用于形成应用适体生物传感器的稳态环的方法和装置的利记博彩app

专利名称：用于形成应用适体生物传感器的稳态环的方法和装置的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及化学生物传感器。更具体而言，本发明涉及固定并联板化学生物传感器和电容器阵列以及制造它们的方法。
背景技术：
血管内皮生长因子(VEGF)在正常血管发生期间以及在出现在包括癌症的许多疾病中的病理血管发生中起到关键作用。通过使用人源化单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab) (Avastin, Genentech/Roche)以及革巴向 VEGF 受体(VEGFR)酪氨酸激酶的两种激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib, Nexavar ；Bayer)和舒尼替尼(sunitinib, Sutent,Pfizer)阻断VEGF的初步努力开始在人癌症患者中显示出希望，凸显了优化VEGF阻断的重要性。人肿瘤的生长和转移的发生依赖于全新形成血管，以达到低氧肿瘤微环境并向其提
供养分。新血管形成受到靶向受体酪氨酸激酶(RTK)的特异性生长因子高度调节。VEGF和Flk-l/KDR RTK作为关键的内皮细胞特异性因子参与病理血管发生所需的信号传递通路，包括肿瘤新血管发生。在正在生长的肿瘤中抑制VEGF酪氨酸激酶信号传递通路可阻断新血管形成，导致肿瘤生长停滞或消退。血管发生的生物学理解方面的进展已经导致开发了数种治疗形式，用于抑制VEGF酪氨酸激酶信号传递通路。许多的这些形式正进行临床研究以评价它们治疗多种形式的人癌症的可能性，但这类研究的能力受限于这样的事实，即不容易进行VEGF水平和VEGF转导趋向的实时体内测量。在正常发育中，VEGF是胚胎发生(血小管发生(vasculogenesis))和成体血管形成(血管发生(angiogenesis))中血管发生的关键调节物。在肿瘤发展中，活化VEGF通路可促进肿瘤血管化，有利于肿瘤生长和转移。异常VEGF功能还与包括动脉粥样硬化、银屑病、老年性黄斑变性、糖尿病失明、类风湿关节炎和甲状腺功能亢进的其他疾病相关。VEGF和VEGF-受体蛋白家族的成员具有不同但重叠的配体-受体特异性、细胞类型表达和功能。VEGF-受体活化反过来又可调节身体中促进内皮细胞生长、迁移和存活的信号传递过程的网络。可连续监测其周围环境以提供对不健康状态的背景统计和警示的生物传感器已知被用于医学技术中。以下是对现有技术的简要综述，包括对一些现有技术生物传感器的详述。文献详情通过本申请文本中记载的参考文献引用。例如，有许多重量分析生物传感器(gravimetric biosensor)的实例。检测基础是当各种分析物连接至共振元件时发生的共振器的共振频率降低。对生物分子分析物的分析物特异性是通过用配体功能化(处理)所述共振器的暴露表面而被赋予的，所述配体可识别并结合于多种所述靶分析物。靶生物分析物的合适结合实体的实例包括抗体、受体、凝集素、适体和寡核苷酸。在一个重量分析生物传感器中，所述固定的结合基团位于所述膜表面上的一个或多个区域中，所述区域在所述膜上的定位、大小和区域固定密度被设计成使靶分析物结合时观察到的频率和/或幅度偏移最大化并且使特异性结合和非特异性结合的所有组合之间的区别最大化。该区别可以采取三种形式(a)所述膜的共振频率的改变，(b)较高阶谐振出现或消失，或者(C)振幅衰变率的改变。在这类生物传感器中，单个的膜可以包括多个用于致动和用于传感目的的个体可寻址元件。该技术使得可以特异性刺激所选择的较高阶振动模式并且使得能够同时振动致动警报电路或类似装置。声波一有时被称为重量分析传感器一的原理是公知的，其应用在文献中出现已达十年以上。分子相互作用可以通过生物大分子的极化率而用电子方法检测到，通过使用发荧光的标签而用光学方法检测到，通过使用放射性标记的标签而用放射测量法检测到，或者用声学方法检测到。最近，基于MEMS的传感器已被纳入生物技术和生物医学领域中。