专利名称：用于测定cd8+t细胞的健康的测试法的利记博彩app
用于测定CD8+T細胞的健康的测试法本申请要求2010年3月18日提交的美国临时申请号61/340，492，2009年9月15日提交的美国临时申请号61/276，733以及2009年8月24日提交的美国序号12/583，723的优先权，这些申请均通过弓I入并入本文。
本发明在美国国立卫生研究院授予的资助号为ROl AI065609和U19AI46132的政府资助下完成的。因此，美国政府也对该发明享有一定的权利。该申请中所引用的各种出版物用数字在括号内注明。这些參考文献的出处可在说明书末尾、权利要求书之前找到。这些出版物公开的内容通过引用整体并入本文，以便能够更全面地说明本发明所涉及的现有技术水平。
背景技术：
如何特异且有效地防止并治疗人自身免疫性疾病一直是医药领域的核心难题。原因部分是由于我们还不完全了解免疫系统在胸腺阴性选择后如何区分自我和非我以维持外周自身耐受。通常认为表达对MHC/自身肽复合物具有高亲和カ的TCR的胸腺细胞被去除的胸腺阴性选择(1-3)消除了外周中病理性自身免疫的“紧急危险”并且是自身耐受的主要机制。然而，通过胸腺阴性选择向外周中释放大部分中等亲和カ的自反应性T细胞代表了各个体内遗传的病理性自身免疫性的潜在危险(4-6)，原因是潜在病理性自身反应性T细胞包含在中等亲和カT细胞库中并常常能够被功能性活化以引发自身免疫性疾病(6-9)。因此，在胸腺阴性选择后自我/非我的区分必须在外周中继续，且外周调节机制的主要功能之一是选择性地下调对自身抗原的免疫应答而不损害正在进行的对外来病原的应答(10-12)。因此，在鼠研究中已经证明了通过胸腺阴性选择和随后的外周T细胞调节实现自我和非我区分，其中在外周T细胞调节中Qa-I限制性CD8+T细胞选择性地下调由其自身和外来抗原活化的中等亲和カT细胞(11-15)。与Foxp3+⑶25+Treg和当前已知的控制免疫应答的量级和类型的任何其它调节细胞(16，17)不同，Qa-I限制性CD8+T细胞代表仅当前证实的在外周中发挥区分自我和非我功能的调节机制(11，12)。由于外周自反应性T细胞库因胸腺阴性选择而不具有高亲和カ部分，中等亲和カT细胞的选择性下调同时能够抑制自身免疫并保持由高亲和カT细胞支配的功能性抗感染免疫(11-15)。与MHC Ib类分子Qa-I偶联的热休克肽(Hsp60sp)也被证明是常见的替代靶结构，其优先以较高水平在中等亲和カT细胞上表达并特异性地被Qa-I限制性⑶8+T细胞识别(14)。该发现掲示了 Qa-I限制性CD8+T细胞和其靶T细胞之间的分子相互作用并解释了 Qa-I限制性CD8+T细胞为何能够选择性地下调中等亲和カ的T细胞。该发现提供了解释T细胞活化的亲和カ能够被翻译成外周T细胞调节以区分外周中的自我和非我的分子和细胞机制(15)。本文描述了基于这些发现用于测定受试者HLA-E+限制性⑶8+T细胞的健康的新测试法。
发明内容
测定受试者的⑶8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖，其中步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者 的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA_E/Hsp60sp 革巴结构。测定受试者的⑶8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；c)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞接触；d)量化步骤c)中的荷载有B7sp肽且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖，其中步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA_E/Hsp60sp 革巴结构。測定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括測定所述受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的増殖，其中如果所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别所述细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的増殖，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。測定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括測定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我，其中如果所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能区分自我和非我，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。測定受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我的方法，所述方法包括A)i)使纯化的⑶4+细胞群与(a) —定量的自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；
ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；iv)量化所述活化的CD4+细胞的增埴；和V)利用不同量的自身抗原重复步骤A)i)至步骤A) iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測定所述纯化的CD4+细胞群的自身抗原的 ED5tl ；B)
i)使从所述受试者获得的外周血单核细胞样品与(a)自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；iv)量化所述活化的⑶4+细胞的增埴；v)利用不同量的自身抗原重复步骤B) i)至步骤B)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測定所述外周血单核细胞样品的自身抗原的ED50 ；其中步骤A)和B)能够以任意顺序进行；和C)比较所述自身抗原的ED5tl和所述外来抗原的ED5tl,其中，所述外来抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞不能区分自我和非我，而其中所述外来抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。测定受试者的⑶8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖，其中其中，步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp 革E结构。测定受试者的HLA-E限制性⑶8+T细胞是否被HLA-E/Hsp60sp活化的方法，所述方法包括
