专利名称：非分离式测定方法
技术领域：
本发明涉及新颖的与特异性结合反应有关的测定方法，其与已知方法相比更简单化。该测定方法被称为非分离式测定法，因为在检测步骤之前，它们不需要除去或者分离过量的检测标签。该方法适用于多种类型的测定，包括免疫测定、受体_配体测定和核酸杂交测定。
背景技术：
人们在测定方法开发、尤其是免疫测定开发的领域已经付出了巨大的努力，以简化测定设计方案，同时保留它们在灵敏度、动态范围、耐用性、较宽的应用性和自动化适用性方面的主要优点。已经有一种方法用于设计所谓的同质测定形式，无需对添加的可检测地标记的特异性结合伴侣进行分离。该类型的方法依赖于设计出检测原则，即结合反应的结果或是开启、或是关闭。相反，异质测定形式依靠结合物的物理分离，并且在定量之前不含可检测地标记的特异性结合伴侣。在同质酶免疫测定领域，已经公开了许多美国专利。许多专利开发了抗体-抗原结合反应来激活或抑制标记酶美国专利Nos. 3，817，837 ；3, 852, 157 ；3, 875, 011 ； 3，966，556 ；3，905，871 ；4，065，354 ；4，043，872 ；4，040，907 ；4，039，385 ；4，046，636 ； 4，067，774 ；4, 191，613 ；以及4，171，244,4, 785，080。其他的同质免疫测定涉及多种通过抗体或者其他的荧光猝灭剂的猝灭荧光方法美国专利Nos. 3，998，943 ；3, 996，345 ； 4，174, 384 ；4, 161,515 ；4，208，479和4，160,016。在归为免疫测定类型的领域还有其他的美国专利，包括美国专利Nos. 3，935，074 ；4, 130,462 ；以及4，193,983。美国专利 No. 4，160，645公开了一种使用电子传递催化剂作为标签的测定方法。该催化剂(标签)通过粘结至抗体而失活。Campbell 等(Biochem. J. ,216,185-194(1983))公开了一种检测方法，其以竞争性测定形式采用在偶联于抗原(Ag-L)的化学发光供体与荧光受体偶联于抗体(Ab-F)之间的能量传递。复合抗原最终发射荧光剂的波长，同时游离抗原发射化学发光标签的特征波长。接着，测量两种波长的光强度，并且将两种信号的比率与样品中分析物的含量相联系。已知还有多种其他的同质免疫测定法=Rubenstein等，美国专利 No. 3，817，837 (同质酶免疫测定)；Ullman，美国专利No. 3，996，345 (荧光猝灭同质免疫测定)；Maggio，美国专利No. 4，233，402 (酶通道同质酶免疫测定)；以及Boguslaski等，加拿大专利1，082，577 (半抗原-辅助因子同质酶免疫测定)。
Ullman的美国专利6，406，913公开的测定方法包括在一定条件下处理一种疑似含有分析物的介质，使得该分析物可以引起光敏剂和化学发光的化合物获得接近的近似性。该光敏剂产生单线态氧，当其处于接近的近似性时，其通过溶液扩散并且激活化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光量与介质中的分析物含量有关。 在一个实施方式中，至少一种光敏剂和化学发光化合物与悬浮的颗粒有关，并且与特异结合性配对成员相结合。McCapra的美国专利5，516，636公开的测定方法包括特异性结合测定，其利用敏化剂作为标签。当通过辐射、电子传递、电解、电致发光或者能量传递而被激化时，该敏化剂达到激发态，其(a)刚一与分子氧相互作用就产生单线态氧，或者(b)刚一与无色染料相互作用就被氧还原，产生过氧化氢。两种与激发的敏化剂，连同外加的其他试剂一起，进行相互作用中的任何一种，可以产生可检测信号。尽管人们在设计同质的、或者非分离式的测定形式方面作了相当大的努力，但这些测定法仍然未受到广泛的商业应用。异质测定法预料作为更简单的测定法而被开发并大量生产，虽然操作上更复杂。特别地，在高容量的临床免疫诊断的领域和较小的临床核酸诊断领域，异质测定形式占统治地位。在该应用领域内，测试形式将有利于方案可以简单化、 复杂度可以降低、并且兼容性可以提高、同时可以通过除去多余步骤而自动化的领域。
发明内容