应用声学生物传感器的范围包括细胞检测、葡萄糖生物传感、抗体-抗原识别和蛋白质吸收。压电石英晶体微量天平(QCM)从20世纪50年代后期已经被用于检测气相和液相分析物。QCM技术在最近被应用于生物学分析物。QCM已被用于跟踪蛋白质被非特异性吸收至未改性的和改性的石英晶体表面电极上。将抗体固定于所述晶体表面可赋予分析物特异性。由于现有技术很广泛，所以发明人选择引用生物传感器领域的一些基础革新，因为这提供了大多数先进应用均基于其上的原理，例如Arwin et al.。美国专利4，072，576教导了一种用于研究生物化学反应的方法，其中活性或浓度待测的物质影响所述生物化学反应的特异性底物，所述方法包括提供涂敷有所述底物的电极，在包含所述电极的测量装置中确定电容作为控制值，将所述物质引入至所述测量装置，测量电容变化，从而获得所述样品中存在的物质的活性或浓度的定量测量值并影响所述电极上的特异性底物。Schenck美国专利4，238，757描述了，包括常规源极和漏极的场效应晶体管在栅极区应用了一层对具体抗原特异性的抗体层。所述抗体层上的电解质溶液(例如0. 155生理盐水)可为所述装置提供依漏极电压特性为转移的预设漏极电流。将所述电解质溶液换成包含所述抗原的另一种电解质溶液会由于抗原-抗体反应而改变所述蛋白质表面层的电荷，因此影响所述晶体管中半导体反型层的电荷浓度。因此漏极电流的时间变化率可提供所述替换溶液中抗原蛋白浓度的测量值。Rice美国专利4，314，821描述了一种用于在包含能够结合抗原的干扰物质的液体样品中确定免疫反应活性物质总量的方法和试剂盒。所述方法包括以下步骤使包含或疑似包含抗体的液体样品与压电振荡器表面接触，所述压电振荡器具有对连接于其上的抗体特异性的抗原层；洗涤并干燥所述振荡器；测量所述振荡器的共振频率；使所述振荡器表面与液体试剂接触，所述液体试剂包含过量的与结合于所述振荡器的所有抗体特异性反应的物质。此外，洗涤并干燥所述振荡器；并测量所述振荡器的共振频率相对于初次测量值的变化，从而使结合于所述振荡器的总抗体量区别于在先步骤中结合的干扰物质。Malmros美国专利4，444，892提出了一种用于确定介质中分析物浓度的传感器和半导体装置。所述装置的特征是，由半导体有机聚合物构成的元件与对所述分析物有特异亲和性的结合物质相结合。Iida等人的美国专利4，900, 423教导了这样的技术，即其中公开了包含特异性作用于底物的酶的酶传感器和用于将酶反应过程中产生或消耗的物质或热的定量变化转换成电信号的换能器，其中所述酶是葡糖激酶。Iida教导了确定样品中葡萄糖的量是可能的，并教导了精确确定腺苷-5'-三磷酸(ATP)。在长期使用后所述传感器的响应时间几乎恒定，检测率的降低非常小。

发明内容
提供如下发明内容以有利于对本发明特有的一些创新特征进行理解，但不是意欲进行全面描述。对本发明各个方面的全面了解可以通过将整个说明书、权利要求书、附图和摘要作为一个整体考虑而实现。在阅读说明书后，对本领域普通技术人员来说本发明的其他目标和优点将是明显的。本发明描述了一种具有如下体系结构的装置，即所述体系结构可用于构建用于无标记物检测VEGF杂交的固态生物传感器。在一个实施方案中，所述装置是通过以下方式实现形成并联电容器的矩阵阵列，目的是达到高的信号与最小电化学变化的比，并伴随电等值，从而可获得低成本、便携、完全集成的装置。本发明涉及形成生物传感器，更具体而言涉及集成平台类型的电容阵列，所述集
成平台类型是使用固态制造技术和被称为适体(选择用于与分子靶高亲和性结合的寡核苷酸配体)的寡核苷酸元件制造，所述适体可形成所述电容器板的电介质和杂交表面。所提出的发明的目标是将肿瘤发生的生长率模拟为所述传感器腔中其VEGF水平的函数，同时测量VEGF分子对所述电容器板的结合率，VEGF分子的肿瘤结合率的向量/趋势由所述装置的等效电路模拟。所述生物电容器计算所述系统的状态，目的是进一步作为用于所述目标腔中VEGF浓度的电平开关检测器(level-switch detector)。如上文所述，VEGF在正常血管发生期间以及在出现在包括癌症的多种疾病中的病理血管发生中起到关键作用。