一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药靶点的方法

文档序号:5941440阅读:3694来源:国知局
专利名称:一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药靶点的方法
技术领域
本发明提供了一种生物素标记技术结合蛋白芯片技术寻找小分子化学药作用靶 点的方法,属于材料、化学合成、化工、药学和生物的交叉领域,具体涉及一种通过生物纳米 技术和蛋白芯片技术相结合寻找小分子化学药作用靶点的方法,尤其是通过生物素标记粒 子在蛋白芯片上寻找小分子化学药作用的靶蛋白的方法。
背景技术
多年来人们研究表明,大多数药物是通过干涉细胞中的酶或受体的功能来实现其 要药效的,酶或受体都是蛋白质,在它们的表面有很多可被小分子占住的空位,当小分子如 同锁的钥匙一样结合在酶或受体上的空位时,这些小分子即称配体。当一种药物与配体具 有相同或相似的形状,则这种药物便可以结合到酶或受体上,结合药物酶或受体将向细胞 发送一个信号,使细胞发生一系列的生理反应。结合药物的酶或受体即为药物作用的直接 靶点(靶蛋白)。当药物能结合的靶点是多个时,这种药物可能就有副作用。蛋白芯片具有高通量分析的特点,在揭示药物作用的分子机理方面可显示巨大的 优越性。蛋白质芯片是将蛋白质高密度地固定在芯片上,这些蛋白质可高度特异性地与靶 分子结合。当药物直接与芯片上的蛋白质发生作用,即可达到高通量而且快速地分析药物 作用的靶点,这是分析药物作用靶点最直接的方法。对于小分子化学药体系,可以在芯片上 固定多达17,000个人体蛋白,然后与小分子化学药进行孵育,从而初步确定小分子化学药 作用靶点。但利用生物芯片研究药物作用机制时,当前使用较多的是基因芯片,如国内与人 采用小鼠8192点基因芯片研究了中药复方对MRL/pr狼疮小鼠肾脏基团表达及Thl/TH2细 胞因子比列的调节作用,实验采用有机荧光染料Cy3和Cy5来检测杂交结果。实验表明,这 种采用基因芯片研究药物作用机制的方法在国内外均有较多的文献报道,但这种方法不能 明确药物直接作用的受体。虽然蛋白质芯片就是已比较成功地用于高通量的药物筛选(我国蛋白质芯片就 是成功应用于高通量药物筛诜.)佰未见有将牛物素标记技术结合蛋白质芯片技术来寻找 小分子化学药靶点的实验报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种寻找小分子化学药有作用靶点 的简便方法。本发明公开了上诉寻找小分子化学药作用靶点的方法,尤其是公开生物素与 小分子化学药连接以形成一种“生物素_小分子化学药”生物素标记探针,并将这种探针用 于蛋白芯片以寻找药物作用靶点的方法。本发明是通过以下就是方案实现的本发明将生物素标记粒子与小分子化学药进 行连接,形成一种“生物素_小分子化学药”荧光探针,然后将这种荧光探针直接与蛋白芯 片共孵育,经过B0DIPY-FL链霉亲合素洗涤后,根据检测蛋白芯片上的生物素标记探针和B0DIPY-FL链霉亲合素结合而确定药物与芯片上固定的已知蛋白之间特异性的结合位点, 进而通过计算机软件分析这些结合位点的的蛋白。以下对本发明的制备方法和应用进一步说明,具体如下本发明通过共价键、配位键、氢键、静电吸附中的任意一种或任意几种的组合作用 将生物素与小分子化学药进行连接。获得的产物通过分离纯化以除去游离的杂质成分,然 后将获得的探针与蛋白芯片进行孵育。或者采用将生物素转化成采用氯代生物素(Biotin-Cl)或者溴代生物素 (Biotin-Br)分子与小分子化学药进行连接然后将获得的探针与蛋白芯片进行孵育。其中 采用的氯代生物素(Biotin-Cl)或者溴代生物素(Biotin-Br)分子将与小分子化学药官能 团偶合反应,官能团包括羟基、羧基、氨基、胫基中的一种或任意几种组合。如有需要,一段 烷烃分子链会加在生物素与小分子化学药之间,从而保障小分子化学药的自由度。上述连接过程是在水相、有机相或水与有机溶剂的混合液中进行的。所述的蛋白质芯片,其点样区的蛋白质是受体、抗体或特异性蛋白质,尤其是指与 待测药物作用机理相关的受体、抗体或特异性蛋白质。所述的小分子化学药,是指通过化学合成的方法得到的从动物、植物或矿物中提 取的任意一种化合物或任意两种或国中化合物的混合物。这些化合物具有抗癌或抗肝炎 作用、心脑血管药理作用、抗爱滋病、抗衰老、治疗糖尿病、治疗前列腺疾病、抗老年痴呆、抗 菌、治疗消化道疾病、抗风湿或类风湿疾病、治疗骨质疏松或更年期综合证作用中的任意一 种或任意几种作用。为克服现有技术的不足,本发明一生物素标记分子来标记小分子化学药,进而与 蛋白芯片共孵育,以获得药物作用的直接靶点。生物素是指Biotin,生物素标记探针和 B0DIPY-FL链霉亲合素结合稳定,作用力强,便于检测。此外,生物素标记会很好的保持小分 子化学药的活性。将生物素代替传统荧光分子与蛋白芯片技术相结合,则不仅能显著提高 杂交信号的稳定性,增强杂交信号的强度,而且还可以达到双高通量检测的效果。