牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素elisa检测试剂盒及使用方法

专利名称：牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素elisa检测试剂盒及使用方法
牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒及使用方法技术领域
本发明属于动物病毒性疾病的监测和诊断试剂研究领域，具体涉及牛病毒性腹 泻病毒抗原的双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。
背景技术：
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)又称牛病毒性腹泻-黏膜病毒，在分类学上属黄病 毒科瘟病毒属成员，与属内的猪瘟病毒(CSFV)及羊边界病毒(BDV)在血清学上有交叉 反应。BVDV是牛群疾病中一种重要病原，其感染牛可呈现多种临床症状，如高热、白 细胞减少、下痢、流涎、反刍停止、结膜炎、黏膜出血、持续性感染、免疫抑制等，还 能引起奶牛产奶量下降，母牛流产、产死胎和畸形胎。
自1946年Olafson等首次在美国纽约州发现该病以来，已在世界范围内广泛流 行，给世界各国畜牧业造成了严重的经济损失。据文献统计，从上世纪80-90年代以 来，在北美州，美国、加拿大感染BVDV的阳性率为50-85%;在南美洲，巴西阳性率为 15.1-56%，委内瑞拉阳性率为36-37%，秘鲁阳性率为50-96% ；在欧洲，法国、德国血 清学阳性率为76%，瑞典阳性率为10-80%，芬兰肉牛的阳性率大于50%，波兰阳性率为 86%,立陶宛阳性率为70-100% ；在澳大利亚和新西兰阳性率达89%。BVDV除了感染 牛，还能侵害羊、猪、鹿和骆驼等多种野生动物，据调查研究显示，该病在野生动物中 的感染情况比较广泛，而且常常呈持续性感染状态。
我国自1983年李佑名首次从国外引起牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出 BVDV,证明该病在中国的存在。目前已有20多个省市自治区报道存在该病。王新 平等曾对内蒙古、吉林、宁夏等不同地区的牛、羊、鹿进行了病原学调查，结果发现感 染率分别为16.5%-89.0%、14.6%-83.3%、19.6%_44.4%。宋永峰等对浙江、安徽、湖 南、江西、广西、辽宁等地43份猪病料进行BVDV检测，结果检出阳性率为16.3%。 这表明BVDV也同样严重危害着我国畜牧业的发展。值得注意的是，自上世纪90年代 来，从世界各地流行地区牛急性爆发病例中分离和鉴定的病原几乎都是基因2型BVDV(BVDV-2)，给养牛业造成巨大的经济损失。因此世界各国将BVDV-2持续感染牛的 防疫与监控作为BVDV流行病学调查的重点。
随着养牛业和奶牛业在我国畜牧业中所占比重不断增加，有必要加强对BVDV 的诊断与防控工作。BVDV诊断的方法可从特异性抗体和抗原两个方面进行，但由于 BVDV持续性感染，感染动物常表现为免疫耐受，体内抗体滴度低，且终身排毒及受母 源抗体影响，抗原检测更具有实际意义。用于抗原检测的方法众多，但相比之一，适用 于基层、大批样品检测的方法仍为ELISA。ELISA检测方法已经成为国内外动物疫病常 规的诊断技术。在欧美许多养牛业发达的国家，都将双抗夹心ELISA作为根除BVDV持 续感染牛的一种诊断方法，并都制备成试剂盒；且这些试剂盒价格昂贵，在我国大规模 运用检测受到一定的限制。为此，随着我国养牛业和奶牛业的快速发展，BVDV感染率不断升高，建立一种适应我国国情的BVDV检测方法势在必行。 发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、灵敏度高、特异性强、适合大规模检测的单 克隆抗体介导的双抗夹心ELISA方法。
