专利名称：二甲氧基苯磺酰氯柱前衍生法分析胺基化合物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及胺基化合物的柱前衍生化方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
柱前衍生反相高效液相色谱法(RP-HPLC)是提高分析一些不含生色基团的胺基化合物如氨基酸等灵敏度的常用方法，目前已报道的用于柱前衍生氨基酸的试剂有很多， 但多少存在一些问题，如邻苯二甲醛(OPA)只能与一级氨基酸发生反应，不能检测仲氨基酸，且衍生物不稳定；异硫氰酸苯甲酯(PITC)衍生操作复杂，需要真空抽干衍生化后过量的溶剂；氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)需要将反应过程中剩余的衍生化试剂萃取出以终止衍生化反应，衍生物易发生分解；丹酰氯(Dansyl-Cl)与包括亚氨基在内的所有氨基酸均起反应，影响定量；二硝基氟苯(FDNB)衍生化后生成干扰副产物，且需要通过抽干的方法除去反应剂[牟世芬，于泓.氨基酸分析方法的研究进展.[J]分析化学评述与进展，2005， 3(33) :398-404]。二甲氧基苯磺酰氯(DMOSC)通常主要用于有机合成，未见有报道其用于柱前衍生化试剂，本发明对其进行了有关的研究，并将其开发应用为一新型衍生化试剂，以磺酰氯基(-SO2Cl)作为反应基团，以苯环作为生色基团，以二甲氧基0，5_或2，4_或3， 4-或3，5-0Me)作为助色基团，提高氨基酸的分离检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是要提供一种衍生物灵敏度高，反应条件温和，操作简单，能同时衍生一、二级胺基化合物，衍生产物稳定，衍生化后无需除去过量试剂，分析时间短的DMOSC 柱前衍生化方法。本发明方法包括以下内容胺基化合物的DMOSC柱前衍生化方法，其特征是将一级或二级或一级和二级胺基化合物样品预处理后用PH8. 0 11. 5，浓度0. 05-0. 35M的硼砂缓冲溶液配成样品浓度为 0. 001 1. Omg/mL的溶液，加入DMOSC的甲醇或乙醇或乙腈溶液，DMOSC与胺基化合物进行衍生化反应的摩尔比为3 8 1，混勻，在25 45°C条件下进行衍生化反应10 40min 后，于冰水浴冷却，过滤进样至高效液相色谱仪，采用紫外检测器测定胺基化合物衍生物的含量。所述的衍生化反应的最佳温度为30 35°C，最佳时间为10 15min。按常规方法进行高效液相检测，进样前先用0. 22 μ m膜进行过滤。本发明具有衍生化反应条件温和，反应时间短，灵敏度高，能同时衍生一、二级胺基化合物，无需除去衍生化后过量试剂，衍生化产物稳定，室温无避光的条件下能放置 25 60天。衍生化反应温度低，特别适合于生物样品的分析。
图1是甘氨酸柱前衍生化后高效液相色谱图，1.衍生试剂水解物；2.甘氨酸衍生产物。
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图2是混合氨基酸柱前衍生化后高效液相色谱图，1.衍生试剂水解物；2. Glu ； 3. Thr ；4. Tyr ；5. Val ；6. Tyr ；7. Phe
具体实施例方式仪器与色谱条件Summit型Dionex (戴安)高效液相色谱仪，色谱系统由P680 HPLC泵、UVD-170U 可变波长紫外检测器、8125型进样装置和柱温箱AT-330(天津奥特恩斯仪器有限公司) 组成。工作站美国戴安Chromeleon ；色谱条件十八烷基键合硅胶色谱柱规格为5 μ m， 250*4. 6mm ；流速0. 8 1. OmL/min ；柱温25 35°C ；紫外检测波长为220 240nm ；流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(0. 02M 0. 05M，pH 5. 5 7. 5)体积比为10 5 85 20 50 30 ；进样量 20 μ L。实施例1实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 35Μ，ρΗ 8. 1)配制浓度为0. 31mg/mL的草甘膦溶液，取该溶液ImL与0. 5mL浓度为3. 47mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在45°C 条件下进行衍生化反应IOmin后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(ρΗ = 5. 8,0. 05mol/L)体积比为15 5 80 ；流速1. OmL/min ；柱温 25 0C ；检测波长235nm。实施例2实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 20M，ρΗΙΟ. 7)配制浓度为1. Omg/mL的甘氨酸溶液，取该溶液 3mL与1. 5mL浓度为18. 92mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在35°C 条件下进行衍生化反应15min后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(ρΗ = 5. 5,0. 02mol/L)体积比为20 10 70 ；流速1. OmL/min ；柱温 30 0C ；检测波长230nm。实施例3实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 30M, ρΗ 10)配制浓度为0. 23mg/mL的脯氨酸溶液，取该溶液 ImL与0. 5mL浓度为4. 72mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在28 V 条件下进行衍生化反应15min后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(ρΗ = 6. 9,0. 02mol/L)体积比为18 15 67 ；流速0. 9mL/min ；柱温 35 0C ；检测波长220nm。实施例4实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 10M，ρΗ 11. 2)配制浓度为0. 41mg/mL的蛋氨酸溶液，取该溶液ImL与0. 5mL浓度为7. 80mg/mL2, 5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在40°C 条件下进行衍生化反应20min后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(ρΗ = 6. 7,0. 03mol/L)体积比为18 5 77 ；流速1. OmL/min ；柱温 30 0C ；检测波长240nm。
