专利名称：辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料及其制备方法，以及基于所述复合材料的生物传感器的利记博彩app
技术领域：
本发明属于纳米材料制备、生物传感和细胞电化学技术领域，涉及一种辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料及其制备方法，以及基于所述复合材料的生物传感器。
背景技术：
细胞在代谢过程中不断产生各种活性氧(reactive oxygen species，R0S)，例如超氧阴离子自由基(02_‘)、羟自由基(·0Η)、脂自由基(R00·)、过氧化氢(H2O2)等。过氧化氢是其中最为稳定的一种，并且其浓度和0厂、· OH等其他ROS分子密切相关，最新的研究发现过氧化氢在生命体系的细胞代谢过程中扮演着重要的调节作用。过氧化氢可作为信号分子或第二信使参与多种因子细胞生物学效应的启动，但同时也可与细胞内的生物大分子反应，从而直接引起细胞膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶类变性、核酸DNA损伤等，最终导致细胞死亡、组织损伤、心血管疾病、肿瘤及神经元退变等多种疾病的发生。因此，发展一种可靠的、灵敏的检测细胞中过氧化氢的方法在生理学和病理生理学领域有着极其重要的意义。目前检测过氧化氢的方法主要有荧光法、化学发光法、高效液相色谱法、电子顺磁共振法和基于酶传感的电化学方法等。然而，细胞水平的H2O2检测仍然受到较多因素制约， 如细胞尺度小、胞内超氧自由基的半衰期非常短、稳态浓度极低以及缺少对H2A有效捕获的探针等，而且一些传统的分析方法存在取样体积大、质量检测限高、分析时间长、仪器价格昂贵等不足。在众多的检测方法中，基于酶传感电化学方法由于其具有灵敏度高、响应快、样品消耗量小、专一性强、易于制备和小型化等优点而倍受人们关注。基于酶传感的电化学方法是将具有氧化还原特性的蛋白质(酶)固载到某种材料上并将其修饰到电极表面构建成电化学传感器，通过蛋白质(酶)的电催化性能对底物过氧化氢进行检测。辣根过氧化物酶由于其结构已知、来源广泛而成为研究催化H2A氧化还原反应的重要模型酶分子之一。制备高性能的辣根过氧化物酶传感器的关键因素是载体和固定方法的选择，以最大限度地降低传感器制备过程中酶蛋白变性和失活等可能性。然而，目前所选用的蛋白质载体大都为各类碳材料(如石墨、碳纳米管、碳纳米纤维、有序碳介孔材料以及石墨烯等)、金属氧化物(多孔氧化铝、氧化锆、四氧化三铁等)、高分子(如壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、聚苯乙烯、聚乙烯及甲基丙烯酸甲酯MMA)等。这些固定载体都存在一些不足之处，如虽然碳材料具有良好的导电性能、较强的吸附能力等优点，但其是否对生物大分子会产生毒害作用从而影响到生物大分子的生物活性目前仍不是太清楚； 而金属氧化物虽具有稳定性好、机械强度高、成本低等优点，但是生物大分子在其表面已失去原有构象，产生变性，导致固定在其表面的蛋白质(酶)失去生物活性；天然高分子载体最大的特点是无毒性作用，但是它们存在强度较低、导电性能差、在厌氧条件下易被微生物分解及使用寿命低等缺点；合成的有机高分子材料由于其化学、物理性能都有很大的可变性， 理论上可以担当任何一种酶的载体，而且比天然高分子化合物的强度高，但是却存在导电性能差的缺点，这是电化学研究的最大不利因素之一。凹土 (全称凹凸棒石粘土)为晶质水合镁铝硅酸盐矿物，具有独特的层链状结构特征，由于凹凸棒石独特的晶体结构，使之具有许多特殊的物化及工艺性能，主要包括阳离子可交换性、吸水性、吸附脱色性，大的比表面积(9. 6 36m2/g)等。凹凸棒石粘土矿物具有纳米材料的属性，是具有纳米通道结构的天然纳米结构矿物材料，由于它们具有非常大的比表面积和一定的离子交换性，因此广泛用作吸附剂、催化剂载体和抗菌剂载体等。本发明以凹土为载体固定辣根过氧化物酶制备辣根过氧化物酶-凹土复合纳米材料，能很好的保持辣根过氧化物酶的天然结构和生物活性，将辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料修饰到玻碳电极表面得到生物传感器，对过氧化氢有良好的电催化活性；可应用于检测过氧化氢，特别是细胞中过氧化氢的含量。本发明所得到的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料，不仅有助于开发和拓宽凹土的高值化应用范围，并且在生物电分析化学、 细胞学和生理病理学等领域有着重大意义。
发明内容
