专利名称：一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种基于青霉素结合蛋白的检测β -内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条。
背景技术：
内酰胺类抗生素是一类含有四元内酰胺环结构抗生素的统称，是目前医药和兽药行业应用最多的一类抗生素，广泛用于治疗和预防葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌、 大肠杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌引起的动物尿道、胃肠道、呼吸道感染以及奶牛乳房炎等疾病。长期摄入含有内酰胺类抗生素残留的食物可引起细菌耐药性增加，消化系统菌群失调，甚至诱发过敏反应。随着人们对食品安全的日益重视，欧盟、中国、美国、日本等国家相继对动物源性食品中内酰胺类药物最大残留限量值作出了规定，其中欧盟规定青霉素G、氨苄西林、 阿莫西林的MRL为4ppb，苯唑西林、邻氯西林、双氯西林、新青霉素III的MRL为30ppb，头孢噻呋、头孢氨苄的MRL为lOOppb，头孢唑啉、头孢哌酮的MRL为50ppb，头孢喹肟的MRL为 20ppb。免疫分析方法是目前药物残留检测常用方法之一，其原理是基于抗原抗体的特异性结合，具有高灵敏度、高特异性的特性，其中酶联免疫吸附法和胶体金法又具备高通量、 检测快速、操作简便、适用于现场筛查等优势，已广泛应用于药物残留筛查。免疫分析方法建立的基础是抗体，常规的抗体制备方法主要是免疫动物获得多克隆血清以及采用杂交瘤技术获得单克隆抗体，周期长、过程复杂、费用高。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测内酰胺类抗生素的受体试剂盒。本发明所提供的用于检测β -内酰胺类抗生素的受体试剂盒，包括SEQ ID NO 1 所示蛋白、酶标记的氨苄西林和标准品溶液，所述标准品为青霉素G。上述受体试剂盒中，所述受体试剂盒还包括底物显色液、终止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液；底物显色液由A液和B液组成，A液为2% (质量百分含量)过氧化脲的水溶液， B液为(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；终止液为0. 2M的硫酸水溶液；每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的将0. 5ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0. 01M, pH值为 7.4 ；样品稀释液0. lmol/L、pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液；每1升包被缓冲液按照如下方法制备将Na2CO3L 59g和NaHC032. 93g溶于1升水
4中，用水定容至1升，得到所述包被缓冲液；每1升封闭液按照如下方法配制将50mgBSA、lg叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0. 02M, pH值为 7. 2。上述任一所述受体试剂盒中，所述酶标记的氨苄西林为HRP标记的氨苄西林；上述任一所述受体试剂盒中，所述标准品溶液为青霉素G浓度如下的溶液 8. 1 μ g/L、2. 7 μ g/L、0. 9 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 1 μ g/L。上述任一所述受体试剂盒中，所述β -内酰胺类抗生素为如下中的至少一种青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。本发明的另一个目的是提供一种检测内酰胺类抗生素的胶体金试纸。本发明所提供的检测内酰胺类抗生素的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶体金垫包被有胶体金标记的带有HIS标签的 SEQ ID NO :1所示蛋白；所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有阿莫西林与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体。上述任一所述胶体金试纸中，所述β -内酰胺类抗生素为如下中的至少一种青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。上述任一所述胶体金试纸中，所述载体蛋白为OVA。本发明的另一个目的是提供一种检测样品中内酰胺类抗生素的方法。本发明所提供的检测样品中β -内酰胺类抗生素的方法，为如下I或II所示I、检测样品中β -内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用上述任一所述受体试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；所述待测样品为牛奶将牛奶用样品稀释液按1 4稀释，4°C、IOOOOrpm离心，取上清液，作为待测样本溶液；所述待测样品为奶粉称取Ig奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均勻，作为待测样本溶液。