本发明的技术方案(1)检测抗原的制备a)优化pET^a_BE2重组菌的表达条件，大规模诱导表达E2糖蛋白b)纯化E2糖蛋白，并用SDS-PAGE分析检测确定抗原浓度(2)单克隆抗体3D8的制备a)纯化的表达E2蛋白的pEC143质粒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化，制 备免疫原，免疫BALB/c小鼠b)免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选分泌抗E2蛋白的单克 隆抗体阳性杂交瘤细胞C) 阳性杂交瘤细胞3D8亚克隆建株、腹水制备与纯化(3)单克隆抗体3F9的制备a)纯化的890病毒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化，制备免疫原，免疫 BALB/c小鼠b)免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选c)阳性杂交瘤细胞亚克隆建株、腹水制备与纯化(4)双单克隆抗体(双抗)夹心生物素-亲和素ELISA方法的建立及应用a)3F9生物素标记及效价测定b)双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法的建立C) 双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测疑似BVDV临床样品 本发明的牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒，包括用于 ELISA检测的洗涤液、显色液、终止液，Streptavidin-HRP、阳性对照，阴性对照，还有 包被牛病毒性腹泻病毒单抗3D8的酶标板、生物素标记的牛病毒性腹泻病毒单抗3F9 (二 抗)O
上述所说的用于ELISA检测的洗涤液、显色液、终止液是常规的。例如，洗涤 液是(0.05%Tween-20+0.01mol/L PH7.4 PBS)，显色液是(DAB 显色液)、终止液是(2mol/L H2SO4)。
上述所说阳性对照是筛选出的阳性血清(OD49020.322)，阴性对照是筛选出 的阳性血清(OD490<0.322)。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法(1)包被用PH9.6的碳酸盐缓冲液稀释纯化的单克隆抗体3D8至l-2(hig/ml，按 IOOul/孔加于聚苯乙烯微孔板中，37°C放置Zh，然后转移至4°C，放置过夜。洗涤，甩 干。
(2)封闭含10%小牛血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，150ul/孔，37°C孵育2h。 洗涤，拍干。
(3)加待检样品IOOul/孔，37°C孵育lh。洗涤，拍干。
(4)加生物素标记的二抗每孔加IOOul biotin_3F9，37°C孵育lh。洗涤，拍干。
(4)加亲和素按 IOOul/孔，加 keptavidin-HRP，37°C孵育 10_20min。洗涤，拍干。
(5)终止每孔加50ul 2mol/L H2SO4,终止反应。
(6)在酶联免疫阅读仪上读取OD49tl值与阳性对照和阳性对照比对。
本发明的优点(1)以双单抗捕获BVDV抗原，与猪瘟病毒、1型牛疱疹病毒、牛轮状病毒均无交 叉反应；(2)由于检测的是抗原，可避免因体内抗体滴度低而出现漏检现象；(3)用纯化的单克隆抗体包被，特异性高；(4)使用生物素-亲和素增敏剂，起放大作用，灵敏度增高，提高检出率，同时减 少了二抗3F9的用量；(5)对35份疑似BVDV感染病牛血分别用本发明提供的ELISA和RT-PCR方法进 行检测，两种方法的符合率很高，达94.四％。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背 离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于 本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常 规手段。
本发明中的生物材料质粒pEC143 (来源于美国宾夕法尼亚大学Dr.Leonard J. Bello 教授，联系方式为电话(001) 215-898-9596(0),传真 215-898-7887，Email 为Ijbello@vet.upenn.edu)、pET28a_BE2 (来源于军事医学科学院涂长春教授，联系 方式为电话 431-87960009(0),传真 0431-87960009，Email 为 changchun_tu@hotmail. com)、JM109和BL21(DE3)(均为商品化的大肠杆菌工程菌)，均向公众公开。