本发明的目的是开发一种具有生物传感功能的酶-凹土复合新材料，提供一种辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料及其制备方法，所得到的纳米复合材料能很好地保持辣根过氧化物酶的天然结构和生物活性，基于所述纳米复合材料制成的生物传感器对过氧化氢有良好的电催化活性，可应用于过氧化氢的检测。本发明另一目的是提供一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的生物传感器。完成上述发明任务的技术方案是
一种辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料，其特征在于以纯化的凹土为载体，辣根过氧化物酶吸附在凹土表面。所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的红外光谱图上，1653 CHT1和1640 cm-1处存在吸收峰，其位置和形状与辣根过氧化物酶相比基本未发生变化。表明吸附在凹土表面上的辣根过氧化物酶基本保持其本身的二级结构，能很好的维持其酶催化活性。所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的制备方法包括以下步骤
1)将提纯过后的凹土加入到0.1 mol/LPBS (磷酸盐缓冲液)溶液中，控制pH值范围在 7 - 7. 5间，超声分散0. 5 - 2小时，得到0. 5 - 5 mg/mL的凹土分散液；
2)将凹土分散液与1- 10 mg/mL辣根过氧化物酶PBS溶液(pH 7-7.5)混合，在4 ° C连续搅拌0. 5 - 2小时，通过正负电荷的静电吸引作用，辣根过氧化物酶吸附到凹土表面，形成辣根过氧化物酶-凹土复合材料的悬浊液；
3)将辣根过氧化物酶-凹土复合材料悬浊液离心处理15-30分钟，并用去离子水洗涤，除去表面松散的酶分子，在真空干燥器中晾干，得到辣根过氧化物酶-凹土复合材料 (HRP-Attapulgite)0本发明将纯化的凹土分散，通过控制凹土分散液的pH值使其表面带负电荷，利用静电作用可将表面带正电荷的辣根过氧化物酶分子吸附到凹土表面，形成所述的辣根过氧化物酶-凹土复合材料，其扫描电镜照片见图1。本发明以纯化的凹土为载体，凹土是一种纳米尺寸的天然化合物，具有表面吸附效应、浓集效应、吸附定向效应和化学活泼性效应等；凹土表面含有大量能和蛋白质(酶)反应的- OH基团，可以大大提高和蛋白质(酶)之间的结合力；由于凹土的“沸石型的孔道”结构，凹土具有大的比表面积和多孔结构，易于和蛋白质(酶)交联提高固定的稳定性；凹土具有良好的生物相容性与电化学稳定性、良好的机械强度、热稳定性、耐生物降解性以及对蛋白质(酶)的高度亲和性等特性，这些都是凹土作为辣根过氧化物酶的载体所具有的优势。所述的凹土的纯化可采用现有技术中的方法，具体实施例中采用的纯化方法为 将凹土研磨后，加入超纯水中超声分散，高速离心机离心，用去离子水洗净沉降的凹土；重复超声分散、离心操作三次，将洗涤干净的凹土在80 ° C烘干12 h，得到提纯的凹土。本发明还涉及一种基于所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的生物传感器，包括玻碳电极，其特征在于所述的玻碳电极表面修饰辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料。所述的基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的生物传感器的制备方法为 将玻碳电极抛光至镜面，然后在超纯水中超声清洗后晾干；将所述的辣根过氧化物酶-凹土复合材料放入 0.1 mol/L 的PBS溶液中(pH 7-7. 5)，得到 1 mg HRP-Attapulgite /mL 均相分散液，将2 - 10 μ L的该分散液滴加到玻碳电极表面，待溶剂挥发后即得到基于辣根过氧化物酶-凹土复合材料的生物传感器，标记为HRP - Attapulgite/GC电极。所得到的电极不用时在4° C下保存。本发明的辣根过氧化物酶-凹土复合材料，经红外光谱(FTIR)、紫外光谱 (Uv-vis)和圆二色谱(CD)表征证明，吸附后的酶分子仍能保持其天然的二级结构和生物活性。在辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的红外光谱上(图2)，可以观察到固定在凹土表面的辣根过氧化物酶，其特征峰酰胺I (1653 cnf1)和酰胺II (1640 cnf1)的形状和位置与纯的辣根过氧化物酶(酰胺I 1653 cnf1和酰胺II 1640 cnf1)的一致，说明辣根过氧化物酶在吸附过程中没有变性，仍很好的维持了其天然的空间构象和酶催化活性。