专利名称：返魂草浸膏的质量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种中药质量检测方法，具体涉及返魂草浸膏HPLC指纹图谱的构建方法，以及返魂草浸膏的质量检测方法。
背景技术：
中药材返魂草主产于我国长白山，大小兴安岭等地。返魂草以地上全草入药，具有清热解毒、散血、消肿、下气通经。用于瘀血胀痛、跌打损伤的功效。同时还具有抑菌作用，临床用治疗肺源性心脏病、慢性支气管炎、急性肺感染，有显著疗效。另具有防治流感、润肺、 提高人体免疫力等功效。由于以返魂草为原料研制的新药疗效显著，近几年众多制药企业开始用其开发生产治疗肺病新药。目前，返魂草还没有作为法定药材被国家药品标准收录，其质量指标也没有法定标准。目前市售的产品肺宁颗粒、肺宁胶囊、肺宁片都是以返魂草为原料的治疗呼吸道感染的纯中药制剂。通过检测分析，本发明人发现，由于产地不同，或采摘季节不同，返魂草药材内在质量存在很大的差异，仅以其中指标成分绿原酸的检测结果为例，含量上的差异可达到十几倍。绿原酸是返魂草药材中一个重要的有效成分，而含量相差悬殊，会导致制剂的内在质量失去可控性，其临床疗效更是无法保证。这样，势必导致产品内在质量难以保证，无法达到临床效果。中药材质量的不可控性，是制约我国传统中药走向世界的一个难以解决的瓶颈问题。当前世界很多国家和地区都很重视中药的指纹图谱的研究工作，我国台湾省已经对所有中成药都实行指纹图谱控制。国际上出现的标准植物药制剂的概念，就是对制剂中的主要特性施行控制，制定标准的指纹图谱，使植物药由原料到成品都有稳定的标准，使质量更有保证。美国FDA对中国中药市场的准入，一再的强调质量标准的提高，FDA要求中国的原料、半成品、制剂都要有相应的指纹图谱。我们以返魂草浸膏为基础，研究建立药材提取物的指纹图谱，正是顺应了现代中药发展潮流，力争在未来的植物药市场上保待一席之地。到目前为止，在中药生产和流通中，还没有一种质量控制手段能够全面地、综合地反映出中药产品的质量变异，可以有效地进行全过程的质量控制。通过对返魂草药材浸膏的系统研究，证明采用高效液相色谱方法用指纹图谱作为指控标准是可行的。从药材的来源、生产、加工、贮存、中间品、成品、流通样品等各个角度和方面，进行中药样品的理化分析，通过相似性和相关性对比，发现质量变异和缺陷，从而全面、特异地把握住以返魂草浸膏为主药的系列产品例如肺宁系列产品的质量命脉。
发明内容
本发明的目的之一是提供返魂草浸膏HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤(1)对照品溶液的制备精密称取绿原酸、咖啡酸对照品，分别加入甲醇制成每 Iml含12-16 μ g的溶液，避光保存；
(2)供试品溶液的制备取返魂草，加9-11倍量煎煮2-3次，每次1-池，合并煎液， 滤过，滤液浓缩成浸膏、干燥；取所得浸膏0. 4-0. 6g，置于50ml容量瓶中，加甲醇35_45ml， 超声处理30-60分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得，避光保存；(3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0. 4% 磷酸溶液为7-9 91-93的混合溶液；紫外检测波长为327nm;流速为l.Oml/min;(4)测定精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ 1，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到返魂草浸膏指纹图谱。优选地，步骤(1)所述对照品的浓度为每Iml甲醇含15μ g对照品。优选地，步骤⑵所述供试品溶液的制备步骤如下取返魂草，加水10倍量煎煮3 次，第1次煎煮池，第2、3次每次煎煮lh，合并煎液，滤过，滤液浓缩成浸膏、干燥；取所得浸膏0. 5g，置于50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超声处理45分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得。优选地，步骤(3)所述流动相为乙腈-0. 4%磷酸溶液为8 92的混合溶液。本发明的另一个目的是提供返魂草浸膏的HPLC标准指纹图谱的构建方法，按照前述方法构建12批返魂草浸膏HPLC指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件生成由6个共有峰构成的返魂草浸膏HPLC标准指纹图谱，共有峰中第5号峰为绿原酸峰，第6号峰为咖啡酸峰。在标准指纹图谱中，以绿原酸峰为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间应在第一规定值的士5%之内，所述第一规定值分别为0. 12-峰1、 0. 16-峰2,0. 24-峰3,0. 49-峰4,1. OO-峰SU. 27-峰6 ；所述共有峰的峰面积应在第二峰面积的规定值士20%之内，采用面积归一化法计算，第二规定值分别为9.91% -峰1、 3. 32% -峰 2、3· 27% -峰 3、18. 99% -峰 4、36. 28% -峰 S、28. 21% -峰 6。本发明的另一个目的是提供返魂草浸膏的质量检测方法，该方法包括如下步骤(1)对照品溶液的制备精密称取绿原酸、咖啡酸对照品，分别加入甲醇制成每 Iml含12-16 μ g的溶液，避光保存；(2)供试品溶液的制备取返魂草，加水9-11倍量煎煮2-3次，每次l_2h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成浸膏、干燥；取所得浸膏0. 4-0. 6g，置于50ml容量瓶中，加甲醇 35-45ml，超声处理30-60分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得，避光保存；(3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0. 4% 磷酸溶液为7-9 91-93的混合溶液；紫外检测波长为327nm;流速为l.Oml/min;(4)测定精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ 1，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到返魂草浸膏指纹图谱；(5)取12批返魂草浸膏，按上述同法操作，构建12批返魂草浸膏HPLC指纹图谱， 采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件生成由6个共有峰构成的返魂草浸膏HPLC标准指纹图谱，共有峰中第5号峰为绿原酸峰，第6号峰为咖啡酸峰；在标准指纹图谱中，以绿原酸峰为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的士5%之内，所述第一规定值为0. 