实施例1:牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体(McAb) 3D8研制 1实验方法1.1免疫原的制备取PEC143质粒转化感受态宿主菌JM109，挑取单个菌落扩大培养并收获重组菌， 碱裂解法大量提取质粒pEC143，聚乙二醇沉淀法纯化该质粒DNA。以XbaI和Bgl II进 行双酶切鉴定后，进行DNA定量并免疫小鼠。
1.2小鼠免疫以大腿肌肉注射法用重组pEC143质粒免疫6周龄BALB/c小鼠，每只小鼠注射质粒 前24h，注射25%蔗糖溶液ΙΟΟμ ，每次多点肌注质粒100昭，每隔两周免疫一次，共免 疫6次，间接ELISA抗体效价达1:104，并于融合前3d加强免疫。
1.3检测抗原的制备取ρΕ 8&-ΒΕ2质粒转化感受态宿主菌BL21 (DE3)，将提取的质粒用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切鉴定。以IPTG诱导pET28a_BE2重组细菌表达E2蛋白，超声 波裂解细菌以获得大量表达的E2重组蛋白。E2重组蛋白的纯化参照Polyhistidine-Tagged Proteins (Proteins Ni_TED 2000)说明书进行。以PBS (pH7.2)对浸提液蛋白进行透 析，通过SDS-PAGE电泳检测分析和测定OD26tl和OD28tl值，确定蛋白浓度。
1.4细胞融合及阳性杂交瘤细胞株筛选将1.0 X IO8个免疫小鼠脾细胞与2.0 X IO7个SP2/0骨髓瘤细胞在50% PEG2 000作用 下按常规方法进行融合，于96孔培养板中37°C 5%C02饱和湿度的细胞培养箱中培养。 检测抗原E2蛋白包被酶标板，通过间接ELISA法对融合后的杂交瘤细胞上清液进行筛 选。采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化，同时扩大培养；连续 克隆化三次以上，直至所有单克隆孔检测均为阳性且OD49tl值稳定后建株，进行扩大培养 并液氮冻存。
有限稀释法的具体步骤将ELISA检测为阳性孔中加入200ul培养液，把吹打 下来；吸取IOOul于96孔板Al孔中(提前在A1-A12孔中加IOOul培养液)，做倍比稀 释，选择约100个/孔的孔内细胞于6ml培养液中混勻(100个/6ml)；将此细胞混合 液以IOOul/孔(即1.7个/孔)加入新的96孔板中(总共加A-C排，共36孔)；在剩 余的细胞液中补加2.4ml培养液，混勻，将此细胞培养液以IOOul/孔(即0.8个/孔)加 入新的96孔板中(总共加D-F排，共36孔)；在剩余的细胞液中补加1.2ml培养液，混 勻，将此细胞培养液以IOOul/孔(即0.5个/孔)加入新的96孔板中(总共加G-H排， 共对孔)；培养7-10天，观察，取单个克隆生长的阳性孔再重复以上操作进行亚克隆。
1.5腹水的制备与纯化选用10-12周龄BALB/c小鼠5只，每只腹腔注射降植烷0.3mL，8天后，将培养的 杂交瘤细胞以lOOOr/min离心ΙΟη ι，弃去上清液，杂交瘤细胞用无血清的培养液悬浮， 每只小鼠腹腔注射5.8Χ IO5细胞。接种杂交瘤细胞5天后，每日观察小鼠腹水的生成情 况，待小鼠腹部膨胀明显时收集腹水，1500rpm离心ΙΟη ι以去除细胞碎片等杂质，间 接ELISA测定上清效价并用二氧化硅吸附法进行纯化后，于-20°C保存备用。
1.6 McAb 鉴定1.6.1 McAb的ELISA效价测定用间接ELISA检测杂交瘤细胞培养液和腹水中的效价，同时以SP2/0细胞培养上 清液和正常小鼠腹水作为阴性对照，以P/N22.1的最高稀释倍数为单抗的效价。
1.6.2 McAb特异性检测将 BVDVl 标准毒株(NADL，Oregon C24V)禾Π 2 株 BVDVl 分离株、BVDV2 标准毒株(890，104)和3株BVDV2分离株、牛轮状病毒(BRV)、牛疱疹病毒1型 (BHV-I)全病毒、重组表达的Ε2蛋白分别做适当稀释后包被，以阳性杂交瘤细胞株的 培养上清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，OPD底物显色，测定OD49tlIim值。 同时以纯化的Ε2蛋白和BVDVl (NADL)病毒为阳性对照，SP2/0细胞上清作为阴性 对照。
