专利名称：单链可变片段抗-cd133抗体及其用途的利记博彩app
单链可变片段抗-CD133抗体及其用途相关申请的交叉引用
本申请要求2010年5月26日提交的美国临时专利申请系列号61/348，348和2010年10月5日提交的美国临时专利申请系列号61/390，011的优先权，它们各自通过引用整体并入本文。
背景技术：
癌细胞象正常细胞一样分化。肿瘤细胞群包括更低分化的、自我更新的、肿瘤起源干细胞的相对小组群，和更高分化的肿瘤细胞的相对更大的组群。更高分化的细胞对化学疗法更敏感，更低分化的癌症干细胞中的小部分具有更高的抗药性，因而促成药物难以治疗的复发。CD133是一种确定的癌症干细胞标志物。人⑶133是一种细胞表面糖蛋白，其已经被用作造血干细胞、神经干细胞的标志物，并用于富集许多癌症中的肿瘤起源细胞群，所述癌症包括结肠癌和胶质母细胞瘤(Kemper等人；Weigmann等人，1997; Yin等人，1997)。抗-⑶133抗体是可用于鉴别、分离和靶向这些干细胞群体的重要工具。尽管许多⑶133抗体是商购可得的，它们具有几个限制。首先，最广泛地使用的抗-CD133单克隆抗体识别这样的对象所述对象最初被认为是很不明确的糖基化表位(Bidlingmaier等人，2008)，但是最近被报道为在分化过程中丢失的未糖基化的表位，所述丢失可能是由于表位掩蔽(Kemper等人)。在任一种情况下，这些抗体都不会检测出表达某些翻译后修饰的CD133表位的细胞，因此不能用于确定总的CD 133表达。其次，商购可得的靶向未修饰的CD133表位的抗-CD133抗体经常是多克隆的。第三，大多数目前可得到的抗体仅适用于有限的生物学测定中。为了克服这些缺点，需要制备新的抗-CD133单克隆抗体，所述抗体会特异性地识别CD133的未糖基化的表位，且可用于多种生物学测定中。 癌是转化的上皮细胞的侵袭性恶性肿瘤。一些最致命的癌症是癌，包括药物难以治疗的胰腺、头颈、前列腺、乳房、结肠和其它器官的癌症。例如，在胰腺癌中，发现仅10-15%的患者在确诊时是可切除的，这是因为它的侵袭性生长和向淋巴结和肝脏的快速转移。当考虑所有阶段时，生存中值是3-6个月，5年存活率为1_4%，仅在美国，每年有超过32，000位患者死于该病。乳腺癌具有很好的存活率，但是根据美国癌症学会(American CancerSociety)估测，在2007年仍然有178，000例新病例，预期40，000例死亡。在头颈癌的情况下，在美国，在2006年报道了 40，000例病例，约11，000例死于该病。主要难点(culprit)是药物难以治疗的疾病的转移性复发，所以迫切需要替代性药物。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种特异性地结合人⑶133的单克隆抗体。在有些实施方案中，所述单克隆抗体是由本文所述的杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体。在另一个方面，本发明提供了在本文中鉴别为杂交瘤克隆7的杂交瘤。在另一个方面，本发明提供了由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)o 在有些实施方案中，所述 scFv 包含 SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID N0:54或SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述scFv包含SEQ ID N0:53的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码下述氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54 或 SEQ ID NO: 55。在有些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO:53的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，所述分离的多核苷酸包含SEQ ID N0:56的核酸序列。在另一个方面，本发明提供了融合多肽。通常，融合多肽包括靶向部分和毒素部分。所述靶向部分可以包括本文所述的单克隆抗体或其scFv，它们会特异性地结合癌症干细胞差别地表达的标志物。在有些实施方案中，所述毒素部分可以包括细胞裂解毒素的去免疫的治疗活性部分。在另一个方面，本发明提供了组合物，所述组合物包括刚刚描述的多种融合多肽。在有些实施方案中，所述组合物可以包括第一种融合多肽和第二种融合多肽，其中所述第一种融合多肽特异性地结合癌症干细胞差别地表达的第一种标志物，且所述第二种融合多肽特异性地结合癌症干细胞差别地表达的第二种标志物。在一个实施方案中，一种融合多肽可以特异性地结合⑶133，且另一种融合多肽可以特异性地结合EGFR。在另一个方面，本发明提供了组合物，其中所述单克隆抗体或其SCFv可以与纳米颗粒偶联。在某些实施方案中，所述纳米颗粒可以是可生物降解的。在某些实施方案中，所述纳米颗粒可以含有细胞裂解毒素。