通过使用人源化单克隆抗体贝伐单抗(Avastin, Genentech/Roche)以及靶向VEGF受体(VEGFR)酪氨酸激酶的两种激酶抑制剂索拉非尼(Nexavar ;Bayer)和舒尼替尼(Sutent, Pfizer)阻断VEGF的初步努力在人癌症患者中显示出希望，凸现了优化VEGF阻断的重要性。因此，对于任何精细调节的抗血管生成疗法，这样的体内植入装置是关键的，即该装置可精确地提供有关VEGF水平的实时反馈，从而能够合理地调节、减弱或修改抗血管形成剂的摄取。本文描述的系统通过模拟以下过程测量VEGF水平其中VEGF在已知时域内结合于固定VEGF适体，从而基于调节回路中的VEGF水平提供合适的反馈。VEGF蛋白和它们的受体之间的相互作用由所述装置腔中受控条件下所述适体和所述VEGF受体的各个结合注释。信号传递事件及其生物学结果的详情可通过模拟所述VEGF分子结合于本发明装置的腔中存在的适体的结合率简明地描述；因此，这类并行过程可提供本发明装置的等效电路的必需定量趋势和浓度值。呈现了本发明VEGF检测器的制造，使用了对用于制造微型装置的技术和设备的显著改进，因此概述了微机械设备的使用。硅制造和高精机械的改进开辟了用于研发应用的现在称为微电子机械系统(MEMS)的领域。随后开发的微型阀、泵、槽和热交换器使得可操作极其小的流体体积。与集成电路(IC)和MEMS领域中改善的大规模制造技术结合，微流装置和微化学系统被应用于实现本发明。在本发明中，微量溶液可用于使成本和影响最小，并且可延长寿命，这是因为消耗品的使用受限和监测肿瘤生长过程的内在需求以及排除超过一次性使用的耐久。本发明提供了一种先进的构型，所述构型包括协同且可变通的传感器系统，以多个装置操作于单个流体样品以借助板载处理逻辑块进行全自动化学分析。
如上文所述，用于检测目的分子存在情况的生物传感器可应用于多个领域，包括医学诊断、生物医学研究以及检测生物和化学战争中使用的试剂。存在对具有高敏感性的廉价、袖珍传感器的需求，所述传感器用于在实时、体内、无标记物环境中检测VEGF分子，目的是报告状态例如趋势和浓度，并进一步使得可以形成闭合反馈回路以使用例如本发明指出的药物疗法有效地调节(减弱、改变)所述生物活性。这样的装置公开于本发明中。利用基于适合结合VEGF分子的适体的电化学结合的机制，所述装置可以检测所述VEGF分子的存在情况。在一个实施方案中，所述传感器具有电极性，目的是在进一步调整所述电路的阈电压时自然地吸引VEGF分子的本身带的负电荷。在一个实施方案中，所述电极性可以被调整，目的是吸引并然后释放所述VEGF分子，以阻止VEGF分子在所述传感器上积累并且以保持生物流体连续流经所述传感器。所述传感器是用优选地以p-Si底物编码的电极构建，目的是增强所述VEGF分子和改变所述电路的阻抗(电容)的适体之间的亲和力。对这类传感器的需求还通过使用这样的流体电池强化，即该流体电池被配置以使VEGF样品可在所述芯片的活性表面流动。所述装置可以具有并联电容器阵列，其可作为集成的个体反电极发挥作用。所述装置还可以装配有计算装置，目的是使得可随时域传感输出，使得可检测、报告并形成稳态环(homeostatic loop)。所述装置的输出优选地被配置为活性送递机构的一部分，所述送递机构用于测量以及可能的医药剂的治疗介入。所述装置可以提供准确测量且可定量的VEGF分子的体内变化率并且使得可提高对肿瘤标记物的诊断。由于这些信息(VEGF水平和向量趋势(vectorial trend)),所述装置和其辅属电路可改良化学治疗剂和生物学反应调节剂(BRM)的送递系统，用于降低和消除肿瘤负荷的目的。在一个实施方案中，提供了一种不但温和且可逆，而且简单且稳健(robust)的方法，所述方法可以在一次操作中可靠地检测VEGF分子和/或建立用于进行所述方法的相关布置(arrangement)。通过方法步骤的具体适体序列的结合，根据本发明的至少一个实施方案可以实现一个目标。可以包括相关布置，用于执行至少一个实施方案的方法。在至少一个实施方案中，在每个情形下在所述VEGF适体结合于循环系统VEGF后进行测量，在所述时域中计数、保存并报告其电值。