辣根过氧化物酶-凹土复合材料以及基于所述复合材料的生物传感器电化学性能评价采用循环伏安法考察HRP-Attapulgite/GC电极的电化学性能，实验结果表明，基于辣根过氧化物酶-凹土复合材料的传感器具有良好的电化学特性、电催化性能及稳定性。将根据本发明的HRP-Attapulgite/GC电极作为工作电极浸入0. 1 mol/L的PBS溶液(pH 7.4)中，以饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，螺旋Pt丝作为对电极，进行循环伏安扫描，研究HRP分子在凹土表面的直接电化学特性及电极的稳定性。在扫描得到的循环伏安曲线上，出现了一对峰形良好的可逆的氧化还原峰，说明负载在凹土表面的HRP能够实现其直接电子转移；将HRP - attapulgite/GC电极在上述条件下连续扫描，氧化还原峰的形状保持不变，并且该电极在4° C下保存二个星期后，峰电流大小几乎没有变化，说明 HRP - attapulgite/GC电极具有较好的稳定性。将所述的电极放入含有0. 2 mmol/LH202的 PBS溶液中(0.1 mol/L, pH 7. 4)进行循环伏安扫描，发现在-400 mV处出现了明显的电催化还原峰，说明本发明制备的辣根过氧化物酶-凹土复合材料对H2O2的电化学还原具备良好的电催化性能，基于此复合物制备的传感器可有效的应用于H2A的电化学传感。本发明具有以下优点本发明的制备方法简单有效，所制得的纳米复合材料由于载体凹土自身具有较强的吸附性能和沸石孔道特性使得更多的辣根过氧化物酶分子能够吸附到凹土表面并具有较多的催化还原反应位点；凹土拥有良好的生物相容性，吸附后的酶分子仍能保持其天然的二级结构和生物活性；制备的基于辣根过氧化物酶-凹土复合材料的生物传感器具有良好的电化学特性、电催化性能及稳定性，对过氧化氢有良好的电催化活性，能有效检测溶液中的H202。本发明不但拓宽了凹土的高值化应用领域，而且基于所述复合材料的生物传感器可建立细胞中H2A检测的基于酶传感的电化学方法，在生理学、病理学的研究中具有重要意义。
图1辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的扫描电镜图。图2辣根过氧化物酶(曲线a)、凹土(曲线b)和辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料(曲线c)的红外光谱图。图3 辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料对H2O2的电催化图HRP-attapulgite/GC电极在不含有H2A的PBS溶液中的循环伏安图(曲线a) ；HRP -attapulgite/GC电极在含有H2O2 (0. 2 mmol/L)的PBS溶液中的循环伏安图(曲线b)。PBS 溶液(0.1 mol/L, pH 7. 4)，扫描速率100 mV/s。
具体实施例方式实施例一
将10 g凹土在研磨机中研磨2小时，转速为800转/分；称取Ig研磨过的凹土，将其放入100 mL超纯水中超声分散2小时后用高速离心机离心(5000转/分)，用去离子水洗净沉降的凹土；重复超声分散、离心操作三次，将洗涤干净的凹土在80 ° C烘干12 h，得到提纯的凹土。将0.5 mg提纯过的凹土加入到1 mL 0.1 mo 1/LPBS (pH 7. 4)溶液中，超声分散 0.5-2小时，得到0. 5mg/mL的凹土分散液；将该凹土悬浮液与等体积的HRP的PBS溶液(1 mg/mL, pH 7. 4)混合，在4° C连续搅拌0.5小时。将混合液在18000 rpm下离心30 min， 并用二次水彻底洗涤3次，除去吸附不牢固的HRP分子，将该物质在真空干燥器中晾干得到 HRP - Attapulgite 复合物。将玻碳电极(GC，直径为3 mm)分别用6号砂纸、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3抛光至镜面，然后在超纯水中超声清洗30秒，晾干待用。称取Img HRP-Attapulgite复合物分散于1 mL 0.1 mol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量进样器取2 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，将电极放入干燥器中干燥，待电极表面的溶剂挥发后即得到 HRP - Attapulgite/GC 电极。实施例二