在一个方面，本发明提供新颖的与特异性结合反应有关的测定方法，尤其是免疫测定，其与已知方法相比更简单化。通过在检测步骤之前省去分离和洗涤步骤而使测定方法简单化，并且因此被认为是非分离式测定法。该方法的特征在于，使用被固定的化学发光化合物和结合(conjugated)于特异性结合伴侣的活化剂化合物，用于诱导化学发光反应。 分析物介导的共定位的化学发光标签化合物和活化剂结合物引起随后的化学发光反应仅在被结合的分析物分子的位点处发生。未结合的过量活化剂结合物的存在不参与或者不妨碍化学发光反应。其结果是，发射的化学发光强度与分析物的数量成正比。
图1是根据本发明使用标记的捕获抗体进行免疫测定的检测步骤的示意图。图2是根据本发明使用标记的封闭性蛋白质和未标记的捕获抗体进行的另一种免疫测定法的检测步骤的示意图。图3是根据本发明使用标记的固体表面和未标记的捕获抗体进行的另一种免疫测定法的检测步骤的示意图。图4是一图表，显示了在使用固定在微孔板的孔中的标记的捕获抗体和过量的用于检测的抗IgG-HRP结合物的非分离式免疫测定法中的IgG抗原检测。图5是一图表，显示了在使用标记的封闭性蛋白质和固定在微孔板的孔中的未标记的捕获抗体以及过量的用于检测的抗IgG-HRP结合物的非分离式免疫测定法中的IgG抗原检测。图6是根据本发明使用标记的捕获核酸进行的核酸杂交测定法的检测步骤的示意图。
图7是根据本发明使用标记的固相、被固定的捕获抗体和标记的分析物类似物进行的竞争性免疫测定的检测步骤示意图。
具体实施例方式烷基一含有1-20个碳的支链、直链或者环烃基团，其可以用1个以上除H之外的低级烷基取代基取代，在此使用的低级烷基指的是那些含有直至8个碳的烷基。分析物一测定中在待检测样品中的物质。一种以上具有对分析物的特异性结合亲合力的物质将被用于检测分析物。该分析物可以是蛋白质、抗体、或半抗原，与该半抗原结合的抗体可以被制备。该分析物可以是核酸，该核酸可以被互补的核酸结合。该分析物可以是任何其他的形成特异性结合配对中的成员的物质。芳烷基一用芳基取代的烷基。芳基一含有芳香环的基团，该基团含有1至5个碳环的芳香环，其可以用1个以上除H之外的取代基取代。生物材料一包括全血、防止凝血的、血浆、血清、组织、细胞、细胞内容物、以及病
ο化学发光化合物一经过导致其被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物的反应的化合物。该激发态可以是单线激态或三重激态。该激发态可以刚一衰减成基态就直接发光，或者可以将激发能传递至发射能受体，借此返回到基态。在该过程中，能量受体被跃迁至激发态并发光。样品一含有或者疑似含有核酸的液体。可以在本发明方法中使用的典型的样品包括身体的液体，比如血液，其可以是当收集血液标本时通常发现的抗凝血的血液、血浆、 血清、尿液、精液、唾液、细胞培养物、组织提取液等等。其他类型的样品包括溶剂、海水、工业用水样品、食用样品和环境样品比如土壤或水、植物材料、真核生物、细菌、质粒和病毒、 真菌、以及源于原核生物的细胞。固相材料一具有测定成分被固定在其上的表面的材料。原料可以为如下形式颗粒、微粒、纳米颗粒、纤维、珠子、膜片、滤纸及其他支持物比如试管和微孔板。特异性结合配对、特异性结合伴侣一一种分子，其包括对另一种物质具有特异性结合亲合力的生物分子，所述另一种物质包括DNA、RNA、低聚核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。特异性结合伴侣可以结合于活化剂或化学发光化合物的一种以上分子。取代一是指基团上至少一个被非氢基团置换。应该注意，关于取代基团，本文中指的是可以存在多个置换位点，除非另有明确说明。本发明涉及用于利用特异性结合配对反应来检测物质的快速而简单的测定方法。 该方法需要使用被固定的化学发光化合物、用于诱导化学发光反应的结合于特异性结合伴侣的活化剂化合物、以及引发剂溶液。该方法涉及一种以上用于检测分析物的特异性结合配对反应。标记的特异性结合伴侣结合于分析物的结果是，使活化剂成为近似于被固定的化学发光化合物，以使得其可以有效激活刚一添加引发剂溶液就产生化学发光的反应。将被活化剂标记的特异性结合伴侣以过量于结合所有的分析物所需要的量，提供至系统。在添加引发剂溶液和检测之前，不用除去过量的未结合的活化剂结合物，因为其不能参与反应。本发明的方法因此不同于常规试验方法，不需要除去存在的大大过量于与分析物特异性联接的量的未结合的活化剂结合物。可以将含有分析物、活化剂结合物、和引发剂溶液的样品依序添加至试验容器，无需洗涤或者分离、以及发光读取。另一方面，在导入引发剂溶液之前，可以将样品和活化剂结合物预混合并添加至试验容器，所述试验容器含有用于俘获分析物的特异性结合伴侣并含有被固定的化学发光标签。