所述待测样品为尿液将尿液直接作为待测样本溶液；所述待测样品为肌肉、鱼、虾或蛋将待测样品勻浆处理，得到均质样品，将每5g 均质样品加入IOmL乙腈水溶液中，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心lOmin，取上清，氮气吹干，用ImL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为9 1 ；所述待测样品为蜂蜜将每5g待测样品加入15mL去离子水中，混合；将所述混合溶液用Oasis固相萃取柱进行纯化，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用ImL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液。II、检测样品中β -内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤
5
1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用上述任一所述所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测；所述样品稀释液为0. lmol/L、pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液。SEQ ID NO :1所示蛋白在检测β -内酰胺类抗生素中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种青霉素G、氨苄西林、 阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试纸及检测方法在
内酰胺类抗生素的检测中将发挥重大作用。
图1为PBP h基因PCR琼脂糖电泳图。图2为PBP 2x基因与ρΕΤ2^载体连接后酶切鉴定图。图3为IPTG诱导后不同时间点全蛋白SDS-PAGE图。
图4为PBP 2χ蛋白纯化SDS-PAGE图。图 5 为 PBP 2χ 蛋白 western blot 图。图6为试剂盒标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。氨苄西林购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为A9518。表达载体ρΕΤ2^3购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为69865 ；大肠杆菌 BL21(DE3)购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为69387 ；蛋白纯化用His · Bind Columns购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为70971 J4 DNA Ligase购自美国 Promega公司，产品目录号为M1801S。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) R6购自美国标准生物品收藏中心 (Americantype culture collection，ATCC)，编号为 ATCC 49619 (http// www. atcc. org/ ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default. aspx)。辣根过氧化物酶(HRP)购自美国Sigma公司。BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。载体PMD19-T购自TAKARA，产品目录号为D102A。His-tag单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠抗体购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号分别为AB102-02和SAlOl-Ol。实施例1、重组菌的制备肺炎链球菌R6基因组作为模板，应用下述引物进行PCR扩增，得到PCR产物；用限制性内切酶NdeI和SioI酶切PCR产物，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，回收2250bp左右的目的基因片段(即PBP2x目的基因)；电泳结果如图1所示，泳道1-6为目的基因，泳道7 为 markerο上游引物5，-TTCATATGATGAAGTGGACAAAAAGA-3，(5，端含有NdeI 酶切位点、保护
