专利名称：利用基因工程单链抗体检测μ-芋螺毒素的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程单链抗体检测海洋毒素的检测试剂盒，更具体地涉 及了利用基因工程单链抗体检测μ-芋螺毒素(μ-Conotoxin，μ -CTX)的试剂盒，进一 步涉及使用该试剂盒检测μ-CTX的方法。
背景技术：
芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺 (Conus)分泌出来的，用于麻醉猎物的小肽类毒素。μ -CTX与河豚毒素相似，是典型的钠离 子通道抑制剂，中毒者出现肢体麻木、瘫痪等症状，严重的可导致死亡。常用的检测方法有 高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱(HPLC/Q-TQFMS)联用技术，但是花费大、耗时、可变 性高、灵敏度低、受待检样品量的限制、不能对特定毒素提供确定性的证据，现阶段缺乏一 种简单有效的检测μ-CTX的方法。
发明内容
本发明提供了一种简单、有效的利用基因工程单链抗体检测μ -芋螺毒素的试剂本发明的技术方案如下
本发明的利用基因工程单链抗体检测μ -芋螺毒素的试剂盒，其试剂包括
(1)样品提取液去离子水；
(2)标准试剂TRX-CTX毒素；
(3)酶标抗原试剂为含TRX-CTX-HRP偶联蛋白的0.OlM、pH为7. 4的PBS溶液，保存 于50% (体积比)的甘油内，-20°C保存，效价为5000 ；
(4)洗涤液TNT溶液；配方组份0.05% (体积比)吐温-20，20 mmol/L Tris 一 HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA试剂含5% (重量比)BSA的TNT溶液；
(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L、pH 6.8 的 Tris-HCl，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% (体 积比)H2O2 ；
(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。利用所述试剂盒检测μ -芋螺毒素的方法，依次包括以下步骤
(1)样品处理在Ig样品中加入样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取10 min，5000rpm离心10 min，上清液即为含样品的样品提取液；
含样品的样品提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂； 系列浓度的TRX-CTX毒素标准试剂0. 01，0. 1，1. 0，10 ng/mL各100 μ L分别与100 μ L酶标抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；
(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；(3)小孔编号取出酶标条放置在反应板支架上，标记1号孔为阴性孔，2- 5号孔为 TRX-CTX毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已固相化抗μ-CTX单链抗体；
(4)洗涤每孔加入250μ L洗涤液，洗涤液不得溢出，放置aiiin后，弃去洗涤液，并在 吸水纸上拍干，重复洗板一次；
(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 每个样品孔内加入A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔内试剂混勻；
(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；
(7)洗涤取出反应板，去掉步骤(5)所加试剂，拍干，每孔加入250μ L洗涤液，洗涤液 不得溢出，放置2 min后，弃去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；
(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将酶标板放入37 °C恒温箱中存放15
min ；
(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各 孔内物质的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标 准曲线，根据标准曲线得到样品中μ-CTX的浓度，根据计算公式μ- CTX含量(ng/g) = c*v / m，其中C为μ- CTX的浓度，ng/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m_样品质量，g ；计算样品 中μ-CTX的含量。所述抗μ-CTX单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。其中所述抗μ -CTX单链抗体制备方法如下从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，使 用Trizol试剂盒提取小鼠脾脏总RNA，经反转录成cDNA。经PCR扩增抗体重链可变区Vh 基因和轻链可变区Vl基因，PCR扩增程序为94°C 5 min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 45s, 33 循环；72°C延伸10 min;然后1 %的琼脂糖凝胶电泳，验证PCR扩增产物；由于PCR产物 均只有一条带，回收Vh和八的PCR产物。通过一段连接肽(Linker，Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser)把 Vh 和 \ 连接成单链抗体(scFv)，然后克 隆到载体(pCANTAB 5E)上构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对μ -CTX具高亲 和力的单链抗体。为了克服现有单克隆抗体生产费时费力费钱的不足，本发明提供了一种基因工程 单链抗体，其结构如图1所示。该单链抗体(SCFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区 (Vh)和轻链可变区(VJ通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组蛋白，如图2所示，抗 μ-CTX单链抗体重链可变区(Vh)的大小为345 bp ；如图3所示，抗μ-CTX单链抗体轻链可 变区的大小为325 bp ；如图4所示，抗μ-CTX单链抗体(scFv)的大小为750 bp ；该单 链抗体(scFv)保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可在细菌 中很经济地大规模生产，使得用于免疫检测的抗体生产变得非常容易、简便和经济，进而大 大减少诊断试剂的费用。本试剂盒的最小检出量为0. 05μ g/Kg。本发明的显著优点