在另一个方面，本发明提供了治疗方法，所述治疗方法包括给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括本文所述的单克隆抗体或其scFv。在有些实施方案中，所述单克隆抗体或其scFv可以与治疗部分融合，或与含有治疗性化合物的纳米颗粒偶联。在另一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括与可检测的标志物偶联的本文所述的单克隆抗体或其scFv。在另一个方面，本发明提供了一种检测表达癌症干细胞标志物的细胞的方法。通常，所述方法包括使至少一个表达CD133的细胞和组合物接触，所述组合物包括与可检测的标志物偶联的本文所述的单克隆抗体或其scFv，并检测特异性地结合所述细胞的组合物的部分。在有些实施方案中，所述组合物可以施用给受试者。上述发明内容无意描述每个公开的实施方案或本发明的每种实现。下面的描述更具体地例证了示例性的实施方案。在遍布本申请的几个地方，通过实施例列表提供了引导，所述实施例可以各种组合进行使用。在每种情况下，列举的列表仅仅用作代表性的集合，不应解释为排它性列表。
图1:用于疫苗接种的⑶133抗原。⑶133蛋白的拓扑图(图A)和氨基酸序列(图B，SEQ ID N0:l)o 制备了重组的嵌合的 CD133 抗原(SEQ ID N0:2)，其由 SEQ ID N0:1 的氨基酸残基180-380和612-765 (在图B中标有下划线)组成。用细菌表达该重组的嵌合的⑶133抗原(SEQ ID NO: 2)，进行纯化，并通过SDS-PAGE证实，其具有45 kDa的分子量(图C)。图2:新制备的CD133杂交瘤的分析。测试了杂交瘤克隆的上清液，作为在蛋白质印迹(图A)和免疫荧光(图B)测定中的第一抗体。免疫前的血清(-ve)或免疫后的抗血清(a. s.)用作对照。就蛋白质印迹而言，将关于蛋白浓度标准化的Caco-2裂解物加载上SDS-PAGE凝胶，分离，印迹到硝酸纤维素膜上，并切成条带。用得自鉴别的杂交瘤的上清液探测每个条带。用商购可得的抗体(ab 19898，Abeam)探测在泳道I中的膜,并用作额外阳性对照。就免疫荧光而言，固定Caco-2细胞,并用杂交瘤上清液进行免疫染色。使用商购可得的抗体(293C3，Militenyi)作为额外阳性对照。在该图中的比例条代表200微米。在原发性胶质母细胞瘤和肾组织的免疫组织化学分析中，使用杂交瘤克隆7的上清液(图C)。图3:由杂交瘤克隆7生产的抗体的特异性。(X)流式细胞计量术。用得自杂交瘤克隆7的第一抗体或293C3 (Militenyi)温育细胞，随后用标记的第二抗体温育，然后通过流式细胞计量术进行分析。得自新开发的抗-CD133杂交瘤克隆7的抗体(空心黑色直方图)将下述过表达⑶133的细胞非常特异性地染色Caco-2 (iii)、GBM6 (iv)、和用⑶133转染的U87细胞(ii)，但是没有将⑶133阴性的U87细胞(i)染色。将使用由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的免疫染色与克隆293C3 (空心灰色直方图)进行了对比。用实心灰色直方图代表同种型对照。衣霉素介导的糖基化抑制。用递增剂量的衣霉素(2.5、5、10、20l^g/ml)处理Caco-2细胞3天。DMSO处理过的细胞或未处理过的细胞用作对照。裂解细胞，然后使用由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体或GAPDH抗体通过蛋白质印迹法进行分析。图4: CD133scFV识别CD133标志物。用FITC标记CD133scFv。从已知的CD133的GenBank序列，制备寡核苷酸，然后`使用聚乙烯亚胺(PEI) -DNA复合物转染进HEK293-TLR2细胞中。用抗-CD133scFV-FITC复合物温育细胞，洗涤，然后通过流式细胞计量术进行分析。以标准直方图形式表示数据，其中将阳性细胞百分比相对于荧光强度绘图。仅⑶133-转染的细胞与FITC-标记的⑶133scFv反应。对照包括与空载体反应的转染细胞，与同种型对照反应的转染细胞，或不与CD133-FITC反应的未转染细胞。图5:去免疫的CD133KDEL基因包括抗-CD133 scFV，所述scFV与具有末端KDEL序列的下游PE38拼接。图6:锥虫蓝活力测定，其中每天在培养的细胞中测量活力。用d⑶133KDEL(CD133KDEL)或对照抗-B细胞靶向的毒素CD22KDEL处理UMSCC-11B头颈癌细胞。图7: d⑶133KDEL融合蛋白会阻止肿瘤干细胞特有的肿瘤起始。在肿瘤起始测定中，将分选的细胞注射进裸鼠胁腹中。该图显示了生长的那些肿瘤的肿瘤生长速率。P值指示分选的和未分选的(对照)组之间的差异的显著性。图8:锥虫蓝活力测定，其测量d⑶133KDEL随时间对培养的MDA-MB-231细胞的影响。NTR -未处理。图9: d⑶133KDEL对具有全身性MDA-MB-231肿瘤的小鼠中的肿瘤进展的影响。通过脾内注射来施用200万细胞，在裸鼠中诱导全身性肿瘤。在肿瘤接种后第6天，开始用d⑶133KDEL治疗小鼠。单个疗程由每隔一天(星期一、星期三、星期五)注射的20吒药物组成，给小鼠施用6个疗程。每周获取动物的图像。将生物发光强度测量为光子/秒/sr/cm2的函数。未治疗对照。