a)使从所述受试者获得的包含HLA-E限制性⑶8+T细胞的样品与包含HLA-E/Hsp60sp的组合物接触；和b)检测步骤(a)是否引起所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞分泌细胞内细胞溶解酶，其中，所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞分泌细胞内细胞溶解酶表明所述受试者的HLA-E限制性⑶8+T细胞被HLA-E/Hsp60sp活化，而其中在步骤b)中没有可检测的细胞内细胞溶解酶的分泌表明所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞没有被HLA-E/Hsp60sp活化。鉴定样品中的功能性HLA-E限制性CD8+T细胞的方法，所述方法包括a)使所述样品与包含HLA_E/Hsp60sp的组合物接触；和
b)检测步骤(a)是否引起所述样品的细胞分泌细胞内细胞溶解酶，其中，所述样品的细胞中细胞内细胞溶解酶的分泌表明所述样品包含功能性HLA-E限制性⑶8+T细胞。预防性地治疗受试者而免于发展为自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞并由此预防性地治疗受试者而免于发展为所述自身免疫性疾病。用于治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞并由此治疗所述自身免疫性疾病。治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法,所述方法包括a)测定从所述受试者获得的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我；和b)如果在步骤a)中測定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能够区分自我和非我，则向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的外来体或树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞，并由此治疗所述自身免疫性疾病。
图IA :荷载肽后HLA-E在HLA-E转染子B721/E表面上的表达。按照方法中所述，用肽荷载HLA-E转染子，然后用抗-HLA-E mAb对表面进行染色。图IB =HLA-E限制性⑶8+T细胞[⑶8 (H)]特异性地抑制表达HLA-E且荷载有Hsp60sp的细胞。按照方法中的描述，产生CD8 (H)和对照细胞系并在CD8+T细胞抑制测试中测验。数据来自三个健康的正常个体。图IC =HLA-E限制性⑶8+T细胞抑制了对自身抗原MBP和GAD的整体免疫应答，但增强了对外来抗原TT和PPD的免疫应答。按照方法中的描述，产生CD8 (H)和对照细胞系并在自我/非我区分测试中测验。数据来自三个健康的正常个体。图2A :与正常个体相比，从I型糖尿病(TlD)患者新鲜分离的PBMC中的⑶8+T细胞丧失了区分自我和非我的能力。按照方法中的描述，从TlD患者的PBMC中纯化CD8+T细胞，并在CD8+T细胞抑制测试中测验。所显示的数据表示与健康的正常对照配对测验的10位TlD患者中的9位患者的数据。
图2B :与正常个体相比，从TlD患者新鲜分离的PBMC中的⑶8+T细胞丧失了特异性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的能力。按照方法中的描述，在标准的自我/非我区分测试中从来自TlD患者的PBMC纯化⑶4+T细胞、测验并与PBMC比较。所显示的数据表示与健康的正常对照配对测验的10位TlD患者中的9位患者的数据。图3A :与正常个体相比，在体外用荷载有Hsp60sp肽的自体树突细胞(DC)加强后，CD8+T细胞恢 复了区分自我和非我的能力。按照描述从各TlD患者和相应的正常对照产生CDS(H)和对照CD8+细胞系，并在自我/非我区分测试中测验和比较。所显示的数据表示与健康的正常对照配对的最初测试具有HLA-E限制性⑶8+T细胞缺陷的9位TlD患者中的8位患者的数据。图3B :与正常个体相比，在体外用荷载有Hsp60sp肽的自体DC加强后，⑶8+T细胞恢复了特异性地识别靶结构HLA-E/Hsp60sp的能力。按照描述从各TlD患者和相应的正常对照产生CD8 (H)和对照CD8+细胞系，并在CD8+T细胞抑制测试中测验和比较。所显示的数据表示与健康的正常对照配对的最初测试具有HLA-E限制性CD8+T细胞缺陷的9位TlD患者中的8位患者的数据。图3C :与正常对照个体相比，从所测验的大多数I型糖尿病(TlD)患者新鲜分离的PBMC中的CD8+T细胞都丧失了区分外周中的自我和非我的能力。与正常对照配对，比较了所纯化的⑶4+T细胞和各TlD患者中的PBMC对自身抗原GAD比外来抗原TT的免疫应答。在存在和不存在CD8+T细胞下在各个个体中使用SND指标作为评价对自身比外来抗原的应答之间的区别的參数。数据表示用于各患者的两个测验。图3D:来自所测试的多数糖尿病患者的CD8±T细胞在体外加强后再次获得了区分自我和非我的能力。与正常对照配对，比较了所建立的CD8(H)细胞系和各TlD患者的CD8⑶和CD8 (N)细胞系对自身抗原GAD比外来抗原TT的免疫应答。SDN指标用作评价各个体对自身抗原比外来抗原的应答的差异的參数。数据表示用于各患者的两个测验。图4 :所测试的从多数TlD患者新鲜分离的⑶8+T细胞都丧失了区分外周中的自我和非我的能力。与正常对照配对，比较了所纯化的⑶4+T细胞以及各TlD患者的⑶4+T细胞加CD8+T细胞对自身抗原MBP比外来抗原TT的免疫应答。数据概括了 10位TlD患者和相应的对照。图5 由特异性靶结构HLA-E/Hsp60sp触发的HLA-E限制性⑶8+T细胞的提高的细胞溶解酶(CE)表达。将来自健康个体的CD8 (H)和CD (B)细胞系与荷载有Hsp60sp肽或B7sp对照肽的B721/E细胞共培养。按照方法中的描述，通过利用穿孔素(Perf)、颗粒酶A(GA)和颗粒酶B (GB)的细胞内三色染色和随后的FACS分析测定⑶8+T的CE表达。数据表示来自三个健康的正常个体之一的数据。上图表示CE表达的三个不同组合的CE表达指标，下图表示CD8(H)细胞系上CE的细胞内染色图谱。发明详述本发明使用的“HLA-E”具有本领域的通常含义，即人白细胞抗原系统E。HLA-E 蛋白序列描述于 NCBI 登录号 CAA05527、CAA40172、BAB63328 和 BAF31260，其通过引用并入本文。在实施方式中，所述试剂是HLA-E/IgG融合蛋白，所述试剂是HLA-E四聚体或HLA_E/Hsp60sp四聚体。四聚体描述在，例如Salcedo et al. , Eur.J. Immunol. 2000 Apr ；30 (4) :1094-101中，其通过引用并入本文。所述亲和力模型和中等亲和カT细胞描述在2008年8月28日公开的W0/2008/103471中，其通过引用并入本文。本文使用的“HLA-E限制性⑶8+T细胞”是识别免疫系统抗原提呈细胞(APC)上或HLA-E+树突细胞上由HLA-E分子提呈的肽的调节性CD8+T细胞。