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实施例5实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 05M，pH 11. 5)配制浓度为0. 001mg/mL的色氨酸溶液，取该溶液ImL与0. 5mL浓度为0. 02mg/mL 3,4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙腈溶解)混合，在27°C 条件下进行衍生化反应25min后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(pH = 7. 5,0. 02mol/L)体积比为20 50 30 ；流速1. OmL/min ；柱温 35 0C ；检测波长235nm。实施例6实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 18M，pH 9. 9)配制浓度为0. 16mg/mL的酪氨酸溶液，取该溶液ImL与0. 5mL浓度为2. 92mg/mL 3，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在25 °C 条件下进行衍生化反应40min后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(pH = 7. 0,0. 02mol/L)体积比为10 25 65 ；流速0. 9mL/min ；柱温 30 0C ；检测波长225nm。实施例7实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 05M，pH 10. 5)配制浓度为0. 28mg/mL的谷氨酸溶液，取该溶液ImL与0.5mL浓度为4.01mg/mL 3，5-二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙腈溶解)混合，在34°C 条件下进行衍生化反应30min后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(pH = 6. 8,0. 04mol/L)体积比为12 20 68 ；流速1. OmL/min ；柱温 25 0C ；检测波长235nm。实施例8实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 15M，pH 9. 8)配制浓度为0. 21mg/mL的赖氨酸溶液，取该溶液ImL与0. 5mL浓度为5. 43mg/mL 2,4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在32°C 条件下进行衍生化反应21min后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(pH = 7. 5,0. 02mol/L)体积比为20 50 30 ；流速0. 8mL/min ；柱温 30 0C ；检测波长230nm。实施例9实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 25M，pH 9. 5)配制浓度为0. 12mg/mL的苏氨酸溶液，取该溶液ImL与0. 5mL浓度为1. 91mg/mL2，4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在37°C 条件下进行衍生化反应ISmin后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液(pH = 6. 5,0. 03mol/L)体积比为12 20 68 ；流速1. OmL/min ；柱温 30 0C ；检测波长240nm。实施例10实验步骤用硼砂缓冲溶液(0. 20M，pH 10)配制总浓度为0. 31mg/mL的氨基酸(谷氨酸Glu， 苏氨酸Ilir，酪氨酸Tyr，缬氨酸Val和苯丙氨酸Wie)混合溶液，取该溶液2mL与ImL浓度为5. 25mg/mL2，5-二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在36°C条件下进行衍生化反应15min后，于冰水浴冷却，参照仪器与色谱条件，以梯度洗脱10% A不变，流动相B比例变化8% (0-3min) ,6%^ 13% (3-8min), 13%^ 20% (8-llmin), 20 % ^ 25% (Il-Hmin)，25%—30% (14_19min)，C 磷酸盐缓冲溶液(pH = 5. 8,0. 02mol/L)；流速 1. OmL/min ；柱温 32 °C ；检测波长 230nm。
权利要求
1.一种胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是将一级或二级或一级和二级胺基化合物样品预处理后用PH8. 0 11. 5，浓度0. 05 0. 35M的硼砂缓冲溶液配成样品溶液，加入衍生化试剂二甲氧基苯磺酰氯，或简称DM0SC，的甲醇或乙醇或乙腈溶液，混勻，在25 45°C条件下进行衍生化反应10 40min后，于冰水浴冷却，再过滤进样至高效液相色谱仪， 采用紫外检测器测定胺基化合物衍生物的含量。
2.根据权利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的二甲氧基苯磺酰氯试剂的反应基团为磺酰氯基-SO2Cl,生色基团为苯环，助色基团二甲氧基为2，5_或 2,4-或 3，4_ 或 3，5-0Me。
3.根据权利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的一级或二级或一级和二级胺基化合物溶液样品浓度范围为0. 001 1. Omg/mL。
4.根据权利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的二甲氧基苯磺酰氯与胺基化合物进行衍生化反应的摩尔比为3 8 1。
5.根据权利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是高效液相色谱条件为十八烷基键合硅胶色谱柱规格为5 μ m，250*4. 6mm;流速0.8 1. OmL/min ；柱温 25 35°C ；紫外检测波长为220 240nm ；流动相甲醇、乙腈和磷酸盐缓冲溶液体积比为 10 5 85 20 50 30。
6.根据权利要求5所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是流动相磷酸盐缓冲溶液浓度为0. 02M 0. 05M, pH值为5. 5 7. 5。
全文摘要
本发明公开了一种分析胺基化合物的高效液相色谱柱前衍生化方法，属于分析化学技术领域。其过程为将一级或二级或一级和二级胺基化合物样品用pH8.0～11.5，浓度0.05～0.35M的硼砂缓冲溶液配成样品溶液，加入二甲氧基苯磺酰氯的甲醇或乙醇或乙腈溶液，混匀，在25～45℃条件下进行衍生化反应10～40min后，于冰水浴冷却，过滤进样全高效液相色谱仪，采用紫外检测器对胺基化合物的衍生物进行定量分析。本发明具有衍生反应操作简单，反应时间短，灵敏度高，能同时衍生一、二级胺基化合物，衍生后无需除去过量试剂，衍生产物稳定，衍生反应温度低，特别适合于生物样品的分析。
文档编号G01N30/06GK102288707SQ201110125478
公开日2011年12月21日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者刘晓宁, 方芳, 李寿椿, 魏荣卿 申请人:南京工业大学