图10:用dCD133KDEL、dEGF4KDEL或二者的混合物治疗的小鼠中的肿瘤进展的生物发光分析。图11: 3H-胸苷摄取测定，其表明，当将突变形式(2219ARLKDEL 7mut，批次1，批次2，和批次3)和未突变形式(2219ARLKDEL (亲本))与Daudi细胞进行对比时，没有活性损失。在施用所有3批突变的药物和I批未突变的药物48小时以后，细胞杀死是相同的。图12:每周用突变的或未突变的药物免疫正常小鼠组。给动物抽血，并每周使用ELISA测定血清的抗-毒素抗体。取各值的平均值，然后通过Student T检验进行分析。曲线是显著不同的(P〈0. 05)。图13:得自图12的小鼠的血清样品的中和固定量的2219KDEL的杀死的能力。从4只2219KDEL7mut-免疫的小鼠和2只用未突变的2219KDEL免疫的小鼠采集血清，然后与
0.2 nM 2219KDEL—起温育。得自2219KDELmut7小鼠的血清没有阻断2219KDEL的细胞杀死。图14:用突变的2219KDEL7mut治疗具有全身性B细胞疾病的小鼠。它们中的80%是没有疾病的存活者。对照都死亡。图15:每周用EGF4KDEL 7mut和未去免疫的EGF4KDEL对免疫感受态B6小鼠(n=5/组)进行免疫。每周取出血清，并在灵敏的ELISA测定中确定抗-毒素(PE)水平。应答受到显著抑制。图16: dCD133KDEL对MiaPaCa-2胰腺癌细胞的影响。使用3H-亮氨酸掺入蛋白合成测定，在所述细胞系上测试dCD133KDEL。包括CD3CD3KDEL作为阴性对照。包括dEGF4KDEL作为阳性对照，因为在该细胞系上的高EGFR表达。将数据表示为3H-亮氨酸掺入相对于在单独培养基中温育的对照细 胞的百分比。图17: d⑶133KDEL对NA头颈癌细胞的影响。使用3H-亮氨酸掺入蛋白合成测定，在NA细胞系上测试d⑶133KDEL。包括⑶3⑶3KDEL作为阴性对照。包括dEpCAM23作为阳性对照，因为在该细胞系上的高EpCAM表达。将数据表示为3H-亮氨酸掺入相对于在单独培养基中温育的对照细胞的百分比。图18:蛋白质印迹,其表明抗-小鼠IgG与⑶133抗体-缀合的纳米颗粒结合(泳道3)，但是不与未缀合的纳米颗粒结合(泳道2)。图19: PLGA颗粒的流式细胞计量术数据，所述PLGA颗粒负载了 6_香豆素，且与⑶133抗体缀合(c)或未缀合(b)。图20:使用CD133-免疫颗粒的Caco_2细胞的荧光免疫染色。图21: Caco-2细胞裂解物的⑶133-缀合的纳米颗粒(⑶133-NP)和未缀合的纳米颗粒(NP)含量。Caco-2细胞表现出对⑶133-缀合的纳米颗粒的更大摄取。图22: d⑶133KDEL对具有人头颈胁腹肿瘤的裸鼠中的贫片肿瘤进展的影响。A)用测径器测量肿瘤体积。B)治疗的(dCD133KDEL治疗的)和未治疗的(PBS治疗的)小鼠随时间的生物发光图像。图23: d⑶133KDEL对具有人头颈胁腹肿瘤的裸鼠中的贫片肿瘤进展的影响。治疗的(⑶133KDEL)、未治疗的(未处理)和对照(⑶19KDEL)小鼠随时间的生物发光图像。图24:照片显示了用scFv⑶133-KDEL治疗的、具有人胶质母细胞瘤异种移植物的nu/nu小鼠中的肿瘤消退。A)治疗前的肿瘤信号，在腹膜内注射人胶质母细胞瘤细胞以后7天；B)在用scFv⑶133-KDEL治疗14天以后的肿瘤信号。
具体实施例方式本发明提供了组合物和方法，它们利用特异性地结合癌症干细胞差别地表达的某些标志物的单克隆抗体及其片段的发现。本文所述的组合物和方法可以提供某些癌症形式的检测和治疗的额外选择，因为所述单克隆抗体(及其片段)靶向癌症干细胞群体。通过靶向小量的、但是增生性的肿瘤细胞亚群，这可以实现某些癌症形式的更早检测，和/或提供有效治疗。在下面的公开内容中，下述术语应当具有指示的含义
“差别地表达的”表示这样的标志物特性与其它细胞类型对标志物的表达相比，癌症干细胞以不同的程度表达所述标志物。在某些情况下，所述差别表达可以是，与其它细胞类型相比，癌症干细胞以更大的程度表达该标志物。在某些情况下，所述标志物可以由癌症干细胞表达，但是不会在除了癌症干细胞以外的细胞类型中以可检测的水平表达。“部分”及其变化描述表示这样的化学化合物部分其表现出特定特性，例如，特定生物学或化学功能(例如，靶 标特异性或细胞裂解活性)。“多肽”表示，通过肽键相连的氨基酸的聚合物。因而，例如，术语肽、寡肽、蛋白和酶都被包括在多肽的定义内。该术语也包括多肽的表达后修饰，诸如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。术语多肽并不暗示氨基酸聚合物的任何特定最小长度或最大长度。多肽可以是可从天然来源直接分离的，或可以借助于重组技术、酶技术或化学技术进行制备。“特异性的”及其变化描述表示，对特定靶标具有任何程度的差别的或非一般的(即，非特异性的)亲和力。“治疗性的”及其变化描述表示，改善与病症有关的一种或更多种现有征状或临床征象的治疗或部分。“改善”表示，特定病症特有的征状或临床征象的程度、严重性、频率和/或可能性的任何减轻。“征象”或“临床征象”表示，与特定病症有关的客观物理征，其能够被患者以外的人发现。