1.6.3 Western blotting 鉴定将E2蛋白原核表达产物与5X上样缓冲液混合，煮沸8η ι，进行SDS-PAGE ；将电 泳条带进行蛋白质印迹反应，用Bio-Rad转印系统，以350mA湿法转印90min，将蛋白条带转印至硝酸纤维素(NC)膜上，进行抗原抗体反应，一抗为1:1000稀释的小鼠腹水， 二抗为1:2000稀释的羊抗鼠IgM-HRP，二氨基联苯二胺(DAB)显色。
1.6.4 McAb 亚类鉴定采用Sgma公司鼠类单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书进行坛亚类鉴定。
1.6.5 McAb稳定性鉴定将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞体外连续传10、20和30代，间接ELISA法测定上 述杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的效价。
2实验结果2.1质粒pEC143的大量提取及酶切鉴定质粒pEC143经碱裂解法大量提取及聚乙二醇法纯化后，经1:100稀释，以XbaI和 Bgl II进行双酶切，出现了 1.15 和8.85 左右的两条带，其中1.15 左右的条带为插 入的目的片断E2基因，与预期大小相符合，验证重组质粒的正确性。
经紫外分光光度仪检测，测得OD^0/C)D280=1.87，质粒pEC143浓度为2 μ g/ yL。表明质粒的纯度和浓度都比较高，可用于免疫小鼠。
2.2 E2抗原表达重组质粒pET28a_BE2的酶切鉴定pET28a-BE2质粒经EcoRI和XhoI双酶切后，出现了 l.lkb和5.3kb的两条带，其中 1.Ikb条带为插入目的片断E2基因，与预期大小相符合，而对照pET^a(+)载体酶切后 则只有5.3kb左右，与预期和研究报道相一致。
2.3细胞融合及筛选免疫BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后第14天开始检测，挑选间接ELISA检 测结果为阳性，OD490值>1.0且一直比较稳定的杂交瘤细胞进行亚克隆，共记录6块96 孔细胞培养板中出现明显细胞克隆的培养孔，计算细胞融合率为70%，阳性率为5.25%。 经选择培养、特异性抗体检查、筛选并进行3次有限稀释法克隆，最终获得获得稳定分 泌抗体的杂交瘤细胞一株，命名为3D8 (由发明人所在的扬州大学畜禽病原微生物学研 究室保存，自申请日起向公众提供20年)。
2.4 McAb 的鉴定 2.4.1 McAb效价测定采用间接ELISA测定杂交瘤细胞株3D8的细胞上清液效价为512，腹水效价10 X 27, 纯化腹水单抗含量约为5mg/mL。
2.4.2 McAb特异性的鉴定经间接ELISA检测，3D8杂交瘤细胞株培养上清液只与测试的BVDVl型病毒标准株 (NADL、OregonC24V)和2株分离株，BVDV2型病毒标准株(890、104)和3株分离 株，纯化的E2蛋白和BVDVl (NADL)病毒发生反应，而不与牛轮状病毒(BRV)、牛 疱疹病毒1型(BHV-I)反应，表明该McAb只特异性识别和结合BVDVl和BVDV2。
2.4.3 Western blotting 鉴定pED8a_BE2重组菌诱导表达产物经SDS-PAGE后，进一步转印至NC膜上，Western blotting鉴定结果表明，约分子量大小43KDa处的一条蛋白带条被杂交瘤细胞株3D8所分 泌的单克隆抗体特异性识别，而对照载体菌则没有出现相应的蛋白条带。由于该蛋白带 与E2编码基因表达的BVDVE2囊膜糖蛋白预期大小相一致，表明筛选到的单抗是特异性识别BVDVE2蛋白。
2.4.4 McAb 亚类鉴定杂交瘤细胞株3D8所分泌的单克隆抗体的分子亚类为IgM。
2.4.5 McAb稳定性鉴定将所获得的杂交瘤细胞株3D8连续传10、20和30代，采用间接ELISA测定得杂交 瘤细胞株细胞上清效价都能达到512，说明该杂交瘤细胞株连续传30代仍能稳定地分泌 单克隆抗体。