可以在大肠杆菌中高效表达本发明的抗μ -CTX小分子基因工程单链抗体，并大规模 生产，整个生产过程简单、省时省力省钱。在1.5-2 h时间内即可确定样品是否受μ-CTX 毒素污染，以及所含μ -CTX毒素的量，使用方便快捷，成本低廉。
图1是本发明的单链抗体结构示意图；图2是本发明的单链抗体重链基因Vh扩增的电泳图； 图3是本发明的单链抗体轻链基因\扩增的电泳图； 图4是本发明的单链抗体基因scFv扩增的电泳图； 图5是本发明的单链抗体竞争ELISA检测曲线图。
具体实施例方式以下为本发明的具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1
按以下试剂组成制作利用基因工程单链抗体检测μ -CTX的试剂盒 (ι)样品提取液去离子水；
(2)标准试剂分别为含0. 01，0. 1，1. 0，10 ng/mL的TRX-CTX毒素样品；标准试剂制备 方法如下
A重组质粒pET3h-CTX的构建
把退火后形成双链的CTZ基因插入到同样经汉3 H I和I双酶切的pET3h载体 中，以T4 DNA连接酶连接过夜，pET3h-C7Z重组后的质粒经测序鉴定。B TRX-CTX融合蛋白的诱导表达
采用CaClji制备感受态见力。将pET3^i-C7Z质粒转化入大肠杆菌见中。挑取 转化成功的克隆接种到含氨苄的LB培养基中，以见力空菌为阴性对照，和含pET3h-C7Z 质粒的见力一起37°C振摇过夜，2%比例接种于新鲜的LB培养基，培养至细菌密度为0D_ 0.8。取出1 mL，其余加入IPTG至终浓度为0. 1 mM，于37°C诱导表达3 h。C TRX-CTX融合蛋白的可溶性分析及纯化
将诱导表达后的重组菌5000 r/min离心5min，弃上清，沉淀重悬于冰预冷的PBST [含 2 mM EDTA CpH 8. 0)和0. 1% β-巯基乙醇]中，以超声破碎法裂解，裂解产物放置过夜。 把裂解物以15000 r/min离心15 min，取出上清(沉淀约占总体积的m 4%)，并向沉淀中 加入与上清等体积的PBS，重悬。各取10 μ L沉淀及上清溶液，分别加入等体积的上样缓冲 液，煮沸3 5min，进行SDS- PAGE，以检查融合蛋白的可溶性。将上清部分上柱纯化，纯化 后的融合蛋白经SDS-PAGE鉴定。按Bradford法测定融合蛋白的含量。(3)酶标抗原试剂为含TRX-CTX-HRP偶联蛋白的0. OlM PBS溶液，保存于体积比 50%的甘油内，_20°C保存，效价为5000 ；使用时用PBS试剂稀释；酶标抗原试剂制备方法参 考黄雨墨.HRP与毒素交联及其应用于检测的研究.福建农林大学理学学士论文，制备方法 如下
A HRP上引入巯基
a)将1.3 mg HRP 溶于 520 μ L Solution 1 (pH 7.5)，加入 7 μ #-Succinimidyl S-Acetylthioacetate (SATA ；50 mg/mL，溶于 DMSO 中)，室温下反应 30 min ；
b)在Solution1 (pH 7. 5)中透析，换两次透析液；
c)回收透析产物，加入100μ Solution 3 (pH 7. 5)，室温下反应2 h ；
d)在磷酸缓冲液(含ImMEDTA，pH 7. 0)中透析，换两次透析液。B HRP 与 TRX-CTX 交联
a)将54 μ TRX-CTX (5 mg/ml，溶于DMS0)加入1. 5 mL离心管中，再加入8 μ #-[ 7-maleimidophenyl] isocyanate (PMPI ；50 mg/ml，溶于 DMS0)，用三乙胺调节 pH 值 8. 5，50°C反应过夜；
b)用酸调节pH值至7.0;
c)与(1)中的产物混合，4°C反应4h；
d)加入过量的半胱氨酸终止反应；
e)在磷酸缓冲液(PBS)中透析，得交联产物，-20°C保存。(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0. 05%吐温-20，20 mmol/L Tris -HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA试剂含5% BSA的TNT溶液；
(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% H2O2;
(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。利用上述试剂盒按以下步骤检测μ -CTX毒素
(1)样品处理在Ig样品(鲍鱼、带鱼、扇贝、小黄鱼等肉质部分)中加入細1样品提取 液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取10 min，5000rpm，离心10 min，上清液即为含样品的样 品提取液；
含样品的样品提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂； 系列浓度的TRX-CTX毒素标准试剂0. 01，0. 1，1. 0，10 ng/mL各100 μ L分别与100 μ L酶标抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；
(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；
(3)小孔编号根据需要取出酶标条放置在反应板支架上。1号孔为阴性孔，2— 5号 孔为TRX-CTX毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗μ -CTX单 链抗体；所述抗μ -CTX单链抗体制备步骤为从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，经反转录成 cDNA，经PCR扩增抗体重链可变区Vh基因和轻链可变区\基因，通过一段连接肽(Linker) 把Vh和\连接成单链抗体(scFv)，然后克隆到载体上构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘 选以获得对μ-CTX具高亲和力的单链抗体。(4)洗涤每孔加入250 μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置^iiin后，去掉洗涤液，在 吸水纸上拍干，重复洗板一次；
(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 5号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；
