专利名称：一种去除免疫印迹非特异性杂交的试剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物科研领域的创新型实验技术，属于一种去除免疫印迹背景的方法。
背景技术：
在C3植物光合作用卡尔文循环中，1，5- ニ磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RuBisCO)催化碳固定，从而使自然界中的无机碳进入生物链。该酶是双功能酶，在CO2浓度高的环境中，使核酮糖ニ磷酸羧化酶(ribulose diphosphatecarboxylase, RUBP)进行羧化反应，起羧化酶的作用，形成磷 酸甘油酸；在O2浓度高的环境中，使RUBP进行氧化反应，起加氧酶的作用，形成磷酸こ醇酸和磷酸甘油酸。RuBisCo作为植物叶中的主要含氮有机物之一，与植物对氮的吸收、利用及循环有夫。RuBisCo也是植物叶片中ー种主要的储存蛋白，可能是地球上最常见、含量最丰富的酶，大约占有叶片蛋白质总量的30% 50%。在提取植物叶片全蛋白质进行SDS-PAGE检测中发现，RuBisCo的大亚基在叶片中具有非常高的丰度。近年来，对RuBisCo參与植物抗逆、抗病的研究也日益增多，彭新湘等的研究亦表明随着水稻叶片的衰老，RuBisCo的降解速率加快。后基因组时代的到来，为更多的蛋白质功能性研究提出了挑战，抗体能够为免疫共沉淀、ChIP-on-chip、Pull-down以及在抗病、抗逆反应中蛋白质的表达研究提供重要资源。随着基因组序列信息的阐释和转录谱数据的积累，基于抗体的蛋白质组学将成为研究蛋白质表达谱、蛋白质相互作用等的重要的技术手段。正是由于RuBisCo在植物体内尤其是叶片中的高丰度表达，在进行针对目的基因进行蛋白质表达研究尤其是针对抗病抗逆的研究的同时，可能产生抗体与植物内源的RuBisCo大亚基的非特异性杂交，导致实验结果的不确定性，主要表现为杂交背景深井出现明显的RuBisCo大亚基条带污染。由于RuBisCo进化的保守性，本发明在植物界中适用范围广泛。
发明内容
本发明目的在于提供一种去除免疫印迹背景试剂盒，利用水稻叶片高丰度 & 臼质(Ribulose-1,5 bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunitN-methyltransferase, chloroplastic,EC = 2. I. I. 127)的同源蛋白质来消除或减弱免疫印迹中实验背景的方法。对该蛋白质的同源蛋白质通过发酵、人工合成的方式获得，直接加入到免疫印迹封闭液或者杂交液中，或者直接与抗体进行混合后使用及存储，能够消除或减弱生物体内源高丰度蛋白质造成的免疫印迹中的实验背景。RuBisCo-out试剂盒,利用竞争性拮抗的原理,采用外源高丰度蛋白质或其同源蛋白质来消除或减弱内源高丰度蛋白质所造成的免疫印迹实验背景。本发明的优点及其有益效果本发明利用重组蛋白质构建RuBisCo-out试剂盒，能够显著消除或减弱实验背景，从而更好地反映目的基因在植物不同发育阶段、不同组织结构中的蛋白质表达谱。该蛋白质可以是具有下述氣基酸残基序列之一的蛋白质
I)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)根据序列表中SEQ ID NO : I的氨基酸序列预测出的相应抗原片段序列SEQ IDNO 2 ；上述适合水稻免疫印迹研究的RuBisCo家族的编码基因，也属于本发明的保护范围，其核苷酸序SEQ ID NO 3的核苷酸序列；3)与序列表中SEQ ID NO :2序列中任意连续14个氨基酸的相似性大于80%的多肽片段；本发明获得的RuBisCo-out试剂盒,经过试验验证明本发明去除免疫印迹非特异性杂交效果，使用便利，操作方便，且具有很好的应用前景。
I、图I是本发明所述的利用特异性引物扩增获得的目的基因片段的結果。2、图2是本发明所述的RuBisCo蛋白质体外表达的結果。3、图3是本发明所述的使用RuBisCo-out前后的分蘖期、孕穗期和开花期水稻叶片的蛋白质表达谱的結果。