将10 g凹土在研磨机中研磨2小时，转速为800转/分；称取Ig研磨过的凹土，将其放入100 mL超纯水中超声分散2小时后用高速离心机离心(5000转/分)，用去离子水洗净沉降的凹土；重复超声分散、离心操作三次，将洗涤干净的凹土在80 ° C烘干12 h，得到提纯的凹土。2 mg提纯过的凹土加入1 mL 0. 1 mo 1/LPBS (pH 7. 4)溶液中，超声分散0. 5 - 2 小时，得到ang/mL的凹土分散液；将该凹土悬浮液与等体积的HRP的PBS溶液(5 mg/ mL, pH 7. 4)混合，在4° C连续搅拌1小时。将混合液在10000 rpm下离心20 min,并用二次水彻底洗涤3次，除去吸附不牢固的HRP分子，将该物质在真空干燥器中晾干得到
6HRP - Attapulgite 复合物。将玻碳电极(GC，直径为3 mm)分别用6号砂纸、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3抛光至镜面，然后在超纯水中超声清洗30秒，晾干待用。称取Img HRP-Attapulgite复合物分散于1 mL 0. lmol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量进样器取2 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，将电极放入干燥器中干燥，待电极表面的溶剂挥发后即得到 HRP - Attapulgite/GC 电极。实施例三
将10 g凹土在研磨机中研磨2小时，转速为800转/分；称取Ig研磨过的凹土，将其放入100 mL超纯水中超声分散2小时后用高速离心机离心(5000转/分)，用去离子水洗净沉降的凹土；重复超声分散、离心操作三次，将洗涤干净的凹土在80 ° C烘干12 h，得到提纯的凹土。将5 mg提纯过的凹土加入1 mL 0.1 mol/L PBS CpH 7.4)溶液中，超声分散 0.5-2小时，得到5mg/mL的凹土分散液；将该凹土悬浮液与等体积的HRP的PBS溶液(10 mg/mL, pH 7. 4)混合，在4 ° C连续搅拌1小时。将混合液在5000 rpm下离心15 min， 并用二次水彻底洗涤3次，除去吸附不牢固的HRP分子，将该物质在真空干燥器中晾干得到 HRP - Attapulgite 复合物。将玻碳电极(GC，直径为3 mm)分别用6号砂纸、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3抛光至镜面，然后在超纯水中超声清洗30秒，晾干待用。称取Img HRP-Attapulgite复合物分散于1 mL 0. lmol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量进样器取2 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，将电极放入干燥器中干燥，待电极表面的溶剂挥发后即得到 HRP - Attapulgite/GC 电极。实施例四
实施例四中，除用微量进样器取5 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他操作均与实例一相同。实施例五
实施例五中，除用微量进样器取10 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他操作均与实例一相同。实施例六
实施例六中，除用微量进样器取5 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他操作均与实例二相同。实施例七
实施例七中，除用微量进样器取10 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他操作均与实例二相同。实施例八
实施例八中，除用微量进样器取5 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他操作均与实例三相同。实施例九
实施例九中，除用微量进样器取10 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他操作均与实例三相同。
实施例十
利用循环伏安法对辣根过氧化物酶-凹土复合材料以及基于所述复合材料的电化学生物传感器的性能进行评价，实验结果表明，基于辣根过氧化物酶-凹土复合材料的传感器具有良好的电化学特性、电催化性能及稳定性。将实施例六制备的HRP-Attapulgite/GC电极放入0. 1 mol/L的PBS溶液中 CpH 7. 4)进行循环伏安扫描，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为螺旋Pt丝，在扫描得到的循环伏安曲线上(图3中曲线a)，出现了一对峰形良好的可逆的氧化还原峰，其氧化峰和还原峰电位分别为-300和-350 mV，这是由HRP分子活性中心的血红素的铁卟啉发生氧化还原反应引起的，说明负载在凹土表面的HRP能够实现其直接电子转移；将HRP -attapulgite/GC电极在上述条件下连续扫描(10 mV/s) 50圈，考察其稳定性，实验结果表明氧化还原峰的形状保持不变，并且该电极在4° C下保存二个星期后，峰电流大小几乎没有变化，说明HRP - attapulgite/GC电极具有较好的稳定性。