碱基)下游引物5，-TTCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAAT-3’(3，端含有 XhoI 酶切位点、保护碱基)回收目的基因片段，将其与PMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，通过抗性筛选阳性单克隆，将阳性单克隆进行液体培养，提取质粒，进行测序。结果在PMD19-T 中插入的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，表明构建的重组载体正确，记作PMD 19-Τ-ΡΒΡ2χο用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切PMD19_T_PBPh，回收2250bp左右的目的基因片段；用限制性内切酶NdeI和B10I酶切pED8b，回收载体大片段；将目的基因片段和载体大片段用T4 DNA Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，通过抗性筛选阳性单克隆， 将阳性单克隆进行液体培养，提取质粒，进行测序和分别作NdeI单酶切、XhoI单酶切以及 NdeI+XhoI双酶切鉴定。结果在pET28b的NdeI和XhoI酶切位点间(沿着从NdeI至XhoI 的方向)插入的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示(记作青霉素结合蛋白PBP2x)。表明重组载体中基因插入方向和序列均正确， 将阳性重组载体记作重组表达载体pET28b-PBPh。酶切鉴定结果如图2所示，单酶切大小在7300bp左右，双酶切有2300bp左右和5000bp左右的条带，说明目的基因已经正确连接入pET28b。图2中，泳道1 :NdeI单酶切；泳道2 =XhoI单酶切；泳道3 =NdeI/XhoI双酶切； 泳道 4 :Marker。构建好的重组表达载体pET28b_PBPh转化大肠杆菌BL21 (DE3)，卡那霉素抗性筛选，获得阳性单克隆；将获得的阳性单克隆接种于含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基中培养，提取质粒，测序，结果表明提取的质粒正确，表明构建的重组菌正确，记作重组菌 BL21-pET28b-PBPh。同时以转入pET28b的大肠杆菌BL21 (DE3)为对照菌，记作重组菌BL21_pEI^8b。实施例2、蛋白的制备与纯化一、蛋白的制备将重组菌BL21-pEI^8b-PBPh接种至含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基中， 250rpm 37°C振摇，过夜培养(1 )，得到种子液；取ImL种子液接种于IOOmL含卡那霉素 30ug/mL的LB液体培养基，250rpm 37°C振摇，至培养体系的A_为0. 6时，先取出ImL菌液，作为未诱导对照，其余菌液加入IPTG至终浓度ImM，200pm 30°C摇菌，从诱导第3个小时开始(加入IPTG时记作第O小时)，每小时取出ImL菌液，诱导时间分别为!3h、4h、 5h、6h、7h、8h以及过夜(12h)；将收集的菌液在4°C下IOOOOrpm离心5min，收集菌体；用 Tris-HCLdOmM Tris ρΗ7. 0)重悬菌体，200W功率冰浴超声(超声10s，停IOs)破碎菌体至悬液变澄清，再4°C、12000 Xg离心20min，收集上清液，即为青霉素结合蛋白提取液。将培养容器内的所有物质记作菌液。含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基的制备向LB液体培养基中添加卡那霉素， 使卡那霉素在LB液体培养基中的浓度为30ug/mL，得到的混合溶液为含卡那霉素30ug/mL的LB液体培养基。LB液体培养基组成由酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水组成，溶液中各成分的浓度为酵母提取物0.5% (质量百分含量)，蛋白胨(质量百分含量)，NaCl 1% (质量百分含量)。二、蛋白的纯化青霉素结合蛋白纯化利用表达载体上带有的组氨酸标签(His-tag)标记通过镍离子亲和层析纯化青霉素结合蛋白。先用10倍柱体积的binding buffer平衡His· Bind Columns，取上述青霉素结合蛋白提取液，然后用5倍柱体积的wash buffer洗脱杂蛋白，最后用10倍柱体积的elution buffer洗脱目标蛋白，收集洗脱液，透析，得到纯化的青霉素
结合蛋白ο同时以重组菌BL21_pEI^8b的表达产物为对照。binding buffer 将 20mmol Tris、0. 5mol Nacl 和 IOmmol 咪唑用水溶解，用 HCL 调PH值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升binding buffer。wash buffer 将 20mmol Tris、0. 5mol NaCl 和 20mmol 咪唑用水溶解，用 HCL调 PH 值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升wash buffer。elution buffer 将 20mmol Tris、0. 5mol Nacl 和 500mmol 咪唑用水溶解，用 HCL 调PH值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升elution buffer。三、蛋白验证1、将纯化前后产物及IPTG诱导前后产物进行SDS-PAGE检测，结果如图3和图4 所示。