“征状”表示疾病或患者状况的任何主观证据。术语“和/或”是指，一个或所有列出的要素，或任意2个或更多个列出的要素的组合。在这些术语出现在说明书和权利要求书中时，术语“包含”及其变化描述不具有限制含义。除非另外指出，“一个”、“一种”、“所述”和“至少一个”可互换地使用，并表示一个或超过一个。用端点表示的数值范围在本文中也包括在该范围内包括的所有数字(例如，1-5包括 1,1.5,2,2. 75,3,3. 80、4、5 等)。目前可得到的⑶133抗体的一个显著缺点是，每种抗体仅适用于特定类型的免疫测定法，宽范围的技术需要使用多种抗体。在这里，我们报道了一种新颖的抗-CD133单克隆抗体，其可以在蛋白质印迹法、免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞计量术应用中识别CD 133抗原。在我们的研究中，通过ELISA进行了杂交瘤的初步筛选，这提示，杂交瘤克隆7也可以潜在地用于ELISA用途中。另外，我们已经克隆了杂交瘤克隆7抗体的单链可变片段(scFv)。
现有的⑶133抗体的第二个有关限制是，最常用的抗-⑶133抗体(例如，AC133和293C3)识别已经报道为糖基化的⑶133表位的对象(综述参见=Bidlingmaier等人，2008 )。可替换地，其他人提出，这些不是糖基化的表位，而是由糖基化造成被掩蔽(由于蛋白折叠的变化)的表位。可能不足令人惊奇的是，关于使用这些糖基化依赖性的CD133抗体分选的细胞用于富集具有增加的肿瘤起始和自我更新能力的细胞的能力，存在巨大争论。众多报道已经载明了具有特殊肿瘤起始潜力的CD133+细胞，但是许多相反的研究已经证实，⑶133_细胞也会在异种移植测定中引发肿瘤(Bidlingmaier等人，2008)。在某些情况下，所谓的“⑶133_细胞”是已经丧失AC133/293C3表位的⑶133+细胞。实际上，结肠肿瘤起始细胞的分化，可以伴有AC133表位丧失、致肿瘤性和集落生成，尽管具有稳定的CD133mRNA水平。糖基化依赖性的(例如，AC133，293C3)和糖基化非依赖性的(例如，杂交瘤克隆7)CD133抗体的组合使用，可以是将CD133糖基化的变化与CD133表达的变化区分开的非常有用的工具。这种区分可用于测试癌症干细胞假说的工作中，其中使用基于表面标志物(诸如CD133)分选的细胞。经证实的杂交瘤克隆7与糖基化的和未糖基化的表位的反应性提示，它可用于将治疗剂靶向CD133+癌细胞，不论分化状态如何。基于报道的CD133的结构(Shmelkov等人，2005)，设计了由CD133蛋白的氨基酸残基180-380和612-765组成的重组的嵌合的抗原(图1A，图1B)。使用Hopp-Woods抗原分析图、Kyte-Doolittle亲水性表征和Emini Surface概率分析,来鉴别和避免疏水的、非特异性的和弱免疫原性的区域。在大肠杆菌中表达了重组抗原，进行纯化，并通过SDS-PAGE进行分析(图1C)。纯化的蛋白具有45 kDa的分子量，这与预测的分子量相一致。使用标准的杂交瘤技术，将纯化的抗原注射进BALB/c小鼠中，用于制备单克隆抗-CD133抗体。通过ELISA，筛 选来自得到的杂交瘤克隆的细胞培养上清液中针对重组CD 133的抗体的生产。在2轮筛选以后，得到11个分泌抗-CD133抗体的阳性稳定杂交瘤克隆。使用单独的杂交瘤克隆7和杂交瘤克隆17的上清液，我们通过蛋白质印迹和免疫荧光测定(使用⑶133+ Caco-2细胞)验证了筛选的杂交瘤，从而揭示了与⑶133的预测分子量相对应的清晰带(图2A)。但是，在免疫荧光测定中，得自杂交瘤克隆7、杂交瘤克隆15和杂交瘤克隆16的上清液较强地将Caco-2细胞膜染色，而得自杂交瘤克隆9和杂交瘤克隆13的上清液提供弱染色(图2B)。由于杂交瘤克隆7在两种测定中有效地识别CD133表位，我们选择它用于进一步表征，并测试它在其它用途中的应用。在人神经胶质瘤和肾组织切片的免疫组织化学分析中，杂交瘤克隆7导致膜-特异性的染色(图2C)。所述染色在肾切片中是清晰的且均匀的，在神经胶质瘤组织中是更不均匀的。我们接着确定了杂交瘤克隆7对⑶133的特异性。用编码人⑶133 cDNA的表达质粒转染了 CD133ffi/_ U87细胞，用杂交瘤克隆7或商购可得的CD133抗体(293C3)染色，并通过流式细胞计量术进行分析。适当的同种型抗体和模拟转染的U87细胞用作对照。杂交瘤克隆7和293C3抗体没有可察觉地将未转染的U87细胞染色(图3A (i)和图3A (ii))。相比而言，两种抗体标记的⑶133-转染的细胞证实了杂交瘤克隆7对⑶133的特异性。接着，杂交瘤克隆7能够象293C3抗体一样将内源地表达⑶133的Caco-2和GBM6细胞免疫染色(图 3A (iii)和图 3A (iv))。接着，我们确定了杂交瘤克隆7是否识别糖基化的表位。在蛋白质印迹分析之前，用衣霉素处理Caco-2细胞,所述衣霉素是一种确定地记载的蛋白糖基化抑制剂(Tkacz和Lampen, 1975; Lehle和Tanner, 1976)。在衣霉素处理的样品中，观察到与糖基化的⑶133蛋白相对应的130 kDa带和可能来自未糖基化蛋白的95 kDa带。相比而言，在对照样品中仅看到糖基化的CD133带。