专利名称：载脂蛋白a1作为糖尿病标志物的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种载脂蛋白A KApolipoprotein A I =ApoA I)用作检测糖尿病的蛋白质分子标记物的应用。
背景技术：
糖尿病是一种严重威胁人类健康的疾病，世界发病率高达2 %，在发展中国家糖尿病的发病率和死亡率均呈现快速上升趋势。在我国，随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，糖尿病患病率日渐增高，目前我国糖尿病总人数超过4000万，已经成为糖尿病的重灾区，每年用于糖尿病治疗的医疗支出大为增加，这表明糖尿病已经成为严重危害我国人民生命财产安全的敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，因此加大力度进行我国糖尿病的基础研究具有战略意义。糖尿病患者处于临床糖尿病诊断前期可长达12年，大部分患者是在出现糖尿病急性或慢性并发症后才得到诊断和治疗的，而事实上早期发现、早期确诊和早期治疗才是让他们恢复健康的关键，因而需要寻找到合适的标志物以实现糖尿病的早期发现，从而进一步实现糖尿病的早期确诊和早期治疗；以早期诊断和治疗为目的去研究和寻找能够用作预测和诊断糖尿病的蛋白质分子标记物具有十分重要的意义。因此，本领域非常有必要通过各种途径找到早期诊断糖尿病或预测糖尿病患病风险的标志物，以期为临床诊断提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载脂蛋白A KApolipoprotein A I =ApoA I)用作检测糖尿病的蛋白质分子标记物的应用。在本发明的第一方面，提供一种载脂蛋白Al (ApoA I)或其蛋白片段作为糖尿病标志物的用途。在另一优选例中，所述的脂蛋白Al用作检测糖尿病或预测糖尿病发生的蛋白质分子标记物。在另一优选例中，所述的标志物是体液的标志物。在另一优选例中，所述的体液为血清。在另一优选例中，所述的蛋白片段的氨基酸序列为载脂蛋白Al所特有。在另一优选例中，所述的载脂蛋白Al的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ IDNO 1或其中第2-17位氨基酸所示。在本发明的另一方面，提供一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1或其中第2-17位氨基酸所示。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码所述的多肽。在本发明的另一方面，提供一种载脂蛋白Al或其蛋白片段的用途，用于制备检测糖尿病的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂选自抗体、配体。在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。在本发明的另一方面，提供一种特异性识别载脂蛋白Al或其蛋白片段的试剂的用途，用于制备检测糖尿病或区分糖尿病高危人群的试剂盒。在另一优选例中，所述的特异性识别载脂蛋白Al或其蛋白片段的试剂是抗体。在本发明的另一方面，提供一种特异性识别载脂蛋白Al或其蛋白片段的试剂，所述试剂是多克隆抗体。在本发明的另一方面，提供一种检测糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包含容器，以及置于所述容器中的所述的试剂。在本发明的另一方面，提供一种测试条(如试纸或试纸条)，其包括固相载体，以及附着于所述固相载体上的所述的试剂。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了对载脂蛋白Al (ApoA I)母离子-子离子对(969. 5-804. 4)的质谱多反应监测技术的结果；其中，SN为正常健康对照组；DM为2型糖尿病患者组。纵坐标为轻肽除以重肽的比值，即该段肽EQLGPVTQEFWDNLEK在血中含量比上标准肽的比值。两组做 t-test 检验，ρ 值为 0. 040425，< 0. 05，* 表示 ρ < 0. 05。图2显示了载脂蛋白Al蛋白的含特有肽段EQLGPVTQEFWDNLEK的MS2谱图。图3显示了样品条带切割情况。图 4 显示 7 969. 5-618. 3 (y5) ,969. 5-804. 4 (y6) ,969. 5-951. 5 (y7), 969. 5-1080. 5 (y8)和969. 5-1039. 6 (ylO)共5个母离子-子离子对的RSD分布情况。其中，横坐标表示RSD值，纵坐标表示相对比值。图5为糖尿病血清中的Apo Al的ROC曲线分析图。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究和筛选，最终获得一种对于指示糖尿病的发生或发展有用的标志物。所述的标志物是载脂蛋白Al (ApoA I)或其蛋白片段，其在糖尿病患者体液中的含量显著低于正常人群，因此可用于诊断糖尿病或糖尿病患病风险。载脂蛋白Al脂蛋白是负责运输脂质的一类蛋白复合物，人体中脂蛋白(lipoprotein)由脂质 (lipid)和载脂蛋白(Apolipoprotein)以非共价键相结合，载脂蛋白在肠中合成，并且合成受一系列因子的影响，包括摄入食物的组成，荷尔蒙(如胰岛素，胰高血糖素)，酒精的摄入以及很多药物等。载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要的生理作用作为构成并稳定脂蛋白的结构，是脂蛋白结构的支柱；修饰并影响与脂蛋白代谢有关的酶活性；作为脂蛋白受体的配体；参与脂蛋白与细胞表面脂蛋白受体的结合代谢过程。载脂蛋白种类很多，主要包括六大类，ApoA, ApoB, ApoC, ApoD, ApoE, ΑροΗ，其中ApoA，ApoB, ApoC各自又有几种亚类。