图3为重组菌BL21-pEI^8b_PBPh的结果，泳道1 未诱导对照组；泳道2 8 分别为重组菌株经3、4、5、6、7、8小时以及过夜诱导后蛋白表达图；泳道9 =Marker0图4为重组菌BL21-pEI^8b_PBPh的结果，泳道1 :Marker ；泳道2 未诱导的未纯化的重组菌株全蛋白；泳道3 诱导但未纯化的重组菌株全蛋白；泳道4 诱导且纯化后的蛋白。结果显示，在IPTG诱导下，经IPTG诱导的重组菌BL21-pEI^8b-PBPh中含有80kD 左右有明显的条带，与目的蛋白的预期大小一致，PBPh蛋白表达成功。而未经IPTG诱导的重组菌BL21-pEI^8b-PBPh中不含有目的条带。无论诱导与否，重组菌BL21-pED8b的表达产物中不含目的条带。2、蛋白验证 Western blot 收集上述制备过程中各阶段产物，进行10% SDS-PAGE电泳；将电泳条带印迹到NC 膜上，再依次与His-tag单克隆抗体以及HRP标记的羊抗鼠抗体杂交，DAB显色。结果如图5所示。图5中，泳道1 :Marker ；泳道2 未诱导的未纯化的重组菌 BL21-pEI^8b-PBPh全蛋白；泳道3 诱导但未纯化的重组菌BL21-pEI^8b_PBPh全蛋白； 泳道4 重组菌BL21-pEI^8b-PBPh的诱导且纯化后的蛋白。结果表明重组菌BL21-pEI^8b_PBPh表达得到的蛋白分子量为80kD左右，与预期的蛋白分子量一致。重组菌BL21-pED8b的表达产物中未含有目的蛋白。实施例3、检测β -内酰胺类抗生素的试剂盒一、试剂盒由下述物质组成
1、包被青霉素结合蛋白的酶标板实施例2中制备纯化的青霉素结合蛋白，用包被缓冲液配置成lug/mL ；每孔100uL。2、酶标物工作液HRP标记的氨苄西林工作液，其工作浓度lug/mL，用样品稀释液稀释HRP标记的氨苄西林得到。3、β-内酰胺类抗生素标准品标准品为青霉素G冻干粉，青霉素G购自美国 Sigma-Aldrich公司；产品目录号为46616 ；将青霉素G用样品稀释液溶解，得到如下不同浓度的标准品溶液8. 1 μ g/L、2. 7 μ g/L、0. 9 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 1 μ g/L。4、底物显色液由A液和B液组成，A液为2% (质量百分含量)过氧化脲的水溶液，B液为(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；5、终止液0. 2M硫酸水溶液；6、洗涤液每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的将0. 5ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0. 01M, PH值为7.4;7、样品稀释液0. lmol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7. 2。8、包被缓冲液0. 05mol/L的碳酸钠的水溶液、pH9. 6。9、封闭液每1升封闭液按照如下方法配制将50mgBSA、lg叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为 0. 02M, pH 值为 7. 2。0. 01M、pH值为7. 4的PBS缓冲液的配制每1升磷酸盐缓冲液(PBS)按照如下方法制备将8g NaCl,0. 2g KCl,3. 53g Na2HPO4. 12H20、0. 24g KH2PO4和去离子水混合，用去离子水定容至1升。如此得到的磷酸盐缓冲液的浓度为0. 01M, pH值为7. 4。0. 1Μ、ρΗ值为7. 2的PBS缓冲液的配制先分别配置0. lmol/L Na2HPO4溶液(称取 Na2HPO4. 12H20 35. 8g，加去离子水至 1000m L)和 0. lmol/L NaH2PO4溶液(称取NaH2PO4. 2H20 15. 6g，加去离子水至 1000m L)；取 0. lmol/L Na2HPO4 溶液 72m L 和 0. ImoVLNaH2PO4 溶液 28m L，加入8. 5g NaCL，混合均勻。0. 02M、pH值为7. 2的PBS缓冲液的配制取0. 1Μ、ρΗ值为7. 2的PBS缓冲液200mL， 加入去离子水800mL，混勻即得。0. 05mol/L、pH 值为 9. 6 的碳酸钠的水溶液的配制=Na2CO3L 59g，NaHC032. 93g，加去离子水定容至1升。二、试剂盒的制备(一 )包被有青霉素结合蛋白的酶标板及其制备包被有青霉素结合蛋白的聚苯乙烯酶标板用包被缓冲液将青霉素结合蛋白稀释至1. 0μ g/mL，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100 μ L，4°C过夜，甩干孔中液体，用洗涤液 (20倍稀释后)洗涤1次，拍干，然后在每孔中加入200 μ L封闭液，37°C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。(二)标准品的制备将青霉素G标准品用冻存液(含5% BSA的0. OlM PBS, pH 7. 4)配制成浓度为 8. 1 μ g/L，每冻干瓶分装lmL，置于冻干机中冻干，密封后4°C保存。(三)酶标物的制备