不需要洗涤或分离过量的未结合的活化剂结合物。另一个与本技术领域已知的常规化学发光测定法差别化的关键点在于该事实参与光产生的化学发光化合物和活化剂(例如过氧化物酶)都不能自由地扩散进入溶液。两者都受空间制约。部分由于该结果，信号产生趋于短暂。使用化学发光底物和酶标记的结合物的常规测定法要提供大大过量于标签酶的量的底物。通常，底物/酶的摩尔比率可以超过十的九次幂、即，过量十亿倍。据认为有必要供应这样极大过量的化学发光化合物，以便确保充分的底物供应，用于连续的酶法转化， 并且该过程确保在测定中足够的检测灵敏度。申请人发现，有可能设计出高灵敏度的测定方法，其将该比率减小了几个数量级。就这点来说，这些方法基本上不同于已知的方法。省去如上所述和如下所述示例性测定法显示的洗涤和分离步骤，从而提供了使测定方案设计简单化的机会。操作步骤数量的减少可以降低测定时间、由不完全的洗涤带来的内测定变化性、以及成本。同时，增强了实施自动化和小型化测定的能力，并具有自动化和小型化伴随的所有固有优点。根据本发明的方法进行的测定包含四个步骤。在第一步，将固相提供于试验设备中，用于特异性捕获所研究的分析物。该固相上设有被固定的用于待检测的分析物的特异性结合伴侣。该固相上进一步设有固定于其上的化学发光标签化合物。可以以如下详述的许多不同方式提供化学发光标签。在各个变体中，化学发光标签都不可逆以使其固定不动的方式附着于物质或材料上。在第二步，将含有分析物的样品和活化剂结合物导入具有固相被固定的用于分析物的特异性结合伴侣的试验设备，并且允许形成特异性结合复合物。 样品和活化剂结合物可以被分别地依序或同时添加，或者可以被预混合并作为组合添加。 在此刻可以插入允许结合反应发生的任选滞后时间。在第三步，添加引发剂溶液以产生化学发光，用于检测分析物。最后，检测化学发光。优选测量峰值光强度水平或总的累积光强度。该光量可以通过绘制校准曲线根据通常已知的方法而与分析物含量有关。当在添加引发剂溶液后紧跟着发生光发射时，优选用如下任何一种机械方式定时测量的开始通过合适的注射器的添加，或者通过已处于检测器作用下的试验设备进行添加。测定形式和固体支持物在本发明的方法中，将化学发光标签化合物固定至测试体系的成分。这可以以数种方式中的任一方式完成。在一个实施方式中，化学发光标签共价联接至被固定的用于分析物的特异性结合伴侣。一个实施例是一种固定在微孔板的孔上的捕获抗体。特异性结合伴侣的固定可以通过共价连接或者通过吸附工艺进行。在这种图1中描绘的方式中，借助于以“夹心”形式结合分析物的两种特异性结合伴侣，化学发光标签变得与活化剂有关。在图2中描绘的另一个实施方式中，化学发光标签被共价连接于以任意方式固定在固体支持物上的辅助物质。辅助物质的固定可以通过共价连接或者通过吸附工艺进行。因此该标签被近乎均勻地分配在固体支持物表面的周围。提供一种方法用于将分析物吸引至表面，例如通过没有标记的用于分析物的特异性结合伴侣来进行。借助于可使活化剂接近附着于辅助物质的化学发光标签的特异性结合反应，该化学发光标签变得与活化剂有关，从而该辅助物质被动地被涂布到支持物表面上。在另一个实施方式中，化学发光标签被共价连接至固体支持物的表面。如图3所示，标签因此被近乎均勻地分配在固体支持物表面的周围。 提供一种方法用于将分析物吸引至表面，例如通过没有标记的用于分析物的特异性结合伴侣来进行。借助于可使活化剂接近直接附着于支持物表面的化学发光标签的特异性结合反应，该化学发光标签变得与活化剂有关。然后，无需洗涤或分离，添加引发剂溶液并且测量化学发光。另一个实施方式包括一种变化，其中，使用分析物的类似物，包括活化剂_分析物结合物。该分析物类似物和分析物将竞争性地与用于分析物的特异性结合伴侣结合。显而易见，在这类测定方法中，在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈负相关性(图 7)。除通过用于结合抗原或其他蛋白质或其他抗体的抗体经由免疫测定法进行化学发光标签的附着之外，本发明的方法可以使用化学发光标记的核酸，用于通过互补核酸的结合来检测核酸。在这点上，该使用就核酸的大小而言没有特别限定，仅有的标准是，互补伴侣有足够的长度以允许稳定的杂交。在此使用的核酸包括基因长度的核酸、核酸的较短碎片、多聚核苷酸和低聚核苷酸，其中任何一种可以是单链的或者是双链的。在本发明的使用核酸作为特异性结合伴侣的实施方式中，核酸被共价附接或者物理地固定在固体支持物的表面上，以捕获分析物核酸。