如本文所涵盖的，用于HLA-E限制性⑶8+T细胞的抗原提呈细胞包括中等亲和カT细胞，其也是这些⑶8+T细胞的特异性靶标。本文使用的“荷载”有肽的细胞或膜结合组合物应表示在允许进入所述细胞或所述肽的膜结合组合物和/或结合于所述细胞或所述肽的膜结合组合物的条件下所述细胞或膜结合组合物与所述肽一起温育。例如，可以通过在37°C下分别用浓度为50uM的Hsp60sp或B7sp温育细胞2小时使树突细胞荷载Hsp60sp或B7sp。在实施方式中，所述HLA-E+细胞是CD4+/HLA-E+T细胞、CD8+/HLA-E+T细胞。在优选的实施方式中，所述Hsp60sp是人的。人Hsp60sp是QMRPVSRVL(SEQ IDNO 1) ο 鼠 Hsp60sp 具有序列 QMRPVSRAL (SEQ ID NO 2)。B7sp 具有序列 VMAPRTVLL (SEQ IDNO 3)。·“自身抗原”根据其存在的生物体定义，其是生物体自身组织的生理组分和能够刺激自身免疫的机体成分。“外来抗原”或非我抗原根据其存在的生物体定义，其是这样的分子该分子不是生物体自身组织的生理组分和机体成分但能够在生物体内刺激免疫应答。本文使用的细胞增殖可以以本领域已知的方式量化。本文使用的“ED5tl”应表示引发相关细胞(例如抗原活化的CD4+T细胞)的半数最大增殖的抗原或自身抗原的剂量。测定受试者的⑶8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖，其中步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA_E/Hsp60sp 革巴结构。测定受试者的⑶8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；
c)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞接触；d)量化步骤c)中的荷载有B7sp肽且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖，其中步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp 革E结构。在本发明方法的实施方式中，步骤a)和/或步骤c)中的所述受试者的CD8+T细胞样品是从所述受试者获得的外周血单核细胞样品。在本发明方法的实施方式中，所述受试者具有自身免疫性疾病。在本发明方法的实施方式中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿 病。測定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括測定所述受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的増殖，其中如果所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别所述细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的増殖，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。在本发明所述方法的实施方式中，通过以下步骤測定所述受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别所述细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的増殖a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖，其中，步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp祀结构。測定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括測定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我，其中如果所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能区分自我和非我，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。在本发明方法的实施方式中，受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我的测定包括A)i)使⑶4+细胞群与(a) —定量的自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；iv)量化所述活化的⑶4+细胞的増殖；和V)利用不同量的自身抗原重复步骤A)i)至步骤A) iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測定自身抗原的ED5tl ；B)i)使CD4+细胞群与(a)外来抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述⑶4+细胞群； ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述外来抗原；iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；iv)量化所述活化的⑶4+细胞的増殖；和V)利用不同量的外来抗原重复步骤B) i)至步骤B)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的外来抗原的量并由此測定外来抗原的ED5tl ；其中步骤A)和B)能够以任意顺序进行；和C)比较所述自身抗原的ED5tl和所述外来抗原的ED5tl,其中，外来抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的⑶8+T细胞不能区分自我和非我，而其中所述外来抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。本发明方法的实施方式中，所述CD8+T细胞包含在从所述受试者获得的外周血单核细胞的样品中。在本发明方法的实施方式中，所述CD8+T细胞是HLA-E限制性的。測定受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我的方法，所述方法包括A)i)使纯化的⑶4+细胞群与(a) —定量的自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；iv)量化所述活化的CD4+细胞的増殖；和V)利用不同量的自身抗原重复步骤A)i)至步骤A) iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測定所述纯化的CD4+细胞群的自身抗原的 ED5tl ；B)i)使从所述受试者获得的外周血单核细胞样品与(a)自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化所述CD4+细胞群；ii)洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原；
iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和部分所述抗原提呈细胞群；iv)量化所述活化的CD4+细胞的増殖；和V)利用不同量的自身抗原重复步骤B) i)至步骤B)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測定所述外周血单核细胞样品的自身抗原的ED50 ；其中步骤A)和B)能够以任意顺序进行；和C)比较所述自身抗原的ED5tl和所述外来抗原的ED5tl, 其中，所述外来抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞不能区分自我和非我，而其中所述外来抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。测定受试者的⑶8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触；b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的⑶8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触；d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖，其中，步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp祀结构。在本发明方法的实施方式中，步骤a)和/或步骤c)中的所述受试者的CD8+T细胞样品是从所述受试者获得的外周血单核细胞样品。在本发明方法的实施方式中，所述受试者具有自身免疫性疾病。在本发明方法的实施方式中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。测定受试者是否可能发展为自身免疫性病症的方法，所述方法包括測定受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我，其中CD8+T细胞不能区分自我和非我的受试者被确定为可能发展为自身免疫性疾病。在一个实施方式中，測定所述受试者的CD8+T细胞能够通过上文描述的方法区分自我和非我。測定患有自身免疫性疾病的受试者是否能够通过施用荷载有HSP60sp的细胞治疗所述自身免疫性疾病的方法，所述方法包括測定所述受试者的CD8+T细胞是否功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，其中CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的患有自身免疫性疾病的受试者被确定为能够通过施用荷载Hsp60sp的细胞来治疗。在一个实施方式中，通过上文描述的方法測定所述受试者的CD8+T细胞自身能够功能性地识别HLA-E/Hsp60 靶结构。测定受试者的HLA-E限制性⑶8+T细胞是否被HLA-E/Hsp60sp活化的方法，所述方法包括a)使从所述受试者获得的包含HLA-E限制性⑶8+T细胞的样品与包含HLA-E/Hsp60sp的组合物接触；和b)检测步骤(a)是否引起所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞对细胞内细胞溶解酶的分泌，其中，所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞分泌细胞内细胞溶解酶表明所述受试者的HLA-E限制性⑶8+T细胞被HLA-E/Hsp60sp活化，而其中在步骤b)中没有可检测的细胞内细胞溶解酶的分泌表明所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞没有被HLA-E/Hsp60sp
活化。 在实施方式中，所述包含HLA-E/Hsp60sp的组合物是经转染表达HLA-E且荷载有Hsp60sp的细胞。在一个实施方式中，经转染表达HLA-E的细胞是B721细胞。在一个实施方式中，所述细胞内细胞溶解酶是穿孔素、颗粒酶A或颗粒酶B。在一个实施方式中，所述样品是血液样品或源自血液。在一个实施方式中，通过使所述样品与结合有可检测标记物的抗细胞溶解酶抗体接触来检测所述细胞溶解酶。鉴定样品中的功能性HLA-E限制性CD8+T细胞的方法，所述方法包括a)使所述样品与包含HLA_E/Hsp60sp的组合物接触；和b)检测步骤(a)是否引起所述样品的细胞分泌细胞内细胞溶解酶，其中，所述样品的细胞分泌细胞内细胞溶解酶表明所述样品包含功能性HLA-E限制性CD8+T细胞。预防性地治疗受试者而免于发展为自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而在所述受试者中活化HLA-E限制性CD8+T细胞并由此预防性地治疗所述受试者而免于发展为所述自身免疫性疾病。用于治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而在所述受试者中活化HLA-E限制性CD8+T细胞并由此治疗所述自身免疫性疾病。治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，所述方法包括a)测定从所述受试者获得的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我；和b)如果在步骤a)中測定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能够区分自我和非我，则向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的外来体或树突细胞从而在所述受试者中活化HLA-E限制性CD8+T细胞，并由此治疗所述自身免疫性疾病。在一个实施方式中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮。在一个实施方式中，所述自身免疫性疾病是斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征(crest syndrome)、克隆氏病、德戈斯病(Dego’ s disease)、皮肌炎、幼年型皮肌炎(dermatomyositis-juvenile)、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛_纤维肌炎、格雷夫斯病、格-巴ニ氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、幼年型关节炎、狼疮、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无カ、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、赖特氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、全身肌強直综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿。在所述方法的实施方式中，Hsp60sp肽具有SEQ ID NO :1所示的序列。在所述方法的实施方式中，所述树突细胞是不成熟的树突细胞。