具体实施例方式下述实施例中所用方法均为分子生物学实验室所用的常规方法。生物材料和水稻材料水稻cDNA文库、pET_30a表达载体、大肠杆菌ER2566和DH5 α菌株等由本实验室保存。限制性内切酶BamH I、Xho I、T4 DNA Ligase, Ex Taq DNA聚合酶购自TAKARA。在水稻材料93-11 (Oryza sativa L. ssp. Indica)各时期组织样品,所有水稻材料经液氮速冻后，保存于_70°C备用。实施例I、RuBisCo基因的克隆根据TIGR 数据库公布的 Ribulose-1, 5 bisphosphate carboxylase/oxygenaselarge subuni tN-methy I transferase, chloroplastic 基因(SEQ ID NO :1)的片段序列设计了扩增引物，以水稻cDNA文库为模板进行扩增(图I)、回收，酶切连接至pET-30a表达载体，测序验证其正确性。实施例2、RuBisCo基因的蛋白质体外表达、纯化将测序正确的重组子转化大肠杆菌，ER2566，按I : 100的比例将过夜菌转接至100mlLB+Kan50+l%葡萄糖液体培养基中，37°C振荡培养至0D600为O. 6 O. 8，加入O. lmol/L的IPTG，37°C震荡培养3小时，收菌后超声破碎，SDS-PAGE分离后检测(图2)，用Ni柱进行蛋白质的纯化。实施例3、水稻不同发育时期的免疫印迹杂交背景去除效果选取水稻93-11三个发育阶段和不同部位的组织，液氮充分研磨新鲜水稻材料至粉末状，分装到预冷离心管中，每300 μ L粉末加入800 μ L蛋白裂解液(62. 5mmol/LTris .Cl，pH7· 4，10% 甘油，2% SDS，20mmol/LNaF，2mmol/L EDTA, Immo I/L PMSF,5% β-巯基こ醇)，迅速混匀并置于冰上。Vortex 4-5次，在冰水混合物中孵育10分钟，4°C，12000r/min离心15分钟,取上清转移到新的1.5mL离心管中，用Bradford法测定样品水稻总蛋白含量，-70°C保存。每个样品上样5 μ g水稻总蛋白，SDS-PAGE分离后电转到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，用抗体室温孵育3小吋，同时做RuBisCo-out的使用对照。TTBS(2mmol/ L Tris *ClpH7. 6,13. 6mmol/L NaCl，O. 1% Tween-20)洗膜 3 次，每次 5min。加入羊抗兔ニ抗(中杉金桥)室温孵育I小吋，TTBS洗膜3次，每次5分钟。加入ECL Plus检测液检测(普利莱公司)，暗室中同时对X光片进行曝光，以检测RuBisCo-out的效果。
权利要求
1.RuBi sCo-out试剂盒的开发，在于利用水稻叶片高丰度蛋白质(Ribulose-Ι,5disphosphate carboxylase/oxygenase large subunit N-methyltransferase,chloroplastic, RuBisCo, EC = 2. I. I. 127)来消除或减弱免疫印迹中实验背景的方法。
2.按照权利要求I所述的蛋白质或者是与其同源性大于或等于30%的同源蛋白质及肽段，通过发酵、人工合成的方式获得，直接加入到免疫印迹封闭液或者杂交液中，或者直接与抗体进行混合后使用及存储，能够消除或减弱生物体内源高丰度蛋白质造成的免疫印迹中的实验背景。
3.按照权利要求2所述，RuBisCo-out试剂盒采用外源高丰度蛋白质或其同源蛋白质可以消除或减弱内源高丰度蛋白质所造成的免疫印迹实验背景。
4.按照权利要求3所述，RuBisCo-out试剂盒的开发，其特征在于利用竞争性拮抗的原理可以消除或减弱内源高丰度蛋白质所造成的免疫印迹实验背景。
全文摘要
一种去除免疫印迹非特异性杂交的试剂，本发明公开了一种去除免疫印迹背景的方法，属于生物科研领域的创新型实验技术。本发明主要利用竞争性拮抗的原理，来消除或减弱免疫印迹实验过程中由于高丰度蛋白质的存在造成的免疫印迹背景深或者非特异性杂交，致使实验结果有偏差或者不能真实反应目的基因在蛋白质水平的表达差异。本发明利用重组蛋白质构建RuBisCo-out试剂盒，能够显著消除或减弱实验背景，从而更好地反映目的基因在植物不同发育阶段、不同组织结构中的蛋白质表达谱。
文档编号G01N33/68GK102650636SQ20111004296
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月23日 优先权日2011年2月23日
发明者兰金苹, 刘国振, 刘斯奇, 刘钊, 吴 琳, 尹长城, 张军, 朱健辉, 王增, 谢俊华, 陈浩 申请人:北京华大蛋白质研发中心有限公司