载脂蛋白A I (ApoA I)是ApoA族的一种组分，是HDL中的主要载脂蛋白。其 Genebank 登录号为GI :4557321，NCBI 的登录号为:NP000030，Swissprot 登录号为 P(^647，IPI号为:IPI00021841. 1，目前已知ApoA I在胆固醇代谢，血脂代谢中起着重要作用。有研究发现ApoA I 与磷脂转移蛋白(Phospholipid Transfer Protein, PLTP) 磷脂转移蛋白是人体内负责将脂质从低密度脂蛋白转移到高密度脂蛋白的一个蛋白质， 它与动脉粥样硬化以及冠状动脉疾病的产生有关，10% PLTP的活性丧失就可以明显降低动脉粥样硬化的发生)的结合可以调节后者的活性，并且在高血脂症中，ApoA I的含量与磷脂转移蛋白的活性是呈线性相关的(Ryan JHenderson, Kishor M Wasan and Carlos G Leon, Journal of Lipid Research :47，1315-1321，2006)。此外，ApoA I 可以稳定氧磷酶PON-l(paraoxonase-l)，后者可以阻止过氧化物的产生以及oxLDL的产生，oxLDL在内皮细胞功能障碍、单核细胞趋化、滤泡细胞的形成以及血小板的碎裂即动脉粥样硬化等过程中起作用。ApoA I还可以通过调节胆固醇的逆向转运，在胆固醇的代谢中起着重要作用。另外，HDL中的ApoA I还有抗炎症以及抗氧化的作用(NicolasVUILLEUMIER，Emmanuel CHARBONNEY, Pascale ROUX-LOMBARD, etal. Journal of clinical science :115,25-33, 2008)。然而，目前还没有将ApoA I作为糖尿病的分子标记的有关报道。载脂蛋白Al的蛋白片段基于本发明的新发现，提供了来源于ApoA I的肽段(多肽)，所述的肽段是ApoA I蛋白所特有的，可良好地应用于作为糖尿病的分子标记物。较佳地，所述的肽段具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO :1中第2_17位所示的氨基酸序列。本发明人分析了大量来源于ApoA I的肽段，经鉴定这条肽段强度最好。检测这条肽段的含量就可以直接地反映ApoA I蛋白的含量，方便、快捷且准确性高。编码所述的ApoA I的肽段的多核苷酸也包括在本发明内。由于所述的肽段是ApoA I蛋白所特有的，其对应的多核苷酸序列也是特有的。可通过常规的检测核酸的方法来获知待测样品中所述的多核苷酸的含量。检测多肽或核酸含量的方法是本领域人员所熟知的。例如，检测多肽可借助于质谱分析仪器等，或可通过狗stern Blot或ELISA等方法。检测核酸包括PCR扩增、Northern Blot等方法。载脂蛋白Al或其蛋白片段的用途本发明人将正常健康对照组血清和2型糖尿病患者的血清样品(均从上海市第六人民医院糖尿病研究所取得)分别以乙醇沉淀法分级血清蛋白质-溶液内酶解-一体柱串联质谱分析和样品切胶-串联质谱(LTQ-Orbi)技术对其中的蛋白质进行鉴定并比较了其中蛋白质的表达水平，发现载脂蛋白Al (ApoA I)在糖尿病病人血清中的表达水平低于正常健康对照血清中的表达水平；通过质谱多反应监测技术，进一步证实并发现正常健康对照组与2型糖尿病患者组血清中载脂蛋白Al的表达水平存在差异表达。通过检测正常健康对照以及2型糖尿病病人血清中ApoA I表达量，本发明人发现 ApoA I在正常健康对照以及和2型糖尿病病人血清中存在差异表达，ApoA I在糖尿病病人血清中的表达水平低于正常健康对照血清中的表达水平；通过MS/MS检测、搜库、查找蛋白质、buildsummary分析、MRM检测定量ΑροΑΙ，进一步证实并发现正常健康对照组、2型糖尿病患者组的ApoA I表达水平存在差异表达。因此，本发明提供了一种ApoA I或其蛋白片段作为糖尿病标志物的用途。作为本发明的优选方式，ApoA I作为糖尿病的血清检测标志物。血清检测取材方便、操作简单、便于复查，患者易于接受，评估预后，指导治疗。基于本发明的新发现，可以利用ApoA I蛋白或其蛋白片段(i)进行糖尿病的鉴别诊断、和/或易感性分析；( )评估相关人群的糖尿病治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群糖尿病患病风险，早期监测早期预防。其还可以用于制备特异性识别ApoA I的试剂，从而用于检测ApoA I的存在与否以及存在量，作为糖尿病的判断依据。识别载脂蛋白Al或其蛋白片段的试剂和试剂盒基于本发明的新发现，本发明还提供了特异性识别ApoA I或其蛋白片段的试剂。 