在一个具体的进一步改进中，所述至少一个实施方案的方法可有利地利用电化学检测的方法，特别是氧化还原循环结合适体标记物。所述适体捕获分子位于固体载体物质上，优选地在具有绝缘电极的硅芯片上。用于监测和控制所述芯片矩阵阵列位置上VEGF分子的杂交的至少一个装置，以及用于控制液体流速的装置和相关检测装置存在于至少一个实施方案的布置中。为此目的，在至少一个实施方案中，所述传感器芯片可以连接于包括精密泵的微流系统。微流系统的一个实例记载于2008年6月20日提交、题为“Magnetic Breather Pump and Methodfor Treating a Brain Tumor Using the Same”的美国专利申请 12/143，720 中，该专利申请全文通过引用的方式纳入本文。多个实施方案涉及用于多重生物测定的信号放大方法。一般而言，生物靶复合体可由可以催化表面增强底物(例如适体)形成的种子物质加上标签。然后，所述靶复合体可以结合于包括VEGF标记物的捕获剂。然后，通过还原固定的VEGF适体(Macugen)而在所述种子物质上生成所述底物。所述祀信号被哌加他尼(Pegaptanib)( 一种适体,聚乙二醇化的改性寡核苷酸)检测，哌加他尼采取能使它结合于细胞外VEGF的三维构象(在体外测试条件下，哌加他尼可结合于主要病理VEGF165同种型(isoform))。因此，在一个实施方案中，提供了包括与第一特异性结合成员关联的靶分析物的生物靶复合体。所述靶复合体还包括可结合于所述第一特异性结合成员形成靶复合体的第
二特异性结合成员。所述第二特异性结合成员包括适合用于催化表面增强的适体VEGF底物的形成的种子颗粒(seed particle)。随后，所述复合体底物可以借助所述电子电路活化，以提供所必需的阻抗效应变化。这些重要目标和其他重要目标根据如下对本发明的描述将变得清晰。


附图——其中同样的参考数字在所有各个视图中是指相同或功能相似的元件并且其被纳入说明书中并形成说明书的一部分——进一步对本发明举例说明，并且与具体实施方式
一起用于解释本发明的原理。图I是所述装置的正投影截面，图示电子检测模块。图IA图示了本发明的优选实施方案，描绘来自所述电容器阵列的等效电极-电解质节点的一个单元。图2是VEGF检测器的电容布置的等轴视图的截面。图2A是电容VEGF传感器的正投影图的俯视图。图3图形描绘了所述VEGF传感器杂交元件。图3A是所述VEGF检测器的截面俯视图。图3B图形描绘了结合适体位点与其组成元件。图4是生物传感器电容器阵列的横截面，其矩阵阵列设计包括腔罩。图4A图示了描绘所述等效电路的所述电容器矩阵阵列。图5是配置在所述送递装置框图内的VEGF检测器的可能设计。图5A是所述优选实施方案的示意性框图——生物传感器被纳入作为检测、分析和报告系统的一部分。图5B是应用所述生物传感器的优选实施方案时形成的稳态环的示意性框图。
具体实施例方式除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的相同。虽然与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明的主题，但还是将描述所述方法、装置和材料。本文提及的所有出版物通过引用的方式纳入本文，目的是为了描述并公开所述出版物中报告的可能用于本发明的材料和方法。本文中任何内容都不能被解释为承认本发明由于在先发明而晚于这些公开物。本文使用的“ VEGF和抗VEGF适体杂交”，是指VEGF I与VEGF适体11的杂交过程，经VEGF和所述适体之间的分子识别实现。所述适体在其肝素结合结构域(HBD)而不是更为人所知的受体结合结构域处特异性结合于所述VEGF165同种型，同时大部分结合能由HBD贡献(3kcal/mole或总体的23% )。VEGF的肝素结合结构域与任何已知蛋白均无显著的序列或结构相似性，因此代表一种新型的肝素结合结构域。大多数荷正电的氨基酸侧链位于羧基末端亚结构域的一个侧链上，或者位于氨基末端亚结构域中的邻近无序环上。所观察到的表面电荷分布表明这些残基组成了肝素相互作用位点。HBD不但在体外而且在体内都是VEGF165-适体复合体中亲和性和特异性的主要决定因素。本文使用的“表面修饰”，是指Y. Han et al.，2005描述的过程，Y. Han et al.，2005描述了准备SiO2表面14，为将其在室温下以MeOH/HCl (1/1)清洁30分钟，以超纯水