在本发明方法的实施方式中，所述受试者是人。本文所述方法、组合物和过程的各个要素的所有组合都在本发明的范围内。通过參考以下实验细节可更好地理解本发明，但本领域技术人员可容易理解具体的实验细节仅例示本发明，在下文的权利要求书中将对本发明进行更全面完整的描述。实骀细节在本文中提供了实验性证据证明能够从健康个体分离出參与人自身免疫性疾病I型糖尿病(TlD)的发生和控制的、能够差异性地调节针对自身抗原和外来抗原的免疫应答的HLA-E限制性⑶8+T细胞。此外，还提供了测定HLA-E限制性⑶8+T细胞的健康的试验并进行了测试。特异件识别靶细胞上表汰的HLA-E/Hsd60sd的人HLA-E限制件⑶8+T细胞系的津、-之前在小鼠中的研究中证明了与MHC Ib类分子Qa-I偶联的热休克肽(Hsp60sp)是常见的替代靶结构，其优先在被任何抗原活化的中等亲和カT细胞上表达并特异性地被Qa-I限制性⑶8+T细胞识别。因此，通过中等亲和カT细胞上该常见靶结构的特异性识别，Qa-I限制性CD8+T细胞能够选择性地下调中等亲和カ而非高亲和カT细胞从而在外周中实现自我/非我的区分(14，15)。为了研究HLA-E限制性人⑶8+T细胞，证实了可能从健康人的PBMC产生特异性识别与HLA-E结合的Hsp60sp的HLA-E限制性⑶8+T细胞系。因此，之前的研究表明荷载有Qa-I结合肽Hsp60sp而非Qdm的鼠树突细胞可以用作疫苗以诱导来自EAE的⑶8+T细胞依赖性保护(14)。该结果強烈提示在体内可能通过荷载有Hsp60sp的树突细胞诱导功能性Qa-1/HLA-E限制性⑶8+T细胞。采用这种方法，已经通过用荷载有Hsp60sp的自体树突细胞(称为“CD8 (H) ”)或荷载有作为对照的B7sp的自体树突细胞(称为“CD8 (B) ” )刺激纯化的外周CD8+T细胞成功地从数种DR4+健康个体产生了两种类型的人CD8+T细胞系。首先对从健康供体产生的⑶8+T细胞系进行测试以验证其识别靶T细胞上表达的HLA-E/Hsp60sp。因此，为了鉴定能够被调节性⑶8+T细胞识别的HLA-E结合肽，建立了在其表面上表达HLA-E的人细胞系。为此，建立了 HLA-E表达构建体并转染到人HLA-A、B、C缺陷型B细胞系中(18，19)。通过有限稀释产生HLA-E表达克隆并用作HLA-E提呈细胞，以鉴定靶HLA-E结合肽并测验所述HLA-E限制性⑶8+T细胞的功能。按照描述(14，20)首先通过用HLA-E特异性mAb 3D-12 (21)对荷载有所述肽的B721/E细胞染色而测定HLA-E在所克隆的B721/HLA-E转染子(B721/E)表面上的表达。图IA显示了亚克隆B721/E的代表性结果，在B721/E中B7sp和Hsp60sp都能够与HLA-E结合以稳定所述细胞表面HLA-E的表达。Hsp60sp特异件CD8+T细朐抑制荷载有Hsd60sd的HLA-E表汰细朐，伯不抑制荷载有对照肽B7sp的HLA-E表达细胞通过测验CD8 (H)细胞系对表达HLA-E且荷载有Hsp60sp、B7sp或对照HLA-E非结合肽的转染子B721/HLA-E的抑制作用，对从健康个体产生的CD8 (H)细胞系的特异性进行了研究(CD8+T细胞抑制测试)。图IB显示的结果证明与由荷载有B7sp的DC触发的⑶8+T细胞(⑶8 (B))相比，在所测验的所有个体中由荷载Hsp60sp的DC触发的⑶8+T细胞(⑶8(H))均显示对荷载有Hsp60sp而非B7sp或对照肽的HLA-E转染子的抑制。对照⑶8 (B)不抑制任何转染子。通过检测由HLA-E限制性⑶8+T细胞分泌的细胞溶解酶(CE)进一步证实了 HLA-E限制性⑶8+T细胞对在靶细胞上表达的HLA-E/Hsp60sp的特异性认知 识别(specific cognitive recognition)。因此,如图5中的代表性结果所示，当将⑶8 (H)细胞系与荷载有Hsp60sp的B721/E细胞而非荷载有对照肽B7sp的B721/E细胞共培养时，或者当将CD8 (B)细胞系与荷载有Hsp60sp或B7sp的B721/E共培养时，观察到CD8+T细胞分泌的CE (例如穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B)增加。这些观察结果与在上述⑶8+T细胞抑制测试中检测的荷载有Hsp60sp而非B7sp的CD8 (H)细胞系对靶标的特异性杀伤准确关联。这些结果表明，能够从健康人的血液产生HLA-E限制性、Hsp60sp特异性⑶8+T细胞(在小鼠中鉴定的Qa-I限制性调节性⑶8+T细胞的人对应物)。HLA-E限制件⑶8+T细胞在外周中发挥区分自我和非我的功能在成功建立且之前在小鼠研究中使用的标准T细胞增殖测试中测定CD8+T细胞系对CD4+T细胞对自身抗原MBP (或GAD)比外来抗原TT (或PPD)的免疫应答的整体亲和力的影响。因此，通过系列剂量的MBP (和GAD)或TT (和PPD)活化所纯化的自体⑶4+T细胞，并将CD8(H)细胞加入到CD4+T细胞培养物中。使用CD8(B)和“CD8(N) ”细胞(即用没有荷载肽的DC致敏(prime))作为对照。在使用GAD作为自身抗原的研究中，所选择的供体是DR4+的。如图IC所示，在图IB所示的相同个体中，与CD8 (B)或CD8 (N) *细胞相比，CD8 (H)抑制了 CD4+T细胞对自身抗原MBP和GAD的免疫应答，但增强了 CD4+T细胞对外来抗原TT和PPD的免疫应答。与在对照CD8 (B)和CD8 (N)细胞存在下对相同抗原的应答相t匕，通过在⑶8 (H)存在下对自身抗原MBP和GAD的免疫应答中整体亲和力的降低(反映为ED50的增加)显示了受抑制的免疫应答的典型图谱。然而，与在对照CD8(B)和CD8(N)细胞存在下对相同抗原的应答相比，通过在CD8(H)存在下对外来抗原TT和PH)的免疫应答中整体亲和力的提高(反映为ED5tl的降低)显示了增强的免疫应答的典型图谱。该组实验直接且明确证明了 HLA-E限制性、Hsp60sp特异性的⑶8+T细胞能够差异性地在健康人的外周中调节对自身抗原和外来抗原的免疫应答的功能。已经在所测试的多数TlD患者中检测到了由HLA-E限制件⑶8+T细胞介导的通路的缺陷在之前的研究中，已经证明Qa-I限制性⑶8+T细胞在NOD小鼠中通过自我/非我区分控制自发形成的TlD (15)。为了验证HLA-E限制性⑶8+T细胞在人TlD的控制中也发挥主要作用，测定了从10位TlD患者新鲜分离的MPBC中CD8+T细胞的功能。所选择的标准抗原是外来抗原TT和自身抗原GAD和MBP，因此在该研究的所有实验中所测验的每位患者都选择为DR4+的并且与DR4+健康正常对照配对。a)与IH常对照个体相比，从所测试的大多数TlD患者新鲜分离的CD8+T细胞都丧失了区分外周中的自我和非我的能力首先，按照以上所述，使用T细胞增殖测试评价CD8+T细胞对CD4+T细胞对自身抗原GAD或MBP比外来抗原TT的应答的影响，以评价其区分自我/非我的功能。