将该电极放入含有0. 2 mmoVLH2O2的PBS溶液中(0. 1 mol/L, pH 7. 4)进行循环伏安扫描，循环伏安曲线(图3中曲线b)发生巨大变化，在-400 mV处出现了一个大的还原峰，且氧化峰完全消失，这是典型的电催化反应特征，说明辣根过氧化物酶-凹土复合材料对H2O2的电化学还原具备良好的电催化性能，基于此复合物制备的传感器可有效的应用于H2O2的电化学传感。其他实施例中制备得到的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的传感器，在相同的条件下放入不含有H2A的PBS溶液中(0. 1 mol/L,pH 7. 4)和含有0. 02mmol/L H2O2的 PBS溶液中(0.1 mol/L, pH 7. 4)中扫描，实验结果表明它们对H2O2的电化学还原产生基本相似的催化作用。
权利要求
1.一种辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料，其特征在于所述的纳米复合材料以纯化的凹土为载体，辣根过氧化物酶吸附在凹土表面。
2.根据权利要求1所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料，其特征在于所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的红外光谱上，1653 CnT1和1640 cnf1处存在特征吸收峰。
3.—种权利要求1所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤1)将提纯过后的凹土加入到0.1 mol/L PBS溶液中，控制pH值范围在7 - 7. 5间，超声分散0. 5 - 2小时，得到0. 5 - 5 mg/mL的凹土分散液；2)将凹土分散液与pH7-7.5,1 - 10 mg/mL辣根过氧化物酶的PBS溶液混合，在4 ° C 连续搅拌0. 5 - 2小时，通过正负电荷的静电吸引作用，辣根过氧化物酶吸附到凹土表面， 形成辣根过氧化物酶-凹土复合材料的悬浊液；3)将辣根过氧化物酶-凹土复合材料悬浊液离心处理15-30分钟，并用去离子水洗涤，除去表面松散的酶分子，在真空干燥器中晾干，得到辣根过氧化物酶-凹土复合材料。
4.根据权利要求3所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的制备方法，其特征在于所述的凹土的纯化方法为将凹土研磨后，加入超纯水中超声分散，高速离心机离心，用去离子水洗净沉降的凹土；重复超声分散、离心操作三次，将洗涤干净的凹土在80 ° C烘干12 h，得到提纯的凹土。
5.一种基于权利要求1所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的生物传感器，包括玻碳电极，其特征在于所述的玻碳电极表面修饰辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料。
6.根据权利要求5所述的生物传感器，其特征在于所述的生物传感器的制备方法为 将玻碳电极抛光至镜面，然后在超纯水中超声清洗后晾干；将所述的辣根过氧化物酶-凹土复合材料加入PH 7-7.5、0.1 mol/L的PBS溶液中，得到1 mg /mL均相分散液，将2 - 10 μ L的该分散液滴加到玻碳电极表面，待溶剂挥发后即得到基于辣根过氧化物酶-凹土复合材料的生物传感器。
全文摘要
一种辣根过氧化物酶–凹土纳米复合材料及其制备方法。所述的纳米复合材料以纯化的凹土为载体，辣根过氧化物酶吸附在凹土表面；其红外光谱在1653cm–1和1640cm–1处存在吸收峰，辣根过氧化物酶保持天然结构和生物活性。将纯化的凹土超声分散，控制分散液的pH值，将分散液与辣根过氧化物酶混合，辣根过氧化物酶吸附到凹土表面制得所述的纳米复合材料。本发明还公布了基于所述的纳米复合材料的生物传感器，包括玻碳电极，电极表面修饰辣根过氧化物酶–凹土纳米复合材料。评价所述的纳米复合材料和传感器的电化学性能，表明该复合材料对H2O2还原有良好的电催化能力，能有效检测H2O2，特别是细胞中H2O2的检测。
文档编号G01N21/35GK102175731SQ20111006405
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者吴萍, 张卉, 蔡称心, 顾飘 申请人:南京师范大学