12-峰1、0. 16-峰 2,0. 24-峰3、0. 49-峰4、1. OO-峰S、1. 27-峰6 ；所述共有峰的峰面积在第二规定值±20%之内，采用面积归一化法计算，第二规定值分别为9. 91% -峰1、3. 32% -峰2、3. 27% -峰 3、18. 99% -峰 4、36. 28% -峰 S、28. 21% -峰 6 ；(6)取返魂草浸膏样品，按上述同法操作，得到返魂草浸膏样品指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对返魂草浸膏的标准指纹图谱和样品指纹图谱进行分析，相似度大于0. 95为合格产品。优选地，步骤(1)所述对照品的浓度为每Iml甲醇含15 μ g对照品。优选地，步骤( 所述供试品溶液的制备步骤如下取返魂草，加水10倍量煎煮3 次，第1次煎煮池，第2、3次每次煎煮lh，合并煎液，滤过，滤液浓缩成浸膏、干燥；取所得浸膏0. 5g，置于50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超声处理45分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得。优选地，步骤( 所述流动相为乙腈-0. 4%磷酸溶液为8 92的混合溶液。在一个优选的实施方案中，返魂草HPLC标准指纹图谱中各共有峰的保留时间和峰面积如表1所示表1返魂草HPLC标准指纹图谱中共有峰的保留时间和峰面积
权利要求
1.返魂草浸膏HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤(1)对照品溶液的制备精密称取绿原酸、咖啡酸对照品，分别加入甲醇制成每Iml含 12-16 μ g的溶液；(2)供试品溶液的制备取返魂草，加水9-11倍量煎煮2-3次，每次1-池，合并煎液，滤过，滤液浓缩成浸膏、干燥；取所得浸膏0. 4-0. 6g，置于50ml容量瓶中，加甲醇35_45ml，超声处理30-60分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得；(3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液为7-9 91-93的混合溶液；紫外检测波长为327nm ；流速为1. Oml/min ；(4)测定精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μ 1，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到返魂草浸膏指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的方法，所述对照品的浓度为每Iml甲醇含15μg对照品。
3.根据权利要求1所述的方法，所述供试品溶液的制备步骤如下取返魂草，加水10 倍量煎煮3次，第1次煎煮池，第2、3次每次煎煮lh，合并煎液，滤过，滤液浓缩成浸膏、干燥；取所得浸膏0. 5g，置于50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超声处理45分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1所述的方法，所述流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液为8 92的混合溶液。
5.返魂草浸膏的HPLC标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，按照权利要求1-4任一项所述的方法构建12批返魂草浸膏HPLC指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件生成由6个共有峰构成的返魂草浸膏HPLC标准指纹图谱，所述共有峰中第5号峰为绿原酸峰，第6号峰为咖啡酸峰。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述标准指纹图谱中，以绿原酸峰为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的士5% 之内，所述第一规定值分别为0. 12-峰1,0. 16-峰2、0. 24-峰3、0. 49-峰4、1. OO-峰S、 1.27-峰6 ；所述共有峰的峰面积在第二规定值士20%之内，采用面积归一化法计算，第二规定值分别为9. 91% -峰 1,3. 32% -峰 2、3· 27% -峰 3、18. 99% -峰 4、36. 28% -峰 S、 28. 21% -峰 6。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述6个共有峰的保留时间分别为 2. 54,3. 19,4. 95,9. 98,20. 51,26. 01，峰面积分别为 152999、59692、72272、322837、495408、 385225。
8.返魂草浸膏的质量检测方法，其特征在于，取返魂草浸膏样品，按权利要求1-4任一项同法操作，得到返魂草浸膏样品指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对所述样品指纹图谱和权利要求5-7任一项所述的返魂草浸膏的标准指纹图谱进行分析， 相似度大于0. 95为合格产品。
全文摘要
本发明涉及返魂草浸膏HPLC指纹图谱的构建方法，该方法包括(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.4％磷酸溶液(7-9∶91-93)的混合溶液；检测波长为327nm；(4)测定得到返魂草浸膏指纹图谱。本发明还涉及返魂草浸膏的质量检测方法及标准指纹图谱。本发明的方法能有效表征返魂草浸膏的质量，有利于监控产品的质量；具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好的特点；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
文档编号G01N30/88GK102539596SQ20101061006
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者丁爱英, 徐有章, 李艳茹 申请人:徐有章