(Milli-Q Gradient AlO 18.2 M' Q)冲洗，并以氩气干燥。在下一步骤中，通过以3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的硅烷化步骤或者在气相中将所述表面以NH2基团修饰。为了进行气相硅烷化，将所述芯片置于包含几滴甲硅烷的干燥器中。将所述干燥器密封并加热到100°C以上，使所述芯片在低压(约Imbar)下与甲硅烷蒸气反应1_2小时。该技术应用生物相容的支架以提供可行的替代物，形成用于粘附的假体材料。使用经自组装的肽两亲化合物纳米纤维涂敷的支架来生长连接体12是有利的，由于其具有大的表面积(所述大的表面积使得可以存在大量位点用于琥珀酸酐12)、粘附和生长(琥珀酸酐也称为二氢_2，5-呋喃二酮，是分子式为C4H4O3的有机化合物)。所述涂层的纤维性质使得连接体12可以通过扩散穿透所述表面，并且所述基质具有足够的表面积并暴露于连接体12。连接体12还与氨基-硅烷化13结合(将石英或玻璃晶圆(SiO2 14)的表面以不同的氨基硅烷溶液处理，其中表面密度随反应时间流逝而快速增大并产生所述多层)。氨基-硅烷化13，支架提供可行的替代物，形成用于粘附于所述SiO2绝缘体表面14的假体材料。本文使用的“适体固定”，是指H. S. Lee等人详细说明的过程，H. S. Lee等人描述了固定，借此抗VEGF RNA适体Macugen (650 U g/管；3管)溶解于磷酸盐缓冲液(PB，200mM,pH 8)中，以制备浓度为20mM的适体溶液。将每个管在室温下孵育4小时。之后，加入适体溶液(500 iiL)并将其在pH 7. 5和室温下孵育。将所产生的底物以磷酸盐缓冲液(PBS)和水以惯序方式洗涤。最后，将所述底物空气干燥，通过原子力显微镜(AFM)分析所述固定，表明由于固定抗VEGF适体使得表面厚度平均增加约3nm。使用单链核酸(适体)作为蛋白结合的亲和分子的概念，最初记载在1990年(Ellington and Szostak 1990,1992 ；Tuerk and Gold 1990),并且是基于短序列在存在靶的情况下折叠成独特三维结构的能力，所述三维结构以高亲和性和特异性结合所述靶。E. ff.M Ng et al.，2006描述了适体是选择用于高亲和性结合于分子靶的寡核苷酸配体。例如，哌加他尼钠(Macugen ;Eyetech Pharmaceuticals/Pfizer)是抗血管内皮生长因子(VEGF)-165的RNA适体，该VEGF同种型主要负责病理性眼部新血管形成和血管渗透性。由于哌加他尼钠对VEGF分子I的结合亲和性而使用它，哌加他尼钠是长28个核苷酸的且末端为五氨基连接体的寡核苷酸的共价缀合物，两个20kda单甲氧基聚乙二醇(PEG)单元经赖氨酸残基上的两个氨基共价连接于所述五氨基连接体。将固定的适体复合体用于检测循环系统VEGF165同种型I。本文使用的“制造硅绝缘体表面”，是指由HS Lee et al.，2008详述的过程，HSLee et al.，2008描述了被沉积以形成绝缘罩17内部交错电极阵列103的Au层(100 y m)。用于P型掺杂的硅晶体15在Au导体表面16上生长，在50 Torr气压下和530°C下以SiH4前体的恒流。在该过程中，在SiH4 B2H6的相对压力比为10 1X10_3下，硅晶体与作为p型掺杂剂的B2H6原位掺杂。当所述p型底物15达到I ii m时，SiH4流继续但B2H6停止。在添加的Si层达到IOnm后，停止SiH4流；将温度升高至820°C并将气室向大气压开放，使得在干燥气氛中氧化以形成SiO2绝缘层14。本文使用的“捕获剂”是能够结合靶分析物或靶试剂的分子或化合物，所述捕获剂可以直接或间接地连接于基本上固体的材料。所述捕获剂可以是任何这样的物质，即对于该物质存在天然的靶分析物(例如抗体、多肽、DNA、RNA、细胞、病毒等)，或者对于该物质可