任何可识别ApoA I或其蛋白片段的试剂均包含在本发明中，用作检测糖尿病的标志物。所述的特异性识别ApoA I或其蛋白片段的试剂例如是特异性结合ApoA I的抗体或配体。本发明还提供了一种特异性识别ApoA I或其蛋白片段的试剂的用途，用于检测糖尿病或糖尿病高危人群。作为本发明的一种实施方式，所述的试剂是抗ApoA I的抗体；更特别的例如是多克隆抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见 Kohler 等人，Nature 256 ；495，1975 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :511，1976 ； Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :292,1976 ；Hammer ling 等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ,1981)。所述的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本中的ApoA I水平，从而用于诊断糖尿病或判断患病风险(易感性)。利用所述的抗体，可以检测体液中ApoA I的水平，因而可用于检测糖尿病，可用于预测早期糖尿病的发生，或者用于制备检测糖尿病的制剂或试剂盒等，用于制备预测早期糖尿病的发生的制剂或试剂盒等。本发明还提供了用于诊断糖尿病的试剂盒，该试剂盒包括特异性识别ApoA I或其蛋白片段的试剂。所述的试剂例如是单克隆抗体或多克隆抗体。所述的试剂盒中还可含有用于免疫组织化学分析的试剂，所述的试剂例如第二抗体、染色剂、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。更具体地，所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒。 用于检测糖尿病或预测早期糖尿病的发生。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。更具体地，所述的特异性识别ApoA I或其蛋白片段的试剂也可固定于试纸上，制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。本发明的主要优点在于
(1)首次揭示ApoA I或其蛋白片段可以作为诊断糖尿病的标志物。(2)首次制备出了特异性识别ApoA I或其蛋白片段的试剂，所述试剂特异性好， 检测灵敏度高，准确性高，具有良好的临床应用价值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。^MLl、差异表达蛋白质的筛选方法ι-乙醇沉淀法分级-一体柱串联质谱策略本实施例中所有的实验用水均来自Milli-Q(Millipore，Bedford, MA, USA)超纯水装置；dithiothreitol (DTT)、SDS、尿素、3_[ (3-胆酰胺丙基)_ 二乙]_ 丙磺基(CHAPS)、 Tris、碳酸氢铵(NH4HC03)和 iodoacetamide (IAA)从 Bio-Rad 公司(Hercules, CA, USA) 购买；胰蛋白酶(Trypsin)购自 Promega 公司(Madison, WI, USA)；甲酸(formic acid, FA)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)和乙腈(Acetonitrile)购自 Aldrich 公司 (Milwaukee, WI, USA)；磷酸购自上海化学试剂公司。除乙腈为色谱纯外，其余的化学试剂均为分析纯。正常健康对照血清和2型糖尿病患者血清样品由上海交通大学附属上海市第六人民医院糖尿病研究所提供。在50 μ L 血清样品中加入 250 μ L 溶液(IOOmM NaCl, IOmMHEPES, ρΗ 7. 4)，用 0. 22 4!11滤膜在41 IOOOOg的转速下离心去除脂类；取260 μ L除脂后的血清样品加入 182口1^令乙醇溶液，置于41立式摇床上混合111，然后41 16000g离心45min。上清即为高丰度组分，沉淀部分即为低丰度组分。将两个组分均进行低温冻干，然后各加入200 μ L 2D裂解液进行溶解。取高丰度和低丰度组分各100 μ L，加入IyL IM DTT，混勻，37°C放置2. 5h，冷却至室温后，加入5μ L IM ΙΑΑ，室温避光放置40min。经过上述处理的蛋白质完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭。然后将每管溶液用: 的超滤膜，12000g离心超滤， 除去溶液中的盐类和其他小分子化合物，使溶剂置换为IOOmM的碳酸氢铵溶液。完成上述所有操作之后，向两个组分分别加入20 μ g的胰蛋白酶(Trypsin)，37°C水浴酶解Mh，再用Millipore 10K超滤膜超滤，除去酶和未被酶解的蛋白质，收集滤液、冻干，每管用60 μ L 0. 甲酸水溶液复溶，取1/3样品进行质谱分析。一体柱串联质谱(IMDL-MS/MQ包括一个自动进样器、一个高压混合泵和一个用于二维液相色谱分离的Bi-phase整体柱。