用EDC法将半抗原氨苄西林偶联于HRP上。a.取 50mg 氨节西林，溶于 5mL PBS (0. 05mol/L, ρΗ7· 0)溶液中；b.加入 40mg EDC，4°C搅拌反应 Ih ；c.取 IOOmg 的 HRP 以及 IOmg EDC 溶于 IOmLPBS (0. 05mol/L，pH7. 0)溶液中，与上
述溶液混合，4°C搅拌反应48h ；d.装入透析袋，PBS (0. 05mol/L,pH7. 0)透析，得到氨苄西林与HRP的偶联物，即为酶标物。0. 05M、pH值为7. 0的PBS缓冲液的配制先分别配置0. 05mol/L Na2HPO4溶液 (称取 Na2HPO4. Iffl2O 17. 9g,加去离子水至 1000m L)和 0. 05mol/L KH2PO4 溶液(称取 KH2PO4. 2H20 8. 6g，加去离子水至 1000m L)；取 0. 05mol/L Na2HPO4 溶液 60m L 和 0. 05mol/ LKH2PO4溶液40m L，加入8. 5g NaCL,混合均勻。三、试剂盒检测方法1、标准曲线的制作向包被有青霉素结合蛋白的酶标板微孔中加入不同浓度的青霉素G标准品溶液 50 μ L，再加入酶标物工作液50 μ L，用盖板膜封板，37°C恒温箱中反应30min，甩干孔中液体，每孔加入350 μ L洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板4次，用吸水纸拍干。每孔加入底物显色液，轻轻振荡混勻，37°C恒温箱避光显色lOmin，每孔加入终止液 50 μ L，轻轻振荡混勻，用酶标仪，测定每孔吸光度值。用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(O标准) 的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以标准品浓度(yg/L)的半对数值为 X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图6所示。该标准曲线的函数关系式为 y = -18. 95Ln(x)+43. 087，R2 = 0. 9918.百分吸光度值(%) = (B/B0) X100%2、样品中内酰胺类抗生素浓度的测定方法与标准曲线的制备中基本相同，不同的是用待测样本溶液代替标准品溶液。 测定每孔吸光度值。用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(O 标准)的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。将百分吸光度值代入标准曲线的函数关系式，即得到样本溶液中内酰胺类抗生素的残留量。3、检测样品的前处理方法检测样本为牛奶、奶粉牛奶用样品稀释液按1 4稀释后4°C IOOOOrpm离心，取 50μ L上清液用于检测。称取Ig奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均勻，取50μ L用于检测。检测样本为尿液直接取50 μ L尿液用于检测。检测样本为肌肉、鱼、虾及蛋类称取5g均质样品，加入IOmL乙腈水溶液(Vill V 水=9 1)，上下颠倒震荡10min，5000rpm离心lOmin，取上清，氮气吹干，用ImL样品稀释液重悬，取50 μ L用于检测。检测样本为蜂蜜称取5g样品，加入15mL去离子水，于涡旋仪上充分混合lmin， 过Oasis固相萃取柱后(利用离子交换，将目标物富集和纯化)，先用5mL去离子水洗柱，负压下抽干，再用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用ImL样品稀释液重悬，取50 μ L用于检测。四、试剂盒的准确度(一)准确度试验向不含内酰胺类抗生素的样品中添加青霉素G标准品，使青霉素G标准品在样品中的终浓度分别为4μ g/L、8y g/L ；将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表1。回收率的计算方法RG =测定值与真实值的比值X 100% ；变异系数的计算方法CV=(各平行样本的标准差与各平行样本平均值的比 it) X 100% ；批内变异系数的计算方法批内CV =同一次测定中各平行样本的变异系数的平均值。批间变异系数的计算方法批间CV =同一样本在不同批次测定结果的变异系数， 取其平均值。结果表明所有样品的添加回收率在72. 2% 97. 5%，批内变异系数在6. 4% 9.9%，批间变异系数在9. 8% 13. 0%。表1、青霉素G准确度的测定结果
权利要求
1.一种用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒，包括SEQ ID NO :1所示蛋白、酶标记的氨苄西林和标准品溶液，所述标准品为青霉素G。