以制备靶分析物并在测定法中所述捕获剂可以结合于一种或多种靶分析物。本文使用的“靶分析物”，是待使用本发明检测的测试样品中的物质。所述分析物可以是任何这样的物质，即对于该物质存在天然的捕获剂(例如抗体、多肽、DNA、RNA、细胞、病毒等)，或者对于该物质可以制备捕获剂并在测定法中所述靶分析物可以结合于一种或多种捕获剂。“靶分析物”还包括任何抗原物质、抗体和它们的结合物。所述靶分析物可以包括蛋白质、肽、氨基酸、碳水化合物、激素、类固醇、维生素、药物(包括用于治疗目的给予的药物以及用于非法目的给予的药物)、细菌、病毒以及任何上述物质的代谢产物或抗体。本文使用的“靶分析物类似物”是指可与分析物捕获剂交叉反应的物质，但它的交叉反应程度比所述靶分析物本身的交叉反应程度大或者小。所述靶分析物类似物可以包括经修饰的靶分析物以及所述靶分析物分子的片段化部分或合成部分，条件是所述靶分析物类似物具有至少一个与目标祀分析物相同的表位位点(epitomic site)。本文使用的“测试样品”是指包含待使用本发明检测和测定的靶分析物的电解质溶液。所述测试样品除了包含靶分析物外还可以包含其他组分，可以具有液体或气体的物理性质，并且可以是任何大小或体积，包括例如液体的流动流。所述测试样品除了包含所述靶分析物外还可以包含任何物质，条件是这些其他物质不干扰所述靶分析物与所述捕获剂的结合或者所述第一结合成员与所述第二结合成员的特异性结合。测试样品的实例包括但不限于血清、血浆、痰、精液、尿、其他体液以及环境样品，例如地下水或废水、土壤提取物、空气和农药残留物。本发明人为了分析和测试本发明装置而使用的“方法和试剂”，是基于HS Lee etal. ,2008文献所提供的信息。如下试剂不经进一步纯化即可用于鉴定所述方法3_氨丙基二乙氧基硅烷(APDES)、琥珀酸酐(SA)、碳酸钠(SC)、磷酸盐缓冲液(PBS)片剂、十二烷基硫酸钠(SDS)、I-乙基-3-[3-( 二甲氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl) (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO)。作为检测蛋白的人 VEGF165 购自 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)。据报道，人VEGF165编码cDNA被亚克隆至表达载体中并在酵母中表达。据报道，重组人VEGF165同二聚体被进一步纯化并保存在包含0. 1% BSA的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中。使用BIAcore 2000仪器进行表面等离子共振技术(SPR)。使用带有Nanoscope IV软件的数字AFM仪器拍摄原子力显微镜(AFM)图像。将Tescan扫描电子显微镜(SEM)和纳米图形生成系统(NPGS)用于电子束曝光。本发明使用的“抗VEGF适体的合成”是指使用体外选择方法(SELEX，指数富集的配体系统进化)从合成核酸组合文库分离适体。所述“SELEX”方法是指这样的技术，即通过选择和扩增的反复循环以随机序列筛选非常大的寡核苷酸文库。如札S Lee et al.，2008中所详述的，以寡核苷酸使用固相亚磷酰胺化学合成具有胺末端基团的抗VEGF RNA适体。合成适体的序列是5/ -NH2-AmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAmU-3'。“合成的抗VEGF RNA适体的结合亲和性”是指使用表面等离子共振技术(SPR)分析(Kang et al. , 2008)来分析两个生物分子之间的相互作用。本发明使用的“抗VEGF RNA适体”是指将抗VEGF RNA适体以大约30nM至500nM的浓度溶解于磷酸盐缓冲液中，然后将其注入至所述传感器芯片上固定的VEGF之上。所述VEGF上对适体的吸收可导致适体-VEGF复合体的形成。本发明使用的“效应传感器几何形状”是指所述生物传感器的物理几何形状Gx以及以最小体积使感测面积最大化的其传感结构的布置。另外，通过所述传感器的流的横断面积必须大于所述流入口和流出口的横断面积，以使得所述传感器的物理几何形状不妨碍整个系统的流特征。由于所述传感器的几何形状所致的电容^_@记载于方程I中，使用电介质(e r)作为与测试样品中靶分析物浓度相关的变量。