Bi-phase整体柱分为两段前半段为强阳离子交换柱，后半段为 C 18 反相柱(300 μ m ID ；50mm length, Column Technology Inc，USA)。 高效液相色谱溶液包括A :0. 甲酸；B 0. 甲酸，100%乙腈。酶解后的肽段混合物经自动进样器以无损失的模式进入到一体柱中，肽段混合物先经过一体柱的前半部分(即强阳离子交换柱部分)，大部分肽段被结合在强阳离子交换柱上，未保留部分被冲到后半部分的C18反相柱上，然后用2-40%的B溶液冲洗120min，并进行质谱检测。在自动进样器中，以不同的PH梯度和无损失进样模式把100 μ L ρΗ溶液进样到一体柱里，即把一部分肽段混合物从一体柱的前半部分(强阳离子交换柱部分)洗脱到后半部分(C18反相柱)，2-40% 的B溶液冲洗120min，并进行质谱检测；用不同ρΗ溶液重复上述过程共11次。在整个过程中的质谱条件为质谱扫描条件设定为一个400-2000M/Z的全扫描(full scan)后面进行全扫描中前10个最高峰的MS/MS扫描，其中动态排除(dynamic exclusion)的设定是 重复次数O^peat count)为2，重复容忍时间(r印eat duration)为30s，动态排除时间 (exclusion duration)为 90s。以上述方法制备10例正常健康对照血清和17例2型糖尿病患者血清样品。2型糖尿病病人的临床指标详见表1(性别“1”表示男性；“2”表示女性；以下同)，正常血清的临床指标详见表2。测定的临床指标分别为甘油三酯(TG，mmol/L)，总胆固醇(TC，mmol/ L)，高密度脂蛋白(HDL，mmol/L)，低密度脂蛋白(LDL，mmol/L)，空腹血糖(FPG，mmol/L)，餐后2小时血糖(PG2H, mmol/L)。表1、17例2型糖尿病患者的临床资料
性别年龄FPGPG2HTGTCHDLLDLBMIDMl1699. 7319. 140. 644. 302. 111. 8220. 40DM216777. 502. 345. 931. 363. 5825. 70DM3697. 216. 84. 528. 031. 765. 1524. 77DM41699. 8418. 341. 875. 201. 063. 1123. 05DM516514. 7116. 781. 716. 201. 584. 1228. 20DM61688. 5014. 601. 456. 201. 384. 0322. 50DM71687. 1162. 325. 71. 594. 1425. 1DM81679. 4414. 900. 713. 700. 982. 64NADM91668. 099. 101. 104. 001. 012. 81NADMlO1679. 7017. 801. 543. 721. 242. 5625. 20DMll1679. 591. 694. 131. 342. 7725. 6DM121697. 1015. 300. 853. 911. 362. 8425. 50DMl 31677. 4017. 501. 534. 861. 343. 5525. 70DMl 41667. 9811. 670. 865. 602. 302. 5323. 90
权利要求
1.一种载脂蛋白Al或其蛋白片段作为糖尿病标志物的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白片段的氨基酸序列为载脂蛋白 Al所特有。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的载脂蛋白Al的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO 1或其中第2-17位氨基酸所示。
4.一种分离的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1或其中第2-17位氨基酸所示。
5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求4所述的多肽。
6.一种载脂蛋白Al或其蛋白片段的用途，用于制备检测糖尿病的试剂。
7.一种特异性识别载脂蛋白Al或其蛋白片段的试剂的用途，用于制备检测糖尿病或区分糖尿病高危人群的试剂盒。
8.一种特异性识别载脂蛋白Al或其蛋白片段的试剂，所述试剂是多克隆抗体。
9.一种检测糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包含容器，以及置于所述容器中的权利要求 8所述的试剂。
10.一种测试条，其包括固相载体，以及附着于所述固相载体上的权利要求8所述的试剂。
全文摘要
本发明涉及载脂蛋白A1作为糖尿病标志物的应用。本发明提供了一种对于指示糖尿病的发生或发展有用的标志物——载脂蛋白A1，其在糖尿病患者血清中的含量显著低于正常人群，因此可用于诊断糖尿病或糖尿病患病风险。
文档编号G01N33/577GK102565416SQ201010605388
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者吴家睿, 夏方莹, 曾嵘, 李荣霞, 苏智端, 贾伟平, 陈海冰 申请人:上海交通大学附属第六人民医院, 中国科学院上海生命科学研究院