130 kDa带甚至存在于用高剂量衣霉素处理且在长期处理以后的样品中，这指示，这些细胞中CD133糖基化的不完全抑制。更高剂量衣霉素导致明显的细胞毒性，正如下降的GAPDH带所示。这些结果强烈地提示，杂交瘤克隆7特异性地结合未糖基化的表位。接着，使用杂交瘤克隆7来克隆由杂交瘤克隆7生产的CD133-特异性的单克隆抗体的scFv。首先，使用源自杂交瘤克隆7的RNA，构建小鼠scFv文库。在总RNA纯化和第一链cDNA合成以后，扩增编码scFv的基因库(实施例10)。从合成的cDNA，分别扩增VH和VL基因库。通过使用重叠PCR融合VH和VL片段，随机装配scFv基因。用单一很少切割的限制性内切核酸酶Sfil，消化scFv cDNA和载体。连接以后，将重组构建体转化进电感受态的尤凝朦XL1-BLUE中。过夜温育以后，从宿主细菌中提取扩增的重组噬粒。所述文库构建通过仅一次转化实现，且具有1. 0 X IO7的理论尺寸。进行标准淘选3个循环，此后，使用噬菌体ELISAdIUS 30个随机选择的克隆针对CD133的反应性。鉴别出9个阳性克隆，每个生产一种scFv :SEQ ID NO:47,SEQ ID N0:48、SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54和SEQ ID N0:55。DNA测序表明，9个⑶133-特异性的克隆中的5个是相同的，这强烈地提示，它们都源自单个杂交瘤克隆7。选择重组克隆11 (编码SEQ ID NO:53)，用于转化进TM/fWTop 10F’中进行表达。在该过程中，在5’末端和3’末端处截短重组克隆11，使得由该克隆编码的scFv多肽具有N-端氨基酸和C-端氨基酸缺失。克隆的编码序列反映在SEQ ID N0:57中，编码的scFv多肽反映在SEQ ID N0:58中。与SEQ ID N0:53相比，SEQ ID N0:58在N-端处被截短了 6个氨基酸，在C-端处被截短了 16个氨基酸。SEQ ID NO: 58也具有在N-端处的甲硫氨酸，它是克隆过程的人工制品。使用尤展//朦分泌机制，实现了 scFv (SEQ ID NO:58)的可溶表达，并在低温(30°C)诱导。表达的scFv (SEQ ID NO:58)主要存在于培养基和义凝朦周质空间中。进行可溶性scFv ELISA,以确认与⑶133的结合特异性。存在于培养基和周质空间中的重组克隆11 scFv (SEQ ID N0:58)对人CD133是特异性的。因而，在一个方面，本发明提供了由本文所述的杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的scFv。本文使用的“由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的scFv”可以包括这样的多肽所述多肽包括 SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID N0:58 中的任一个，或在结构上与参照多肽类似的多肽，所述参照多肽包括SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ IDNO:55, SEQ ID N0:58 中的任一个。在一个实施方案中，所述scFv包括SEQ ID N0:53的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述scFv是在结构上与参照多肽类似的多肽，其中所述参照多肽包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述scFv包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述scFv是在结构上与参照多肽类似的多肽，其中所述参照多肽包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。如本文使用的，如果多肽的氨基酸序列与参照多肽相比具有指定量的同一性，那么该多肽“在结构上类似于”参照多肽。可以如下沿着更长多肽的整个长度确定2种多肽的结构相似性对齐2种多肽(例如，候选多肽和例如SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ IDN0:55或SED ID NO:58的多肽)的残基，以优化沿着它们的序列长度的相同氨基酸的数目；在对齐中允许在任一个或两个序列中的间隙，以便优化相同氨基酸的数目，尽管如此，在每个序列中的氨基酸必须保持它们的适当次序。候选多肽是与参照多肽进行对比的多肽。候选多肽可以分离自例如动物，或可以使用重组技术来生产，或化学地或酶促地合成。使用在GCG包(10. 2版，Madison WI)中的BESTFIT算法，可以进行氨基酸序列的逐对对比分析。可替换地，使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序，可以对比多肽，所述BLAST 2 搜索算法由 Tatiana 等人描述0#icro况o7 Lett, 174，247-250 (1999)),且在在国家生物技术信息中心(NCBI)网站上得到。