性回归，线性回归方程为 F=L 2486C+5. 0231，线性范围 1-400 μ g/L，相关系数 r=0. 9994，检测限 0. 3μ g/L。5、加标回收率实验取15. Og无抗牛奶置于烧杯中，加入10mg/L的磺胺嘧啶钠标准液2mL，无水乙醇25mL，充分震荡后于5000r/min下离心7min，取上清液2mL，先后加入 pHl. 8的三酸缓冲溶液2mL和10g/L的邻苯二甲醛甲醇溶液0. ImL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在90°C水浴中加热lOmin，再使用2. 5mL正丁醇萃取2次，得到衍生化合物。将衍生化合物在激发波长305nm，发射波长415nm下测定荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出磺胺嘧啶钠含量。同时按上述分析步骤对同一样品测定5次，计算出牛奶样品平均回收率(n=5)为95. 8%，相对标准偏差为3. 3%。6、取15. Og含磺胺嘧啶钠残留的牛奶，加无水乙醇25mL，充分震荡后于5000r/min 下离心7min，取上清液2mL先后加入pHl. 8的三酸缓冲溶液2mL和10g/L的邻苯二甲醛甲醇溶液0. ImL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在90°C水浴中加热lOmin，再使用 2. 5mL正丁醇萃取2次，得到衍生化合物。将衍生化合物在激发波长305nm，发射波长415nm 下测定荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出牛奶样品中磺胺嘧啶钠含量为80. 5 μ g/L。该法检测结果与用GBT 21316-2007检测结果一致。另附不使用萃取剂进行萃取的对照试验
实验过程同实施例1，仅在过程中不使用正丁醇萃取，其检测结果为磺胺嘧啶钠含量不能检出。实施例2
1、制备浓度为50mg/L的磺胺胍标准水溶液50mL，使用时逐级稀释。2、取浓度5mg/L的磺胺胍水溶液0. 5mL置于IOmL比色管中，先后加入pH3的三酸缓冲溶液2mL，5g/L的香草醛溶液0. lmL，用水定容到刻度，摇勻后在40°C水浴中加热 35min，再使用3mL 二氯甲烷萃取2次，得到衍生化合物。3、将上述衍生化合物溶液在最大激发波长^K)nm，最大发射波长425nm下测定荧光强度，同时做试剂空白。4、取浓度 0. 001、0. 01、0. 1、1. 00、5· 00、10. 00mg/L 的磺胺胍标准液各 lmL，先后加入pH3三酸缓冲溶液2mL和5g/L的香草醛溶液0. ImL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在40°C水浴中加热35min，再使用3mL 二氯甲烷萃取2次，得到不同浓度标准品衍生化合物。再使用3mL 二氯甲烷萃取2次，得到衍生化合物。将衍生化合物在激发波长 290nm,发射波长425nm下测定不同浓度标准品衍生化合物对应荧光强度F，对其线性回归，F= 0. 0196C+2. 0112，线性范围 70-1000 μ g/L，相关系数 r=0. 9994，检测限 23. 3μ g/L。5、取15. Og含磺胺胍残留的牛奶置于25mL容量瓶中，加入pH3.0的酸化乙腈 15mL,充分振动后于7000r/min下离心％iin，取上清液2mL先后加入pH3三酸缓冲溶液2mL 和5g/L的香草醛溶液0. ImL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在40°C水浴中加热 35min，再使用3mL 二氯甲烷萃取2次，得到衍生化合物。将衍生化合物在激发波长^Onm， 发射波长425nm下测定荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出牛奶样品中磺胺胍含量为 274. 2 μ g/L。该法检测结果与用GBT 21316-2007检测结果一致。实施例3