(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；
(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干。每孔加入250μ L洗涤液，洗液不得溢出， 放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；
(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15
min ；
(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各 孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线。通过抗μ -CTX单链抗体上的E-tag将抗μ -CTX单链抗体与固定于酶标条上的抗 E-tag抗体结合，形成固相抗体；加入待测样品和TRX-CTX毒素的酶标抗原试剂，样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，待测样品中抗原含量越高，则与固相抗体结合的越 多，使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少，甚至没有机会结合，这样加入底物后就不 显色或显色很浅，显色深者为阴性。如表1所示，随着所加入的标准浓度TRX-CTX毒素的浓 度的逐步升高，相对应的吸光值OD值逐步减少。根据此数据绘制的TRX-CTX毒素标准浓度 曲线如图5所示，0D450 nm处吸光值与待测样品的浓度呈反比关系，因此根据待测样品的 0D450 nm处吸光值就可判断样品中含有的μ-CTX的浓度。根据计算公式样品中μ -CTX含量(ng/g) = C*V / m，其中C-样品中μ -CTX的浓 度，ng/mL;V-样品提取液的体积，mL;m-样品质量，g;计算样品中μ-CTX的含量。当吸光 值为 0. 035 时，μ -CTX 含量0. 005*4 /1 = 0. 02 ng/g。表1本发明的单链抗体的竞争ELISA检测
注浓度为Ong/mL时，为酶标抗原试剂和等体积的PBS，其他样品孔除了酶标抗原试 剂外，还分别加入等体积的TRX-CTX毒素标准溶液(浓度分别为0. 01,0. 1,1. OUO ng/mL)。
权利要求
1.一种利用基因工程单链抗体检测μ-芋螺毒素的试剂盒，其特征在于其试剂包括(1)样品提取液去离子水；(2)标准试剂TRX-CTX毒素；(3)酶标抗原试剂为含TRX-CTX-HRP偶联蛋白的0.OlM、pH为7. 4的PBS溶液，保存 于50% (体积比)的甘油内，_20°C保存，效价为5000 ；(4)洗涤液TNT溶液；配方组份0.05% (体积比)吐温-20，20 mmol/L Tris 一 HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；(5)BSA试剂含5% (重量比)BSA的TNT溶液；(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L、pH 6. 8 的 Tris-HCl, _20°C保存；使用时加 7 μ L 30% (体 积比)H2O2 ；(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。
2.一种利用权利要求1所述试剂盒检测芋螺毒素的方法，其特征在于依次包括 以下步骤(1)样品处理在Ig样品中加入細1样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取10 min，5000rpm离心10 min，上清液即为含样品的样品提取液；含样品的样品提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂；系列浓度的TRX-CTX毒素标准试剂0. 01,0. 1,1. 0，10 ng/mL各100 μ L 分别与100 μ L酶标抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；(3)小孔编号取出酶标条放置在反应板支架上，标记1号孔为阴性孔，2- 5号孔为 TRX-CTX毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已固相化抗μ-CTX单链抗体；(4)洗涤每孔加入250μ L洗涤液，洗涤液不得溢出，放置aiiin后，弃去洗涤液，并在 吸水纸上拍干，重复洗板一次；(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 每个样品孔内加入A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔内试剂混勻；(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；(7)洗涤取出反应板，去掉步骤(5)所加试剂，拍干，每孔加入250μ L洗涤液，洗涤液 不得溢出，放置2 min后，弃去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将酶标板放入37 °C恒温箱中存放15min ；(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各 孔内物质的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标 准曲线，根据标准曲线得到样品中μ-CTX的浓度，根据计算公式μ- CTX含量(ng/g) = c*v / m，其中C为μ-CTX的浓度，ng/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m_样品质量，g ；计算样品中 μ-CTX的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述抗μ-CTX单链抗体的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
全文摘要
本发明提供了一种利用基因工程单链抗体检测μ-芋螺毒素的试剂盒及方法，本发明的试剂盒中，其试剂包括样品提取液、标准试剂、酶标抗原试剂、洗涤液、BSA试剂、显色底物、终止液。通过样品处理、试剂平衡、洗涤、加样、孵育、洗涤、显色、终止，计算样品中μ-CTX的含量。本发明可以在大肠杆菌中高效表达抗μ-CTX小分子基因工程单链抗体并大规模生产，整个生产过程变得非常简单，省时省力省钱。使用方便快捷，成本低廉。
文档编号G01N33/543GK102095849SQ201010604210
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者余晟兴, 庄振宏, 李恒, 汪世华 申请人:福建农林大学