专利名称：检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微 球及其制备方法。
背景技术：
蛋白酶抑制剂广泛存在于植物体内，尤其在植物的贮藏器官内含量相当高。在植 物体内蛋白酶抑制剂的生物学功能主要有两个方面①通过与内源蛋白酶相互作用，调控 组织细胞内的有关生理生化过程；②防止细胞、组织内的蛋白质成分被外源蛋白酶所降解。 其更重要的作用在于作为一种抵御外界植食性昆虫和微生物攻击的化学防卫因子。研究证 实，大多数植物来源的蛋白酶抑制剂对植物内源性蛋白酶没有抑制作用，但对外源蛋白酶 有特异的抑制活性，这就为通过基因工程提高农作物防卫系统的效能提供了自然进化上的 ■石出。豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor，CpTI)属丝氨酸蛋白酶抑制 剂。与Bt毒蛋白相比，其杀虫机理完全不同且具有杀虫广谱，对人畜安全，昆虫不易产生抗 性的优点而受到人们的重视。通过转基因技术将CpTI基因导入作物而获得的转基因植株 已在我国部分地区得到了大规模的应用，但迄今对于转基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制剂的 检测方法不多，且检测灵敏度、检测限和抗干扰能力等亟待提高。目前，有关CpTI抑制剂免 疫检测技术的研究报告和相关专利技术国内外报道很少，迫切需要开发高效、准确、快速的 新型免疫检测技术和产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球及其制备方 法，进一步填补CpTI抑制剂免疫检测技术的研发空白；取材简单、操作方便；制备方法细 致严谨，重复性高；所制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均勻，能检测CpTI融合蛋白最低限 0.2yg/ml，其相关系数 R2=O. 67。本发明的目的是通过以下技术方案来实现
一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球，免疫微球由抗CpTI蛋白多克隆抗体 包被，微球颗粒大小为200nm，最低检测限为CpTI融合蛋白0. 2 μ g/ml，相关系数R2=O. 67。—种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法，包括以下步骤
1)设计全长CpTI基因序列，根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并采用全基因 合成技术构建全长CpTI基因表达序列；
2)将步骤1)得到的CpTI基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基 因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；
3)通过步骤2)对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合蛋白；
4)将经过步骤3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐剂后免疫小鼠，经分离纯 化得到鼠抗CpTI多克隆抗体；
5)将经过步骤4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗体通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微 球，得到检测CpTI蛋白的免疫胶乳微球。在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤2) 中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体是pGEX-4T-2，构建完成后的融合表达载 体是 pGEX-4T-2-CpTI。在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤3) 中的亲合层析柱为谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharose) 4B。在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤5) 中采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，羧基化聚苯乙烯微球大小200nm，表面载基 团为羧基，羧基化聚苯乙烯的分子式如下
该微球的活化是首先用活化剂EDC (碳化二亚胺)活化微球，然后加入保护剂N-羟 基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子之用。本发明的有益效果为采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用化学偶联 方法偶联抗CpTI多克隆抗体获得，取材简单、操作方便；制备方法细致严谨，重复性高；所 制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均勻，能检测CpTI融合蛋白最低限0. 2 μ g/ml，其相关 系数 R2=O. 67。
下面根据附图对本发明作进一步详细说明。图1是本发明实施例所述的羧基化聚苯乙烯微球的扫描电镜图；图2是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 CpTI基因的原序列全长图谱；
图3是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 经优化后的CpTI基因序列图谱；
图4是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 菌落PCR验证CpTI基因插入片段电泳图谱；
图5是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 质粒)(ba I酶切电泳图谱；
图6是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 CpTI表达载体的测序图谱；
图7是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 GST-CpTI融合蛋白SDS-PAGE的检测图谱；
图8是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 GST-CpTI融合蛋白Wfestern Blotting的检测图谱；
图9是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 抗血清效价测定图10是本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中 采用胶乳增强免疫比浊法检测CpTI融合蛋白结果图。
具体实施例方式本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球，免疫微球由抗 CpTI蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小为200nm (图1)，最低检测限为CpTI融合蛋白 0. 2μ g/ml，相关系数 R2=O. 67。本发明实施例所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法，包括 以下步骤
1)设计全长CpTI基因序列，根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并采用全基因 合成技术构建全长CpTI基因表达序列；
2)将步骤1)得到的CpTI基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基 因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；
3)通过步骤2)对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合 蛋白；
4)将经过步骤3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐剂后免疫小鼠，经分离纯 化得到鼠抗CpTI多克隆抗体；