2.根据权利要求1所述的受体试剂盒，其特征在于所述受体试剂盒还包括底物显色液、终止液、洗涤液、样品稀释液、包被缓冲液和封闭液；底物显色液由A液和B液组成，A液为2% (质量百分含量)过氧化脲的水溶液，B液为(质量百分含量)四甲基联苯胺的水溶液；终止液为0. 2Μ的硫酸水溶液；每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的将0. 5ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml 磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0. 01M, pH值为7. 4 ；样品稀释液0. lmol/L、pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液；每1升包被缓冲液按照如下方法制备将Na2CO3L 59g和NaHC032. 93g溶于1升水中， 用水定容至1升，得到所述包被缓冲液；每1升封闭液按照如下方法配制将50mgBSA、lg叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0. 02M, pH值为 7. 2。
3.根据权利要求1或2所述的受体试剂盒，其特征在于所述酶标记的氨苄西林为HRP 标记的氨苄西林；所述标准品溶液为青霉素G浓度如下的溶液8. 1 μ g/L、2. 7 μ g/L、0. 9 μ g/L、0. 3 μ g/ L、0.1 μ g/L0
4.根据权利要求1-3中任一所述的受体试剂盒，其特征在于所述内酰胺类抗生素为如下中的至少一种青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素 III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、 头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。
5.一种检测β-内酰胺类抗生素的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶体金垫包被有胶体金标记的带有HIS标签的SEQ IDNO 1所示蛋白；所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有阿莫西林与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的胶体金试纸，其特征在于所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。
7.根据权利要求5或6所述的胶体金试纸，其特征在于所述载体蛋白为OVA。
8.—种检测样品中内酰胺类抗生素的方法，为如下I或II所示I、检测样品中内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用权利要求1-4中任一所述受体试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；所述待测样品为牛奶将牛奶用样品稀释液按1 4稀释，4°C、IOOOOrpm离心，取上清液，作为待测样本溶液；所述待测样品为奶粉称取Ig奶粉，溶于5mL样品稀释液中，混合均勻，作为待测样本溶液。所述待测样品为尿液将尿液直接作为待测样本溶液；所述待测样品为肌肉、鱼、虾或蛋将待测样品勻浆处理，得到均质样品，将每5g均质样品加入IOmL乙腈水溶液中，上下颠倒震荡lOmin，5000rpm离心lOmin，取上清，氮气吹干， 用ImL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为 9 1 ；所述待测样品为蜂蜜将每5g待测样品加入15mL去离子水中，混合；将所述混合溶液用Oasis固相萃取柱进行纯化，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用ImL样品稀释液重悬，得到的溶液即为待测样本溶液。II、检测样品中内酰胺类抗生素的方法包括如下步骤1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用权利要求5-7中任一所述所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测；所述样品稀释液为0. lmol/L、pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液。
9.SEQ ID NO :1所示蛋白在检测β -内酰胺类抗生素中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述β-内酰胺类抗生素为如下中的至少一种青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、邻氯西林、新青霉素III、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢喹肟。
全文摘要
本发明公开了一种基于青霉素结合蛋白的检测β-内酰胺类抗生素的方法及专用试剂盒和试纸条。本发明的用于检测β-内酰胺类抗生素的受体试剂盒，包括SEQ IDNO1所示蛋白、酶标记的氨苄西林和标准品溶液，所述标准品为青霉素G。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试纸及检测方法在β-内酰胺类抗生素的检测中将发挥重大作用。
文档编号G01N33/577GK102253216SQ20111005752
公开日2011年11月23日 申请日期2011年3月10日 优先权日2011年3月10日
发明者吴小平, 徐飞, 李向梅, 李艳伟, 杨丽丽, 江海洋, 沈建忠, 王战辉, 赵宁 申请人:中国农业大学, 北京维德维康生物技术有限公司