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,霧(I)其中L是由VEGF分子(杂交后)、体液、抗VEGF适体、琥珀酸酐连接体、氨基杂交物质、SiO2绝缘体和P-Si底物组成的介质的组合相对电容率(介电常数)；e ^是自由空间的电容率(8. 854X 10_12F/m) ；A是具有宽52和长53的电极板的总面积；d是板之间的间距51。选择A和d的值，使得所述电容变化可以以如下的技术有效地测量，但通过所述传感器单元100的所述体液环流不受限制。由于当VEGF结合时所述表面的厚度是约200nm的事实，所述间距可以小至数微米，而没有由于VEGF杂交限制所述流的风险。然而，因为deap 51和Wcap 52形成的横断面积必须至少与流入口和流出口的横断面积一样大，使得通过所述传感器的其流体流不会限制总体流特征。例如，假设3 French的入口直径，从微流体学角度，通过所述生物传感器的流体流的最小横断面积(CleapXWeap)分别是大约100mmX8000mm。方程I中唯一的变量是随VEGF与所述表面分子的杂交而变化的组合介电常数L。为了使小体积中的有效感测面积最大化，将电极板103以交叉指型模式布置。按照上文描述的绝缘体制作过程，一个传感器板的组合厚度是102. 02um(电极、两层P-底物和两层绝缘体的厚度之和)。宽度d(板之间的距离51)为100 iim，每对电极所需的总空间是202. 02 iim。因为Icm2的板面积可提供大约IOiiF的足够电容，所以，选择A为1cm2，选择Weap (板的宽52)为0.8cm(参见定义中的效应传感器几何形状)，这导致所述板的总长为I. 25cm或12500 ym。Lrap(板的长53)选择为625 u m,以交叉指型模式布置20个匝或电极对。因此，所述传感器的总内体积是8000 Um(D) X 725 um(H) X4040. 4 Um(L)
如图1、1A、2和2A所指出的，所述电化学电池的“测量技术”是基于可变电容器单元的传感原理，在所述电容器单元中所述电极/溶液界面模型110的电介质(L)是可变的。在该模型中，在抗VEGF适体11上成股的VEGF蛋白I在电极和溶液之间引入另外的绝缘层14，导致所述界面模型的电容性组分的可测量变化。基于电荷的电容测量(CBCM)技术，可以测量所述电极-溶液界面阻抗的电容性组分的该变化。该CBCM技术的测量原理是以合适频率充电和放电所述VEGF电化学电池，从半周期平均电流测量其等效电容，记录在方程2中。
权利要求
1.一种用于检测靶分子存在情况的适体-探针传感器阵列，所述传感器阵列包含 适体，所述适体被配置为与指示蛋白结合以及改变所述指示蛋白的属性； 探针，所述探针被配置为与靶分子结合，其中所述适体和所述探针以这样的方式组合，该方式即当所述探针结合于所述靶分子时，所述适体和所述指示蛋白之间的结合模式变化。
2.权利要求I所述的传感器阵列，还包含底物；由所述底物携带的多个密封的微机械电容器，连接于所述电容器的包括所述探针和所述适体的识别基团，所述识别基团接受所述靶；用于检测所述多个电容器中的每一个的检测器；以及被配置以计算指示所述靶的结果的处理器。
3.权利要求2所述的传感器阵列，其中所述电容器中的至少某一个具有多个区域，所述多个区域中的每一个均有至少一个识别基团连接于所述区域。
4.权利要求2所述的传感器阵列，其中所述识别基团对VEGF靶有响应。
5.权利要求3所述的传感器阵列，其中所述多个区域中的某一个包括一个适体-探针复合体，其具有可吸引所述靶的电化学亲和性。