可以将化学发光标签附接于俘获核酸，大略如图6所示，或者可以按如上所述将标签与固相直接地相联接。该俘获核酸将具有与分析物核酸的序列区域完全的或者基本上完全的序列互补性。当基本上互补时，俘获核酸可能具有不与分析物互补的末端突出部分、末端环状部分或内部环状部分，只要其不会妨碍或者抑制与分析物的杂交。反向位置也可以出现在其中突出或环位于分析物核酸内部的位置。俘获核酸、分析物核酸、以及活化剂和第三核酸的结合物允许杂交。该第三核酸与分析物核酸的序列区域基本上互补，所述序列区域不同于与俘获核酸互补的区域。俘获核酸和活化剂结合物核酸与分析物的杂交可以依序或者是同时地连续进行。该工艺过程的结果是，借助于可使活化剂接近直接附着于支持物表面的化学发光标签的特异性杂交反应，该化学发光标签变得与活化剂有关。按如上所述提供引发剂溶液并且检测化学发光。另一个实施方式包括一种变化，其中，使用分析物与活化剂的结合物。该分析物核酸_活化剂结合物和分析物核酸将竞争性地与用于分析物的特异性结合伴侣核酸结合。显而易见，在这类测定方法中，在样品中的分析物含量和化学发光强度之间将呈负相关性。除基于抗体和基于核酸的体系之外，其他特异性结合配对，如通常为本领域的普通技术人员所熟知的结合测定法，可以用作根据本发明的试验方法的基础。该例子有荧光素/抗荧光素配对、地高辛配基/抗地高辛配基配对、以及硝基苯基/抗硝基苯基配对。作为另一个例子，可以使用众所周知的(链霉)抗生物素蛋白/生物素结合配对。为显示其中可以使用该结合配对的一种方式，可以将链霉抗生物素蛋白-化学发光标签结合物共价连接或者吸附到固体支持物上。然后添加用生物素标记的分析物和活化剂结合物，其中结合物被附接于抗生物素抗体或者抗分析物抗体。在使复合物被形成后，添加引发剂溶液并且按上述方法进行检测。对于本领域的技术人员而言，这些例子及其他例子皆被认为在本发明方法的范围之内。在本发明的实施方式中有用的固体支持物可以是各种材料、各种形状、和各种尺寸。已经在结合测定法中使用的材料皆可提供对于化学发光标签附着和固定特异性结合伴侣有用的固体支持物，包括96孔、384孔以上的多种微孔板，试管，样品杯，塑料微球，纤维素，纸质或塑料试验条，胶乳粒子，聚合物颗粒，二氧化硅粒子，磁性粒子，尤其是那些平均直径为0. 1-10 μ m以及纳米颗粒的各种材料。本发明的公开教导了对用于本发明测定方法的这些材料功能化的方法，。具体说，公开了一些方法，用于将化学发光标签化合物和特异性结合伴侣例如抗体这两者都附接至相同的表面、尤其是微粒。化学发光标签化合物在本发明的实施方式中用作化学发光标签的化合物具有通式CL-L_RG，其中，CL 表示化学发光的部分，L表示连接化学发光部分和活性基团的连接部分，并且RG表示用于偶联于另一种材料的活性基团部分。化学发光部分CL被包括其内。优选，但并非必需，CL 基团、活化剂和引发剂溶液的化学发光反应快速发生在非常短暂的时间间隔的整个期间。优选的化学发光化合物是能够被氧化从而当存在活化剂和引发剂溶液时产生化学发光。通过连接物和活性基团的结合可以作化学发光标签的示例性化合物种类包括氨基苯二酰一胼(鲁米诺)，以及在结构上相关的环状酰胼，包括异氨基苯二酰一胼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一胼(ABEI)、氨基己基乙基异氨基苯二酰一胼(AHEI)、7_ 二甲基氨基萘-1，2- 二羧酸酰胼、环取代的氨基邻苯二甲酰胼、蒽_2，3- 二羧酸酰胼、菲-1，2- 二羧酸酰胼、芘二羧酸酰胼、5-羟基_邻苯二甲酰胼、6-羟基邻苯二甲酰胼，以及在Masuya等的美国专禾Ij No. 5，420，275和Yamaguchi的美国专利No. 5，324，835中公开的其他2,3- 二氮杂萘二酮类似物。另一类化学发光部分包括在美国专利No. 5，491，072,5, 523，212,5, 593,845和 6. 030,803中公开的9，10- 二氢化吖啶酯、硫酯和氨磺酰。另一类化学发光部分包括在美国专利No. 5，922，558 ；6, 696，569和6，891，057中公开的杂环化合物。这些化合物优选包括优选包含氮、氧或者含硫的五元环或六元环或多元环基团的杂环，该杂环键合环外的双键，该杂环的末端碳原子可用选自氧和硫原子的两种原子取代。据认为，任何已知可以在过氧化氢和过氧化物酶的作用下产生化学发光的化合物将具有本发明中使用的化学发光标签化合物的化学发光部分的功能。本技术领域已知有许多各种结构分类的这样的化合物在这些条件下可以产生化学发光，这样的化合物包括占辛染料、芳香胺和杂环胺。在本发明的方法中有用的化学发光标签化合物的优选基团包括具有式I的9， 10-二氢化吖啶类化合物