实施实例2 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体3F9的研制 1试验方法1.1病毒的浓缩与纯化将收获的890病毒感染细胞液，反复冻融2-3次，4°C8000rpm/mte离心40η ι，去除 细胞碎片；取病毒上清，在磁力搅拌器搅拌下缓慢加入40%的PEG-6000和固体NaCl， 至其终浓度分别为10%和2.3% ； 4°C条件下磁力搅拌过夜；次日，4°C 12000rpm/min 离心 50η ι，去上清，沉淀物用 TNE 缓冲液(0.0lmol/L Tris,0.1 mol/L NaCl,0.01 mol/ LEDTA钠盐，pH7.4)按原培养液体积的1%悬浮沉淀，此即为PEG浓缩病毒。
用20%蔗糖垫底离心纯化病毒。用20ml离心管，将20%蔗糖溶液作为垫底， 将PEG浓缩的病毒样品Iml缓慢铺于上层，于4°C 36 000rpm/min (BackmanL7_55,水平 转子SW40Ti)离心3h;弃上清，用适量的TNE缓冲液悬浮沉淀，4°CTNE透析过夜， 纯化的病毒用透射电镜(TEM)观察。
1.2检测抗原的制备在优化的表达条件下，诱导培养约500mL pET28a-BE2重组细菌，5000rpm离心 IOmin ；弃去上清，以25mL的PBS重悬细菌沉淀，同时加入溶菌酶至终浓度为IOOmg/ L，加入Triton至终浓度为1%，37°C作用15η ι;于冰浴中超声波裂解细菌至菌液不再粘 稠，4°C 10 OOOrpm离心IOmin沉淀包涵体；用lmol/L的NaCl和0.5%的Triton各洗涤 包涵体沉淀2次；以5mL PBS重悬包涵体沉淀，分装并于_20°C保存。制备SDS-PAGE 凝胶，使用特制的梳齿，使整面胶只形成一个大的泳道，以加入尽可能多的样品；电泳 结束后，取下凝胶，以0.25mol/L的KCl对凝胶进行显色，4°C作用ΙΟη ι后可见乳白色 的蛋白质条带；对照标准蛋白质切下所需的目的条带，用灭菌的IXPBS洗涤后转入无菌 的玻璃研磨器中磨碎。
将研磨后的凝胶小颗粒以浸提液(0.5mol/L Tris-HCl，O.lmmol/LEDTA, 0.15mol/LNaCl, 0.1%SDS, pH7.9)重悬，置4°C过夜，浸提出胶颗粒中的目的蛋白，其 间振摇3-4次，然后12 OOOrpm离心ΙΟη ι，上清即为纯化的Ε2蛋白。用pH7.2 PBS对浸提出的蛋白进行透析，通过SDS-PAGE后与标准蛋白marker进行比对，结合OD26tl和 OD28tl值，确定被检测的抗原浓度。
1.3 McAb 的制备用纯化的890病毒液免疫8周龄BALB/c小鼠数只，免疫程序为颈背部皮下多点注 射弗氏完全佐剂乳化的免疫抗原各50Ug/只；三周后皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等 量抗原；二免后间隔约三周再皮下注射等量裸露免疫抗原，IOd后采血，间接ELISA检 测动物产生的抗体滴度；挑选抗体滴度高的BALB/c鼠在融合前3d腹腔注射裸露免疫抗原进行强化免疫，IOOug/只。3d后将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法进行 融合，于96孔培养板中37°C，5%C02饱和湿度的培养箱中培养。以纯化的E2蛋白为 检测抗原，通过间接ELISA法对融合的杂交瘤细胞上清进行筛选。采用有限稀释法对连 续2次检测为阳性的细胞株进行克隆，连续克隆化3次至OD490值稳定后建株并进行扩大培养。
有限稀释法的具体步骤将ELISA检测为阳性孔中加入200ul培养液，把吹打 下来；吸取IOOul于96孔板Al孔中(提前在A1-A12孔中加IOOul培养液)，做倍比稀 释，选择约100个/孔的孔内细胞于6ml培养液中混勻(100个/6ml)；将此细胞混合 液以IOOul/孔(即1.7个/孔)加入新的96孔板中(总共加A-C排，共36孔)；在剩 余的细胞液中补加2.4ml培养液，混勻，将此细胞培养液以IOOul/孔(即0.8个/孔)加 入新的96孔板中(总共加D-F排，共36孔)；在剩余的细胞液中补加1.2ml培养液，混 勻，将此细胞培养液以IOOul/孔(即0.5个/孔)加入新的96孔板中(总共加G-H排， 共对孔)；培养7-10天，观察，取单个克隆生长的阳性孔再重复以上操作进行亚克隆。