因此，为了测定正常人CD8+T细胞能否在体外发挥区分自我和非我的功能，比较了人PBMC在CD8+T细胞存在或不存在下对自身和外来抗原的整体免疫应答。在第一组实验中，培养包含(a)⑶8+T细胞和⑶4+T细胞两者的完整的PBMC群，并利用不同剂量的GAD (和MBP)或TT培养纯化的⑶4+T细胞群。因此，认为将PBMC群单独与纯化的⑶4+T细胞群相比不能明确显示PBMC中包含的CD8+T细胞的功能。然而，在利用纯化的CD8+T细胞作为调节子进行大规模实验(表示为图1C)以显示HLA-E限制性⑶8+T细胞能够区分自我和非我，然后比较PBMC和纯化的CD4+T细胞的免疫应答并组合其它测试法可以用作对CD8+T细胞功能的快速解读。在按照所述测验TlD患者中CD8+T细胞的功能并将其与CD8+T细胞抑制测试组合中即是如此。图2显示与纯化的⑶4+T细胞相比，正常对照的PBMC中⑶8+T细胞的存在显著抑制了对自身抗原GAD和MBP的整体应答(反映为ED5tl的增加)(图2Ab)，而增强了对外来抗原TT的整体应答(反映为ED5tl的降低)(图2Aa)。然而，当对TlD患者的PBMC进行相同的测验时，PBMC和所纯化的CD4+T细胞之间应答自身抗原GAD和MBP或外来抗原TT的ED5tl均没有显著差异(图2Ac和2Ad)，这表明来自TlD患者的⑶8+T细胞丧失了区分自我和非我的能力。为了更好更清楚的了解由10位患者和相应对照的自我/非我区分测试获得的大量功能数据，需要各个个体的除ED5tl以外的另外的较简单但却有意义且可靠的参数以评价T细胞的功能。因此，本发明公开了在所测验的所有正常个体中，在不存在HLA-E限制性CD8+T细胞的情况下，外来抗原(TT或PPD)引发T细胞的最大增殖所需的抗原剂量总是高于自身抗原(GAD或MBP)。当在正常对照的⑶4+T细胞培养中存在HLA-E限制性⑶8+T细胞时，这种状况被逆转。对来自6位对照和10位TlD患者的数据进行统计学分析。当在所有正常对照中存在调节性CD8+T细胞时，观察到引发应答自身抗原GAD和MBP的增殖所需的抗原剂量和引发应答外来抗原TT和PPD的最大增殖所需的抗原剂量之间具有非常显著的差异。在新鲜分离的淋巴细胞和体外致敏的CD8T细胞中均观察到了这种结果。然而，不论存在CD8+T细胞与否，观察到从多数TlD患者新鲜分离的淋巴细胞引发最大增殖所需的自身抗原和外来抗原剂量之间没有任何差异(表2)。为了获得该观察结果，设想了一个新参数一自我和非我区分指标(SND指标)。SND是各个个体中对自身抗原的应答比对外来抗原的免疫应答而引发最大量T细胞增殖的抗原剂量的相关性。利用SND指标作为参数将来自10位TlD患者和6位正常对照的结果(10次测试)、总结于图3C。因此，在缺乏⑶8+T细胞的⑶4+T细胞培养物中，TlD患者和正常对照对外来抗原TT应答和自身抗原应答的SND指标之间均没有差异(P > O. 05)(参见表I)。然而，与图2Aa和2Ab所示的代表性结果相一致，在含有CD8+T细胞的PBMC培养中，所有正常对照都显示不同的图谱——对自身抗原GAD的应答的SND指标增加并显著高于对外来抗原TT的应答。在所测验的所有个体中，引发最大增殖所需的外来抗原剂量相比之下显著降低(P< O. 05)。这显示在正常的健康个体中受到良好控制的自身反应性。相比之下，在存在⑶8+T细胞和不存在⑶8+T细胞的情况下，在10位TlD患者中有9位均显示相同的SND指标分布图谱除了患者#4)。这显示了这9位患者对自身抗原GAD的不受控制的自身反应性(表2)。该观察结果进一步被9位TlD患者对另一自身抗原(MBP)的增加的反应性所证实(参见图4和表)。这些观察结果与所测试的多数TlD患者的CD8+T细胞均在区分自我和非我的功能上具有缺陷的观点相一致。表I :新鲜分离的⑶4+T细胞和⑶8+细胞即PBMC(T1D患者和正常对照)对外来
抗原TT和自身抗原GAD的应答的T-检验。使用SND指标作为参数进行T-检验以分析从
自我/非我区分测试中获得的数据。
权利要求
1.測定受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括 a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触； b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的増殖； c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触； d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和 e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖， 其中步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的⑶8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp 革E结构。
2.測定受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括 a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触； b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的増殖； c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有B7sp肽的HLA-E+细胞接触； d)量化步骤c)中的荷载有B7sp肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和 e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖， 其中步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的⑶8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于或等于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA_E/Hsp60sp 革巴结构。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中步骤a)和/或步骤c)中的所述受试者的CD8+T细胞样品是从所述受试者获得的外周血单核细胞样品。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。
6.測定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括測定所述受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的増殖，其中如果所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别所述细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的増殖，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。