1、制备浓度为40mg/L的磺胺甲恶唑标准水溶液50mL，使用时逐级稀释。2、取浓度lmg/L的磺胺甲恶唑水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入pH5乙酸-乙酸钠缓冲溶液ImL和lg/L的戊二醛甲醇溶液0. 5mL,用水定容到刻度，摇勻后在60°C 水浴中加热25min，再使用5mL乙酸乙酯萃取1次，得到衍生化合物。3、将上述衍生化合物溶液在激发波长303nm，发射波长430nm下测定荧光强度F， 同时做试剂空白。4、取浓度 0. 01,0. 5,1. 00、10. 00,30. 00,50. 00mg/L 的磺胺甲恶唑标准液各 ImL, 先后加入pH5乙酸-乙酸钠缓冲溶液ImL和lg/L的戊二醛甲醇溶液0. 5mL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在60°C水浴中加热25min，再使用5mL乙酸乙酯萃取1次，得到衍生化合物。将衍生化合物在激发波长303nm，发射波长430nm下测定荧光强度F，对其线性回归，线性回归方程为F = 2. 2505C + 0.9307，线性范围30-700 μ g/L，相关系数r=0. 9997， 检测限10.0 μ g/L。5、取10. Og含磺胺甲恶唑残留的剁碎的猪肉，加入三氯乙酸15mL，超声lOmin， 8000r / min离心8min，取上清液2mL先后加入pH5乙酸-乙酸钠缓冲溶液和lg/L的戊二醛甲醇溶液0. 5mL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在60°C水浴中加热25min，再使用5mL乙酸乙酯萃取1次，得到样品衍生化合物。将衍生化合物在激发波长303nm，发射波长430nm下测定不同浓度盐样品衍生化合物对应荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出猪肉样品磺胺甲恶唑含量为106. 5 μ g/L。该法检测结果与用GBT 21316-2007检测结果一致。实施例4
1、制备浓度为50mg/L的磺胺嘧啶钠标准水溶液50mL，使用时逐级稀释。2、取浓度;3mg/L的磺胺嘧啶钠水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入pH3磷酸缓冲溶液ImL和lg/L的水杨醛溶液0. 5mL，用水定容到刻度，摇勻后在75°C水浴中加热 20min,再使用2mL异丁醇萃取3次，得到衍生化合物。3、将上述衍生化合物溶液在激发波长305nm，发射波长415nm下测定荧光强度F， 同时做试剂空白。4、取浓度 0. 01,0. 5,1. 00、10. 00,30. 00,50. 00mg/L 的磺胺嘧啶钠标准液各 ImL, 先后加入pH3磷酸缓冲溶液ImL和lg/L的水杨酸溶液0. 5mL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在75°C水浴中加热20min，再使用2mL异丙醇萃取3次，得到衍生化合物。将衍生化合物在激发波长305nm，发射波长415nm下测定荧光强度F，对其线性回归，线性回归方程为 F=L 2570C+1. 4352，线性范围 5-500 μ g/L，相关系数 r=0. 9985，检测限 1. 7μ g/L。5、取15. Og含磺胺嘧啶钠残留的剁碎的鱼肉，加入pH4. 0的酸化乙腈20mL，超声 15min，7000r / min离心IOmin,取上清液2mL先后加入pH3磷酸缓冲溶液ImL和lg/L的水杨酸溶液0. 5mL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在75°C水浴中加热20min，再使用2mL异丁醇萃取3次，得到样品衍生化合物。将衍生化合物在激发波长305nm，发射波长415nm下测定不同浓度盐样品衍生化合物对应荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出猪肉样品磺胺嘧啶钠含量为105. 7 μ g/L。该法检测结果与用GBT 21316-2007检测结果一致。实施例5