1.4 McAb的腹水制备和效价测定选用12周龄BALB/c经产母鼠数只，每只腹腔注射灭菌的降植烷0.3mL，8天后腹腔 注射培养至对数生长期的杂交瘤细胞，5.8X105细胞/只。5天后开始观察小鼠腹水的生 成情况，待小鼠腹部膨胀到一定程度时收集腹水，4000rpm离心15η ι以去除细胞碎片等 杂质，取上清用间接ELISA测定效价；用饱和(NH4)2SO4盐析法纯化McAb，核酸蛋白 仪测含量。
1.5 McAb 鉴定1.5.1 McAb的稳定性检测将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞体外连续传20代后，用间接ELISA法测定杂交瘤细 胞分泌单克隆抗体的稳定性。
1.5.2 Western-boltting参照《分子克隆实验指南》方法，将原核表达产物E2蛋白(BVDV-I)、真核表达 产物 E2s-C3d(BVDV_2)、E2s (BVDV-I)、病毒株 890、NADL> 分离株 XJ-04 分别与 5X上样缓冲液混合，煮沸ΙΟη ι;同时设MDBK细胞作为阴性对照，进行SDS-PAGE ； 将电泳条带进行蛋白质印迹反应，用Bio-Rad转印系统，以350mA湿法转印90η ι，将 蛋白条带转印至硝酸纤维素(NC)膜上；进行抗原抗体反应，一抗为1:1000稀释的小鼠 腹水，二抗为1:2000稀释的羊抗鼠^G-HRP, 二氨基联苯二胺(DAB)系统显色。
1.6 McAb的生物素标记及效价的测定根据 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin Reagents 说明书进行单克隆抗体的 Biotin 标 记，具体步骤如下以所用biotin与纯化腹水IgG的摩尔比值为20 : 1，计算所需biotin 用量。2.0mg biotin溶于300ul超纯水中，计算所需biotin的体积；将所需biotin溶液体 积加入纯化腹水溶液中，37°C作用0.5h ； 40C PBS过夜透析除去未反应的biotin，间接 ELISA检测标记效果。
2实验结果 2.1电镜观察结果890病毒感染细胞培养物经PEG浓缩、蔗糖垫底超速离心提纯后磷酸钨负染电镜观 察，可见有囊膜、直径约为60nm的圆形病毒粒子。
2.2检测抗原的制备经浸提纯化的BE2蛋白，进一步SDS-PAGE可见43KDa处出现清晰的单一条带， 符合预期大小，可用于单克隆抗体的检测。纯化的蛋白用核酸蛋白检测仪测得浓度为 1.5mg/ml。
2.3 McAb的制备及相关特性SP2/0细胞与免疫BALB/c小鼠脾细胞融合后待细胞长至肉眼可见细胞集落、上清 变为橙黄色时可取上清原液进行抗体检测。挑选经间接ELISA检测两次结果为阳性， OD490值>1.0且一直比较稳定的杂交瘤细胞进行亚克隆，三次亚克隆后获得稳定分泌抗 体的杂交瘤细胞一株，命名为3F9 (由发明人所在的扬州大学畜禽病原微生物学研究室保 存，自申请日起向公众提供20年)，抗体分子类为IgG。
间接ELISA测得单抗3F9腹水的ELISA滴度为1 29X 100。以饱和(NH4)2S04 盐析法纯化腹水，核酸蛋白检测仪测得^G浓度为2mg/ml。
将所获得的杂交瘤细胞株3F9连续传代，细胞生长良好，反复冻存与复苏后， 仍能稳定地分泌单克隆抗体。
病毒株890、NADL, XJ-04分别与杂交瘤细胞株3F9所分泌的单克隆抗体进行 Western-blotting,结果显示在约53KDa处形成一条特异性的目的条带，说明病毒株890、 NADL, XJ-04能与该单抗发生特异性反应。
2.4 IgG 的 biotin 标记在单克隆体抗体3F9腹水纯化物(2mg/ml) Iml中加入水溶性的biotin溶 液(2.0mg biotin溶于300ul超纯水)，反应产物透析后用间接ELISA测得标记效价可达 216。
实施例3 双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法的建立 1实验方法1.1双抗夹心ELISA方法的建立具体操作步骤如下包被液稀释纯化的腹水3D8至l-20ug/ml，以IOOul/孔加入 酶标板孔中，37°C作用Zh后置4°C过夜，弃去孔内的液体，PBST洗涤3次，每次5η ι， 拍干；每孔加150ul封闭液37°C封闭2h，PBST同前洗涤，此时包被板可_20°C保存备 用；每孔加IOOul待检样品(E2蛋白)，同时设立阴性对照和空白对照，37°C孵育lh， 洗涤拍干；加 biotin_3F9，1 OOul/孔，37°C孵育 lh，洗涤拍干；加 Streptavidin-HRP， IOOul/孔，37°C作用10-20η ι，以2mol/L H2SO4终止反应，50ul/孔，在酶联免疫阅读 仪上读取OD49tl值。