权利要求
1. 一种试剂盒，其包括a)固体支持物，其上固定有下述物质(1)可作为过氧化物酶作用底物的化学发光化合物，其包含选自下组的化学发光部分 9，10- 二氢化吖啶酯、9，10- 二氢化吖啶硫酯、9，10- 二氢化吖啶磺酰胺、9，10- 二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物、下述化学式所示的9，10- 二氢化吖啶类化合物
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物还包含连接部分， 所述连接部分具有1-20个原子的亚烃基链，其末端为-CH2-、-0-、-S-、-NH-、-NR-、-Si0-、_ C ( = 0) -、-0C ( = 0) -、_C ( = 0) 0-、-SC ( = 0) -、-C ( = 0) S-,-NRC ( = 0)-、或-C ( = 0) NR-基团，其中，R是C1-8烷基；或者所述连接部分具有3-30个原子的聚(亚烃基-氧基)链，其末端为-CH2-、-0-、-S-、-NH-, -NR-, -SiO-, -C ( = 0) -、-OC ( = 0) -、-C ( = 0) 0_、-SC (= 0) _、-C ( = 0) S-、-NRC ( = 0)-、或-C ( = 0) NR-基团，其中，R是C^8烷基，其中，所述连接部分将所述化学发光化合物连接至所述固体支持物。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物被共价连接于所述固体支持物。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物被共价连接于被固定化在固体支持物上的辅助物质。
5.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，还包括引发剂溶液，所述引发剂溶液是包含过氧化物和选自下组的过氧化物酶增强子的水溶液苯酚化合物、芳香胺、芳基硼酸化合物、芳基硼酸酯化合物、芳基硼酸酸酐化合物、下述化学式之一所示的化合物
6.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述固体支持物选自微孔板、试管、样品杯、塑料微球、纤维素试验条、纸测试条、塑料试验条、胶乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子、金属胶体以及磁性粒子。
7.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，用于分析物的所述被固定化的第一特异性结合配对体选自于抗体、结合性蛋白以及核酸。
8.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述第二特异性结合配对体选自于分析物类似物、抗体、结合性蛋白以及核酸。
9.如权利要求5-8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引发剂溶液包含pH为 5 10. 5之间的缓冲水溶液，并进一步包含一种以上洗涤剂或聚合物表面活性剂。
10.如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物是下述化学式所示的9，10- 二氢化吖啶二硫缩烯酮化合物
全文摘要
公开了与特异性结合反应有关的测定方法，其与已知方法相比更简单化。能够产生化学发光的化合物被固定在固体支持物上，作为用于捕获样品中分析物的特异性结合配对成员。可以激活所述化学发光化合物并且被结合于特异结合性配对成员的活化剂化合物被过量地与样品一起添加至所述固体支持物。在活化剂结合物已经特异性地结合的位点，引发剂溶液的添加引起化学发光反应。该测定方法被称为非分离式测定法，因为在检测步骤之前，不需要除去或者分离过量的检测标签(活化剂结合物)。该方法适用于多种类型的测定，包括免疫测定、受体-配体测定和核酸杂交测定。
文档编号G01N33/543GK102175851SQ201010616899
公开日2011年9月7日 申请日期2007年5月7日 优先权日2006年5月9日
发明者H·阿哈万-塔夫狄 申请人:贝克曼考尔特公司