本发明对 于阐明小分子化学药作用靶点和对小分子化学药进行筛选具有重要的实际意义。本发明具有实际性特点和显著进步,生物素标记分子优越的光学性质克服了传统 有机荧光染料的不足,将生物素与小分子化学药连接,并与蛋白质芯片孵育,可直接获得小 分子化学药作用的靶点,在研究小分子化学药筛选方面具有广阔的应用前景。具体实施方法实施例1 向50ml 二氯甲烷溶液中加入IOmmol的生物素分子和12mmol的二氯亚砜,室温下 搅拌反应2小时后,获得仍然澄清透明的溶液。蒸干二氯甲烷和二氯亚砜,重新加入二氯甲 烷50ml,12mmol三乙胺和IOmmol含有氨基的小分子化学药,室温下搅拌反应过夜。分离游 离的小分子化学药,即获得由共价结合的方法得到的“生物素_小分子化学药”的分子。核 磁共振和质谱鉴定了分子结构,小分子化学药已经连接在生物素分子上。实施例2:将小分子化学药生物素标记探针与生物素PBS缓冲液,1 % BSA和0. 1 % NonidetP-40加到蛋白芯片上。整个结合反应置于维持湿度的反应器中,在室温下进行1小 时(无晃动)。之后蛋白芯片被大量PBS缓冲液(含有0. Nonidet P-40)淋洗。检测芯片上蛋白与小分子的结合时,加入B0DIPY-FL链霉亲合素,在室温孵育30分钟。,然后用 PBS缓冲液洗净这些芯片,由生物芯片扫描仪检测。结果发现,芯片上有5个B0DIPY-FL链 霉亲合素结合点,说明小分子化学药有可能作用于多人体蛋白。
权利要求
1.一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶点的方法,其特征在 于采用以下步骤将生物素与小分子化学药进行连接,形成一种“生物素-小分子化学药” 标记探针,然后将这种标记探针直接与蛋白芯片共孵育,经过B0DIPY-FL链霉亲合素洗涤 后,根据检测蛋白芯片上的生物素标记探针和B0DIPY-FL链霉亲合素结合而确定药物与芯 片上固定的已知蛋白之间特异性的结合位点,进而通过计算机软件分析这些结合位点的蛋 白。
2.根据权利要求1所述一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶 点的方法,其特征在于通过共价键、配位键、氢键、静电吸附中的任意一种或任意几种的组 合作用将生物素与小分子化学药进行连接;获得的产物通过分离纯化以除去游离成分,得 到“生物素-小分子化学药”纳米标记探针,然后将这种探针与蛋白芯片进行孵育。
3.根据权利要求1所述一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶 点的方法,其特征在于采用氯代生物素(Biotin-Cl)或者溴代生物素(Biotin-Br)分子将 生物素与小分子化学药进行连接,然后将获得的探针与蛋白芯片进行孵育,其中采用的氯 代生物素(Biotin-Cl)或者溴代生物素(Biotin-Br)分子将与小分子化学药官能团偶合反 应,官能团包括羟基、羧基、氨基、胫基中的一种或任意几种组合。
4.根据权利要求2-3中所述一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作 用靶点的方法,其特征在于所述连接过程是在水相、有机相或水与有机溶剂的混合液中进 行的。
5.根据权利要求1-3所述一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用 靶点的方法,其特征在于所述的蛋白质芯片其点样区的蛋白质是受体、抗体或特异蛋白 质,尤其是指与待测药物作用机理相关的受体、抗体或特异蛋白质。
6.根据权利要求5所述的标记探针的组合,其特征在于由所述任意一种生物素为核。
7.根据权利要求1-3所述一种生物素标记探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用 靶点的方法,其特征在于所述的小分子化学药,是指单一化合物。
全文摘要
本发明将生物素与小分子化学药进行连接,形成一种“生物素一小分子化学药”标记探针,然后将这种标记探针直接与蛋白芯片共孵育,经过洗涤后,根据检测蛋白芯片上的生物素标记探针和BODIPY-FL链霉亲合素结合来确定药物与芯片上固定的蛋白质之问特异性的结合位点(即靶点),进而通过计算机软件分析这些结合位点的蛋白。本发明可简便、快速地寻找小分子化学药以及对细胞产生药效的靶蛋白,可为高通量地筛选小分子化学药新药提供高效的技术手段。
文档编号G01N33/68GK102095874SQ20111000081
公开日2011年6月15日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者余强 申请人:盛世泰科生物医药技术(苏州)有限公司
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