可以使用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括matrix = BL0SUM62; open gap penalty = 11, extension gap penalty = I,gap x_dropoff = 50, expect = 10, wordsize = 3,和开启过滤器。在2个氨基酸序列的对比中，可以用“同一性”百分比表示结构相似性，或可以用“相似性”百分比表示结构相似性。“同一性”表示，相同氨基酸沿着更长多肽的整个长度的存在。“相似性”表示，沿着更长多肽的整个长度，不仅存在相同氨基酸，而且存在保守置换。一个氨基酸的保守置换可以选自该氨基酸所属的类别的其它成员。例如，蛋白生物化学领域众所周知，属于具有特定大小 或特性(诸如电荷、疏水性和亲水性)的氨基酸群体的一个氨基酸，可以置换另一个氨基酸，而不改变蛋白的活性，特别是在与生物活性没有直接关系的蛋白区域中。例如，非极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性的)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守置换包括，例如，Lys置换Arg，反之亦然，以维持正电荷；Glu置换Asp，反之亦然，以维持负电荷；Ser置换Thr，以维持游离-OH ;和Gln置换Asn，以维持游离_NH2。同样地，也预见到多肽的生物活性类似物，其含有一个或更多个邻接或非邻接氨基酸的缺失或添加，所述缺失或添加不会消除所述多肽的功能活性。本发明的多肽可以包括，与参照氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相似性的多肽。本发明的多肽可以包括，与参照氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多肽。无论评估氨基酸相似性还是氨基酸同一性，参照氨基酸序列可以是SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ IDNO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID N0:55或SED ID N0:58中的任一个。因而，在有些实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID N0:47的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID N0:48的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID N0:49的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID N0:51的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID N0:52的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID N0:53的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID N0:54的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEDID NO:58的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID N0:53o在另一个具体实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。例如，如上所述，SEQ ID NO:58是代表SEQ ID NO:53的稍微截短形式的scFv多肽。SEQ ID NO:58具有243个氨基酸，其中的242个与SEQ ID NO:53中的对应氨基酸相同，所述SEQ ID NO:53具有263个氨基酸。因此，SEQ ID N0:58与SEQ ID N0:53相比具有 92% 序列同一性。SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ IDNO:51, SEQ ID NO:52 , SEQ ID N0:54或SEQ ID NO:55的氨基酸序列的类似截短可以类似地提供适当的功能多肽。也可以设计本发明的多肽，以提供额外序列，例如，添加额外的C-端或N-端氨基酸的编码序列，所述氨基酸会便利通过捕集在柱上或使用抗体的纯化。这样的标签包括，例如，富含组氨酸的标签，其允许将多肽纯化到镍柱上。这样的基因修饰技术和合适的额外序列是分子生物学领域众所周知的。在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其编码由本文所述的杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的scFv。