6.权利要求2所述的传感器阵列，其中所述多个电容器中的某一个包含可结合于多种靶分析物的识别基团；并且具有所述指示器的所述传感器向所述微处理器报告变化。
7.权利要求I所述的传感器阵列，还包含连续的第一SiO2、-硅烷化层、诸如琥珀酸酐的连接体层、发挥固定化剂功能的Macugen适体层，覆盖所述多个电容器中某一个的至少一部分。
8.权利要求I所述的传感器阵列，另外包含对所述多个检测器有响应的分析电路。
9.一种系统，包含 传感器，所述传感器包括底物、由所述底物携带的电容器阵列、连接于所述底物的识别基团和用于检测所述靶的检测器，所述识别基团可接受靶；以及 用于送递待分析体液至所述传感器的送递系统。
10.权利要求9所述的系统，其中所述送递系统包括输入口、连接于所述输入口的容器和连接于所述容器的输出口，所述底物的至少一部分暴露于所述容器中的流体中。
11.权利要求10所述的系统，其中所述送递系统包括一个或多个壁，其中所述送递系统的壁具有适合的大小，以使所述体液可以无限制循环流过所述传感器单元。
12.权利要求11所述的系统，其中所述送递系统的壁的大小定义为充满电的电容器值的函数，所述电容器值使得可以靶结合所述传感器阵列的最大功能化表面面积，而不降低所述体液流通过所述传感器单元壁的循环流速。
13.—种方法,包括 将传感器暴露于包含靶物质的流体，所述传感器包含被配置为吸引所述靶物质的电容器阵列和连接于所述电容器的识别基团，所述识别基团可接受所述靶物质；并且 分析所述识别基团以确定所述靶物质是否存在于所述流体中。
14.权利要求13所述的方法，其中所述分析包括通过与所述传感器阵列接触的电子工具直接致动。
15.权利要求13所述的方法，其中所述分析包括确定所述生物传感器的电容值变化、阻抗变化和随时间变化率中的一个或多个。
16.权利要求13所述的方法，还包括调整所述电容器上的电容电荷，使得所述靶物质或者被所述传感器吸引或者不被吸引。
17.一种用于检测生物分子存在情况的系统，所述系统包含 被配置成允许包含生物分子的至少一种流体流过的流体流槽； 所述流体流槽中的至少一个电容元件包括至少一个这样的结构，所述结构被配置成当所述电容元件充电时吸引所述生物分子，当所述电容元件未充电时不吸引所述生物分子；以及 被配置以指示所述生物分子吸引情况的传感器。
18.权利要求17所述的系统，其中所述至少一个结构被配置成当所述电容元件充电时结合于所述生物分子，当所述电容元件未充电时释放所述生物分子。
19.权利要求17所述的系统，其中调整所述电容器的充电和放电，使得可短暂地吸引所述生物分子，而不导致所述生物分子聚集到足以阻碍流体流动。
20.权利要求17所述的系统，其中调整所述电容器的充电和放电，使得可短暂地吸引所述生物分子，而不导致所述生物分子聚集到足以妨碍准确测量所述生物分子。
全文摘要
本发明提供了一种新型体系结构的固态生物传感器，用于血管内皮生长因子(VEGF)杂交的无标记物的检测。所述新装置是通过形成并联电容器的矩阵阵列实现，使得可获得低成本、便携、完全集成的装置。检测机制是基于循环系统VEGF与固定的VEGF适体的电化学结合；籍此这两种化合物的结合可调整新型电路的阈电压，改变所述电路的阻抗(电容)。该新型电路的特征还在于以p-Si底物编码的电极，增强VEGF分子和适体之间的亲和性。配置形成流体电池的装置，使得所述流可以送递VEGF样品至芯片的活性表面上。所述装置可以具有并联电容器阵列，所述阵列作为集成的个体反电极发挥作用；具有计算装置，所述计算装置利用时域上的传感输出，目的是使得可检测、报告并形成用于VEGF测量的稳态环。而且，该检测器能够提供经准确测量的VEGF分子的体内定量变化率，提供该重要生物标记物的实时反馈，所述生物标记物可用于测量肿瘤对所送递的化学治疗剂和生物反应调节剂(BRM)的反应，以用于确定肿瘤负荷。
文档编号G01N33/53GK102803944SQ201080026050
公开日2012年11月28日 申请日期2010年4月9日 优先权日2009年4月10日
发明者叶赫沙·沙查尔, 温斯顿·吴, 莱斯利·法卡斯, 托马斯·陈 申请人:药物代谢动力公司, 叶赫沙.沙查尔, 温斯顿.吴, 莱斯利.法卡斯, 托马斯.陈