7.如权利要求6所述的方法，其中通过以下步骤測定所述受试者的CD8+T细胞是否能够功能性地识别所述细胞表面上的HLA-E/Hsp60sp靶结构并抑制所述细胞的増殖 a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触； b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的増殖； C)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触； d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和 e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖， 其中步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp祀结构。
8.測定不知道患有自身免疫性疾病的受试者是否具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向的方法，所述方法包括測定所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我，其中如果所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能区分自我和非我，则所述受试者具有发展为所述自身免疫性疾病的倾向。
9.如权利要求8所述的方法，其中測定所述受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我包括 A) i)使所述受试者的CD4+细胞群与(a) —定量的自身抗原和(b) —定量的抗原提呈细胞接触，从而由此活化所述CD4+细胞群； )洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原； iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和一定量的所述抗原提呈细胞群； iv)量化所述活化的CD4+细胞的増殖；和 V)利用不同量的自身抗原重复步骤A)i)至步骤A) iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測定自身抗原的ED5tl; B) i)使所述受试者的CD4+细胞群与(a)外来抗原和(b) —定量的抗原提呈细胞接触，从而由此活化所述CD4+细胞群； )洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述外来抗原； iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养来自步骤B)ii)的部分所述活化的CD4+细胞群和一定量的所述抗原提呈细胞群； iv)量化来自步骤B)iii)的所述活化的CD4+细胞的增殖；和 V)利用不同量的外来抗原重复步骤B) i)至步骤B)iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的外来抗原的量并由此測定外来抗原的ED5tl ； 其中步骤A)和B)能够以任意顺序进行； 和 C)比较所述自身抗原的ED5tl和所述外来抗原的ED5tl, 其中所述外来抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞不能区分自我和非我，而其中所述外来抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述CD8+T细胞包含在从所述受试者获得的外周血单核细胞样品中。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述CD8+T细胞是HLA-E限制性的。
12.測定受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我的方法，所述方法包括 A) i)使纯化的CD4+细胞群与(a) —定量的自身抗原和(b) —定量的抗原提呈细胞接触，从而由此活化所述CD4+细胞群； )洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原； iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分所述活化的CD4+细胞群和一定量的所述抗原提呈细胞群； iv)量化所述活化的CD4+细胞的増殖；和 V)利用不同量的自身抗原重复步骤A)i)至步骤A) iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測定所述纯化的CD4+细胞群的自身抗原的ED50 ； B) i)使从所述受试者获得的外周血单核细胞样品与(a)自身抗原和(b)抗原提呈细胞群接触，从而由此活化CD4+细胞群； )洗涤所述活化的CD4+细胞群从而除去所述自身抗原； iii)在所述受试者的CD8+T细胞群存在下共同培养部分步骤B)ii)的所述活化的CD4+细胞群和一定量的抗原提呈细胞； iv)量化来自步骤B)iii)的所述活化的CD4+细胞的增殖；和 V)利用不同量的自身抗原重复步骤B) i)至步骤B) iv)，从而测定引发所述活化的CD4+细胞的最大増殖所需的自身抗原的量并由此測定所述外周血单核细胞样品的自身抗原的ED50 ； 其中步骤A)和B)能够以任意顺序进行； 和 C)比较所述自身抗原的ED5tl和所述外来抗原的ED5tl, 其中所述外来抗原的ED5tl高于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞不能区分自我和非我，而其中所述外来抗原的ED5tl等于或小于所述自身抗原的ED5tl表明所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。
13.測定受试者的⑶8+T细胞是否能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，所述方法包括 a)使所述受试者的⑶8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触； b)量化步骤a)中的荷载有Hsp60sp且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的増殖； c)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触； d)量化步骤c)中的荷载有不与HLA-E结合的所述肽且与所述受试者的CD8+T细胞接触的HLA-E+细胞的增殖；和 e)比较步骤d)中量化的増殖和步骤b)中量化的増殖，其中步骤d)中量化的増殖的量大于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，而其中在步骤d)中量化的增殖的量小于步骤b)中量化的増殖的量表明所述受试者的CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp祀结构。