示例性的分离的多核苷酸包括这样的分离的多核苷酸其编码 SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55 或 SED ID NO:58 中的任一个的氨基酸序列或在结构上与参照多肽类似的多肽，所述参照多肽包括SEQ ID NO:47,SEQ IDNO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ IDNO:54,SEQ ID N0:55或SED ID N0:58中的任一个。示例性的多核苷酸也包括这样的多核苷酸序列的互补体。在本发明中也包括，在标准杂交条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸所述多核苷酸编码SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SED ID N0:58 中的任一个的氨基酸序列或在结构上与参照多肽类似的多肽，所述参照多肽包括SEQ ID N0:47、SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ ID N0:53、SEQ ID NO:54,SEQ ID N0:55或SED ID N0:58中的任一个，和这样的多核苷酸序列的互补体。在本发明中也包括，与参照核苷酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多核苷酸，所述参照核苷酸序列编码 SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ IDNO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID N0:55 或 SED ID NO:58 中的任一个的氨基酸序列。在有些实施方案中，所述参照核苷酸序列可以编码SEQ ID N0:53的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述参照核苷酸序列可以包括SEQ ID N0:56的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述参照核苷酸序列可以编码SEQ ID N0:58的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述参照核苷酸序列可以包括SEQ ID N0:57的核苷酸序列。本文使用的“序列同一性”表示2个多核苷酸序列之间的同一性。通常如下确定序列同一性对齐2个多核苷酸的残基，以优化沿着它们的序列长度的相同核苷酸的数目；在对齐中允许在任一个或两个序列中的间隙，以便优化共有的核苷酸的数目，尽管如此，在每个序列中的核苷酸必须保持它们的适当次序。候选序列是与已知序列进行对比的序列。例如，使用BLAST 2搜索算法的Blastn程序，可以对比2个多核苷酸序列，所述BLAST 2搜索算法由 Tatiana 等人，FEMS Microbiol Lett.，1999;77^: 247-250 描述，且可在环球网上在ncb1. nlm. nih. gov/BLAST/得到。可以使用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括reward for match = I, penalty for mismatch = —2， open gap penalty = 5, extensiongap penalty = 2, gap x_dropoff = 50, expect = 10, wordsize = 11,和开启过滤器。在本发明中也包括多核苷酸片段。多核苷酸片段是本文所述的分离的多核苷酸的一部分。这样的部分可以具 有几百核苷酸的长度，例如约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700或约800个核苷酸的长度。可替换地，这样的部分可以具有约10个核苷酸至约100个核苷酸的长度。本发明的单克隆抗体、scFv或多核苷酸可以用于鉴别，得自受试者的样品是否具有表达⑶133的细胞。人⑶133是一种细胞表面糖蛋白，其已经被用作造血干细胞、神经干细胞的标志物，并用于富集许多癌症中的肿瘤起源细胞群，所述癌症包括结肠癌和胶质母细胞瘤。因而，表达CD133的细胞的鉴别、定位和/或定量，可以给医学从业人员提供关于下述方面的信息获取该样品的受试者是否具有至少部分地以表达CD133的细胞为特征的病症，或处于发展所述病症的风险中。在有些实施方案中，在得自受试者的生物样品中鉴别出表达CD133的细胞，可以指示所述受试者具有结肠癌和/或胶质母细胞瘤，或处于发展所述病症的风险中。通常，可以使本发明的单克隆抗体、scFv或多核苷酸与得自受试者的生物样品的至少一部分接触。在单克隆抗体或scFv的情况下,所述生物样品可以包括表达⑶133的细胞、表达CD133的细胞的片段、和/或从生物样品中的细胞至少部分地分离的CD133。在多核苷酸的情况下，所述生物样品可以包括，例如，裂解的细胞、基因组DNA、mRNA和/或cDNA(或mRNA扩增的其它产物，例如，通过PCR)。可以检测所述单克隆抗体、scFv或多核苷酸是否以下述方式特异性地结合生物样品中的组分所述方式指示样品中的细胞的CD133表达。