1、制备浓度为50mg/L的磺胺二甲基嘧啶标准水溶液50mL，使用时逐级稀释。2、取浓度lmg/L的磺胺二甲基嘧啶水溶液ImL置于IOmL比色管中，先后加入pH6 三酸缓冲溶液ImL和lg/L的邻苯二甲醛甲醇溶液0. 7mL，用水定容到刻度，摇勻后在95°C 水浴中加热5min，再使用2. 5mL三氯甲烷萃取2次，得到衍生化合物。3、将上述衍生化合物溶液在激发波长300nm，发射波长400nm下测定荧光强度F， 同时做试剂空白。4、取浓度0. 1,1. 00,10. 00,20. 00,40. 00mg/L的磺胺二甲基嘧啶标准液各lmL，先后加入pH6三酸缓冲溶液ImL和lg/L的邻苯二甲醛甲醇溶液0. 7mL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在95°C水浴中加热5min，再使用2. 5mL三氯甲烷萃取2次，得到衍生化合物。将衍生化合物在激发波长300nm，发射波长400nm下测定荧光强度F，对其线性回归，线性回归方程为F=L 3983C+4. 87 ，线性范围1-500 μ g/L，相关系数r=0. 9973，检测限 0. 3 μ g/L。5、取10. Og含磺胺二甲基嘧啶残留的剁碎的牛肉，用三氯乙酸10mL，超声lOmin， IOOOOr / min离心5min，取上清液2mL先后加入pH6三酸缓冲溶液和lg/L的邻苯二甲醛甲醇溶液0. 7mL于IOmL比色管中，用水定容到刻度，摇勻后在95°C水浴中加热5min，再使用2. 5mL三氯甲烷萃取2次，得到样品衍生化合物。将衍生化合物在激发波长300nm，发射波长400nm下测定不同浓度样品衍生化合物对应荧光强度F，代入步骤4回归方程计算出猪肉样品磺胺二甲基嘧啶含量为83. 4 μ g/L。该法检测结果与用GBT 21316-2007检测结果一致。
权利要求
1. 一种检测牛奶及肉制品中磺胺类药物残留量的方法，包括以下步骤(1)荧光衍生体系的形成配制磺胺类药物浓度0.001 50mg/L的标准水溶液，用pH 缓冲液调节体系至PHl 6，再与浓度为0. 001 20g/L的醛类物质在40 100°C下反应 5 40min，最后使用萃取剂萃取1 3次，取萃取液有机相得到衍生体系，备用；其中，所述的醛类物质为邻苯二甲醛、苯甲醛、间硝基苯甲醛、2，4_ 二氯苯甲醛、戊二醛、糠醛、水杨醛、香草醛、肉桂醛或柠檬醛中的一种，所述的萃取剂为正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、乙醚或异丁醇中的一种；(2)测定波长的确定将步骤(1)得到的衍生体系在荧光分光光度计下确定其荧光的最大激发波长和最大发射波长，荧光激发发射波长的扫描范围为220 770nm ；(3)确定上述衍生体系荧光强度与磺胺类药物的线性范围、工作曲线，同时计算方法的标准偏差、检测限及样品的回收率；(4)样品前处理I、牛奶取5.0 25.Og牛奶，加入三氯乙酸、无水乙醇、浓度为5% 10%V/V的高氯酸、 pH2. 0 4. 4的酸化乙腈或是浓度为0. 01 100g/L乙酸铅水溶液中的一种，加入量10 30mL，混勻，在转速2000 10000r/min条件下离心分离5 20min，取上清液备用；II、肉样取5.0 25. Og剁碎的肉样，加入三氯乙酸、无水乙醇、甲醇、乙腈或是浓度为5% 10% V/V的高氯酸、或是浓度为0. 05 0. 5 mol/L的盐酸中的一种，加入量10 30mL，超声5 15min后，在3000 10000r / min条件下离心分离5 20min，取上清液备用；(5)样品测定取经步骤(4)处理后所得牛奶或是肉样的上清液，按照步骤(1)所述的条件进行荧光衍生反应，得到样品的荧光衍生体系；在步骤(2)所确定的荧光激发发射波长下，测定样品衍生体系的荧光强度，再对照步骤(3)所得的衍生体系工作曲线，计算出样品中的磺胺类药物残留量。
全文摘要
本发明公开了一种检测牛奶及肉制品中磺胺类药物残留量的方法。通过样品前处理、磺胺类抗生素与醛类试剂发生化学反应、萃取以及荧光光度法测定四个步骤检测牛奶及肉制品中磺胺类抗生素残留。该技术通过磺胺的衍生反应，产生具有强荧光发射的衍生物质，通过对衍生物质的萃取，提高检测灵敏度，消除干扰，满足低残留量检测要求，同时显著提高了体系稳定性，弥补了荧光检测稳定性差的不足。方法具有操作简单、快速、检测灵敏度高等特点，在实际检测应用中具有可操作性。
文档编号G01N1/28GK102183513SQ201110144540
公开日2011年9月14日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者唐慧楠, 杨亚玲 申请人:杨亚玲