14.如权利要求13所述的方法，其中步骤a)和/或步骤c)中的所述受试者的CD8+T细胞样品是从所述受试者获得的外周血单核细胞样品。
15.如权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
18.测定受试者是否可能发展为自身免疫性病症的方法，所述方法包括測定受试者的CD8+T细胞是否能够区分自我和非我，其中CD8+T细胞不能区分自我和非我的受试者被确定为可能发展为自身免疫性疾病。
19.如权利要求18所述的方法，其中通过权利要求12所述的方法来确定所述受试者的CD8+T细胞能够区分自我和非我。
20.測定患有自身免疫性疾病的受试者是否能够通过施用荷载有Hsp60sp的细胞治疗所述免疫疾病的方法，所述方法包括測定所述受试者的CD8+T细胞是否功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构，其中CD8+T细胞不能功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的患有自身免疫性疾病的受试者被确定为能够通过施用荷载Hsp60sp的细胞来治疗。
21.如权利要求20所述的方法，其中通过权利要求13所述的方法确定所述受试者的CD8+T细胞能够功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构。
22.測定受试者的HLA-E限制性⑶8+T细胞是否被HLA-E/Hsp60sp活化的方法，所述方法包括 a)使从所述受试者获得的包含HLA-E限制性⑶8+T细胞的样品与包含HLA-E/Hsp60sp的组合物接触；和 b)检测步骤(a)是否引起所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞分泌细胞内细胞溶解酶， 其中所述样品的HLA-E限制性CD8+T细胞分泌细胞内细胞溶解酶表明所述受试者的HLA-E限制性⑶8+T细胞被HLA-E/Hsp60sp活化，而其中在步骤b)中没有可检测的细胞内细胞溶解酶的分泌表明所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞没有被HLA-E/Hsp60sp活化。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述包含HLA-E/Hsp60sp的组合物是经转染表达HLA-E且荷载有Hsp60sp的细胞。
24.如权利要求22或23任一项所述的方法，其中所述经转染表达HLA-E的细胞是B721细胞。
25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述细胞内细胞溶解酶是穿孔素、颗粒酶A或颗粒酶B。
26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品或者源自血液。
27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其中通过使所述样品与结合有可检测的标记物的抗细胞溶解酶抗体接触来检测所述细胞溶解酶。
28.鉴定样品中的功能性HLA-E限制性⑶8+T细胞的方法，所述方法包括 a)使所述样品与包含HLA-E/Hsp60sp的组合物接触；和 b)检测步骤(a)是否引起所述样品的细胞分泌细胞内细胞溶解酶， 其中所述样品的细胞分泌细胞内细胞溶解酶表明所述样品包含功能性HLA-E限制性⑶8+T细胞。
29.预防性地治疗受试者而免于发展为自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞并由此预防性地治疗所述受试者而免于发展为所述自身免疫性疾病。
30.治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用荷载有Hsp60sp肽的树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞并由此治疗所述自身免疫性疾病。
31.治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法,所述方法包括 a)测定从所述受试者获得的HLA-E限制性CD8+T细胞是否能够区分自我和非我；和 b)如果在步骤a)中測定的所述受试者的HLA-E限制性CD8+T细胞不能区分自我和非我，则向所述受试者施用荷载有Hsp60sp的外来体或树突细胞从而活化所述受试者中的HLA-E限制性CD8+T细胞并由此治疗所述自身免疫性疾病。
32.如权利要求29、30或31所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是I型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、硬皮病、系统性红斑狼疮，在实施方式中，所述自身免疫性疾病是斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板減少性紫癜(ATP)、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克隆氏病、德戈斯病、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格-巴ニ氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、幼年型关节炎、狼疮、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、赖特氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、全身肌強直综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风或韦格纳肉芽肿。
33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述Hsp60sp肽具有SEQID ΝΟ:1所示的序列。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述树突细胞为不成熟的树突细胞。
全文摘要
本发明涉及测定受试者的CD8+T细胞是否功能性地识别HLA-E/Hsp60sp靶结构的方法，该方法包括a)使所述受试者的CD8+T细胞样品与荷载有Hsp60sp的HLA-E+细胞接触，b)量化所接触的HLA-E+的增殖，c)使受试者的CD8+T细胞样品与荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞接触，d)在接触受试者的CD8+T细胞后量化荷载有不与HLA-E结合的肽的HLA-E+细胞的增殖，e)比较在步骤d)中量化的增殖和步骤b)中量化的增殖。
文档编号G01N33/53GK102725634SQ201080037955
公开日2012年10月10日 申请日期2010年8月24日 优先权日2009年8月24日
发明者L·舍斯, 蒋红 申请人:纽约市哥伦比亚大学理事会