例如，可以检测单克隆抗体或scFv与CD133的至少一部分的特异性结合。类似地，本发明的多核苷酸(如果必要的话，经过变性)与得自样品的多核苷酸(如果必要的话，也经过变性)的至少一部分的特异性结合(例如，杂交)，指示⑶133表达。癌症干细胞区室(compartment)含有超过一个干细胞群体，CD133KDEL对这些表达CD133的群体中的至少一个是非常有效的。在我们检查的各种癌中，我们检测到约5%CD133细胞/95% CD133-细胞。例如，表I显示了几个系。用FITC标记抗-CD133 scFV,然后进行标准的流式细胞计量术。⑶133表达水平(4-7. 1%)与报告的值相一致。CaCo-2结肠直肠癌是已知表达高水平的CD133+细胞的细胞系，所以我们包括它作为阳性对照。抗-⑶45-FITC和抗-CD19 FITC是优先识别造血细胞的阴性对照。表1.在不同癌系上的⑶133+表达。
权利要求
1.在本文中鉴别为杂交瘤克隆7的杂交瘤。
2.由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体。
3.由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)。
4.根据权利要求3所述的scFv，所述scFv包含SEQID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的scFv，其中所述scFv包含SEQID NO: 58的氨基酸序列。
6.一种分离的多核苷酸，其包含编码下述氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:5USEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55 或 SEQ ID NO:58。
7.根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含编码SEQIDNO:58的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含SEQIDNO:57的核酸序列。
9.一种组合物，其包含权利要求2的单克隆抗体。
10.一种组合物，其包含权利要求3-5中的任一项的scFv。
11.一种融合多肽，其包含 靶向部分，其包含 权利要求2的单克隆抗体；或 权利要求3-5中的任一项的scFv ;和 毒素部分，其包含细胞裂解毒素的治疗活性部分。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述毒素部分是去免疫的。
13.一种组合物，其包含 根据权利要求11所述的第一种融合多肽；和 第二种融合多肽，其包含 根据权利要求11所述的第二种融合多肽；或 融合多肽，其包含特异性地结合癌症干细胞差别地表达的第二种标志物的单克隆抗体或其ScFv0
14.根据权利要求13所述的组合物，其中癌症干细胞差别地表达的至少一种标志物包括 CD133。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的组合物，其中癌症干细胞差别地表达的至少一种标志物包括EGFR。
16.—种方法,其包括 给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的 权利要求2的单克隆抗体； 权利要求3-5中的任一项的scFv ； 根据权利要求11或权利要求12所述的融合多肽；或 权利要求9、10或13-15中的任一项的组合物。
17.根据权利要求9所述的组合物，所述组合物另外包括与单克隆抗体偶联的纳米颗粒。
18.根据权利要求10所述的组合物，所述组合物另外包括与scFv偶联的纳米颗粒。
19.一种组合物，其包含与下述物质偶联的可检测的标志物 权利要求2的单克隆抗体，或 权利要求3-5中的任一项的scFv。
20.—种方法,其包括 使权利要求19所述的组合物与至少一个表达CD133的细胞接触；和 检测包含与至少一个表达CD133的细胞特异性地结合的至少一部分组合物的复合物。
21.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触包括给受试者施用所述组合物，所述受试者包含表达⑶133的癌症干细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中检测包含与至少一个表达⑶133的细胞特异性地结合的至少一部分组合物的复合物指示所述受试者具有肿瘤病症或处于该风险中。
全文摘要
本文公开了特异性地结合人CD133的单克隆抗体和其单链可变片段。本文也公开了生产特异性地结合人CD133的单克隆抗体的杂交瘤。
文档编号G01N33/53GK103068850SQ201080068255
公开日2013年4月24日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年5月26日
发明者J.R.奥尔菲斯特, J.潘亚姆, S.K.斯瓦米纳桑, D.A.瓦勒马 申请人:明尼苏达大学评议会