5)将经过步骤4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗体通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微 球，得到检测CpTI蛋白的免疫胶乳微球。在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤2) 中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体是pGEX-4T-2，构建完成后的融合表达载 体是 pGEX-4T-2-CpTI。在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤3)中的亲合层析柱为谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharose ) 4B。在上述所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法中，在步骤 5)中的微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，大小200nm，表面载基团为羧基；该微球的活 化是首先用活化剂EDC (碳化二亚胺)活化微球，然后加入保护剂N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子之用。实例
本发明在具体实施时，包括以下步骤 1)构建全长CpTI基因表达序列
(a)设计全长CpTI基因序列，结果如图2所示；
(b)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰，采用全基因合成技术构建全长CpTI基 因，共333对碱基，克隆至载体pGEM-T Easy,结果如图3所示；
(c)通过菌落PCR验证CpTI基因片断插入的正确性，结果如图4所示；
(d)将克隆CpTI基因菌实施扩增培养，提取质粒后进行酶切和琼脂糖电泳分析，结果 如图5所示；
(e)DNA测序，保证基因的全部序列100%准确，结果如图6所示。2)表达和纯化提取GST-CpTI融合蛋白
(a)将CpTI基因片段通过限制酶切割插入PGEX-4T-2载体中，构建细菌融合表达载体 pGEX-4T-2-CpTI ；
(b)将融合表达载体pGEX-4T-2-CpTI转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，细胞生长条件为 230转/分，温度37° C;
(c)当菌体生长OD595值为0.5-0. 8时，加入1. OmM的诱导剂IPTG，在25° C诱导3小 时；在4° C时，以5，000X g离心5分钟，收集菌体；
(d)菌体经PBS缓冲液清洗3次后，超声破碎；破碎细胞在4°C时，以14，000' g离 心1小时，收集上清；
(e)将上清循环通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶(GlutathioneSepharose )4B亲合层析柱， 4° C过夜；未结合蛋白用10倍床体积的IX PBS冲洗；
(f)将结合的GST-CpTI融合蛋白用洗脱液洗脱并收集、保存；并对表达和纯化提取的 GST-CpTI融合蛋白做SDS-PAGE和^festern Blotting分析，结果如图7和8所示。3)制备抗CpTI多克隆抗体
(a)将GST-CpTI融合蛋白抗原与弗氏佐剂混合后，充分乳化；采用背部多点注射法免 疫BALB/c小鼠；每次免疫的抗原量约10 μ g，免疫三次；每次免疫两周后经尾动脉取血检 测抗体效价；
(b)以适宜浓度的抗原包被酶标板，100μ 1/孔，4° C过夜；
(c)洗涤后，加入待检的血清样品，ΙΟΟμΙ/孔，37°C 1小时；设阴性对照孔；
(d)洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG的抗体试剂，100μ 1/孔，37° C避光显色15 分钟；用2Μ H2SO4终止反应后，阅读各孔的Α490值；并对制备的抗GST-CpTI融合蛋白抗体， 经ELISA法检测，抗体能与GST-CpTI，GST蛋白特异性结合，其相关系数达到显著水平，效价 >1:8000，结果如图9所示。4)制备用于检测CpTI蛋白的免疫胶乳微球(a)将单分散羧基化聚苯乙烯微球用活化剂EDC(碳化二亚胺)活化，然后加入保护剂 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)使微球形成稳定的活泼酯中间体；
(b)加入抗CpTI蛋白多克隆抗体，温育1-2小时；
(c)洗涤后，收集免疫微球；
(d)通过CA-1680型生化分析仪，采用胶乳增强免疫比浊法，检测CpTI融合蛋白样品。
采用本发明所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法，制备 出的免疫胶乳微球经生化分析仪检测，用于检测CpTI蛋白的免疫胶乳微球最低检测限为 CpTI融合蛋白0.248/!111，其相关系数1 2=0.67，结果如图10所示。由此可见，本发明所制 备的用于检测CpTI蛋白的免疫胶乳微球检测灵敏度较高，且操作简单、重复性强，显示了 良好的应用前景。
权利要求
1.一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球，其特征在于免疫胶乳微球由抗 CpTI蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小为200nm，最低检测限为CpTI融合蛋白0. 2 μ g/ ml，相关系数R2=O. 67。
2.根据权利要求1所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球，其特征在于，所 述免疫胶乳微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，颗粒大小为200nm，表面载基团为羧基。
3.—种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤1)设计全长CpTI基因序列，根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并采用全基因 合成技术构建全长CpTI基因表达序列；2)将步骤1)得到的CpTI基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基 因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；3)通过步骤2)对表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合 蛋白；4)将经过步骤3)得到的GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐剂后免疫小鼠，经分离纯 化得到鼠抗CpTI多克隆抗体；5)将经过步骤4)得到的鼠抗CpTI多克隆抗体通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微 球，得到检测CpTI蛋白的免疫胶乳微球。
4.根据权利要求3所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法，其特 征在于，在步骤2)中所述谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体是pGEX-4T-2，构 建完成后的融合表达载体是pGEX-4T-2-CpTI。
5.根据权利要求3所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备方法，其特 征在于，在步骤3)中所述亲合层析柱为谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B。
6.根据权利要求3-5任一项所述的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球的制备 方法，其特征在于，在步骤5)中所述免疫胶乳微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，颗粒大 小为200nm，表面载基团为羧基；所述免疫胶乳微球的活化是首先用碳化二亚胺活化微球， 然后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子之 用。
全文摘要
本发明涉及一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的免疫胶乳微球及其制备方法，该免疫微球由抗CpTI蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小200nm；所述免疫胶乳微球的制备方法包括以下步骤设计全长CpTI基因序列；将CpTI基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合蛋白；将GST-CpTI融合蛋白抗原溶合弗氏佐剂后免疫小鼠，经分离纯化得到鼠抗CpTI多克隆抗体；将抗体通过化学偶联法偶联活化后的微球，得到检测CpTI蛋白的免疫胶乳微球。本发明的有益效果为灵敏度较高，且操作简单、重复性强；所制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均匀，能检测CpTI融合蛋白最低限0.2μg/ml，其相关系数R2=0.67。
文档编号G01N33/531GK102109521SQ201010591728
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者李俊生, 潘卫东, 王学霞, 肖能文 申请人:中国环境科学研究院