方阵滴定法确定最佳mAb包被量、biotin-mAb的工作浓度，此方法可检测的最 低待检样品量。
1.2双抗体夹心ELISA方法特异性的检测将收获的 890、XJ-04 (分离株 BVDV-2)、NADL (BVDV-I)、BHV-U BRV 病 毒反复冻融三次后，经3000rpm离心IOmin后收集上清用于双抗体夹心ELISA检测。同 时设阳性、阴性、空白对照。
1.3双抗体夹心ELISA方法临界值的确定建立的双抗体夹心ELISA方法检测10份假定无BVDV感染的牛血清，计算其平均 值(mean)与标准差(SD)，以检测血清的OD49(femean+;3SD定为阴、阳性血清临界 值，当待测样本的OD4902该临界值时，可判其为阳性。
2实验结果2.1双抗夹心ELISA方法的建立方阵法和多次实验结果显示双抗体夹心ELISA方法中3D8的最佳包被浓度为2ug/ ml, biotin_3F9最佳工作浓度为60ng/ml，E2最低检出量为84ng/ml。
双抗体夹心ELISA方法的特异性建立的双抗体夹心ELISA检测方法能检测出890、XJ-04 (BVDV-2)、NADL (BVDV-I)，而对猪瘟病毒(CSFV)、1型牛疱疹病毒(BHV-I)、牛轮状病毒 (BRV)均显阴性；该结果表明所建立的检测方法具有良好的特异性。
双抗体夹心ELISA方法临界值的确定用建立的双抗体夹心ELISA方法检测10份假定无BVDV感染的牛血清，其OD490 值中最小值为0.112，最大值为0.346，标准差为0.049，经计算得出OD490平均值+!3SD 为0.322，即当检测血清的OD490>0.322时判为阳性。
举例如下ELISA检测试剂盒包括包被BVDV单抗3D8的酶标板、biotin标记的BVDV单抗 3F9，Streptavidin-HRP,洗涤液，显色液、终止液，阳性对照，阴性对照。
上述试剂盒的使用35份来自江苏、山东、河南奶牛场疑似BVDV感染病牛血，进行分离血清，同时用 RT-PCR和本发明的双抗夹心ELISA方法进行检测。
经RT-PCR检测(BVDV 5，-UTR保守片段的PCR扩增)，结果检出11份为阳 性；用本发明的双抗夹心ELISA检测，检出13份阳性样品，其检测结果与RT-PCR的符 合率达94. %，预示着这两种方法有着很大的应用价值，可作为BVDV的特异性诊断， 但简单和快捷的特性使ELISA成为基层应用和大批样品检测的优选方法。
本发明的保护范围并不仅仅局限于本实施例的描述。
权利要求
1.一种牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒包括用于ELISA 检测的洗涤液、显色液、终止液，Streptavidin-HRP、阳性对照，阴性对照，其特征在 于还有包被牛病毒性腹泻病毒单抗3D8的酶标板、生物素标记的牛病毒性腹泻病毒单抗 3F9。
2.权利要求1所述的ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤(1)包被用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释纯化的单克隆抗体3D8至l-20ug/ml，按 IOOul/孔加于聚苯乙烯微孔板中，37°C放置2h，然后转移至4°C，放置过夜；洗涤，甩 干；(2)封闭含10%小牛血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，150ul/孔，37°C孵育2h, 洗涤，拍干；(3)加待检样品IOOul/孔，37°C孵育Ih;洗涤，拍干；(4)加生物素标记的二抗每孔加IOOulbiotin_3F9，37°C孵育lh,洗涤，拍干；(5)加亲和素按IOOul/孔，加&"eptavidin-HRP，37°C孵育 10_20min ；洗涤，拍干；(6)终止每孔加50ul2mol/LH2SO4,终止反应；(7)在酶联免疫阅读仪上读取OD49tl值与阳性对照和阳性对照比对。
全文摘要
本发明涉及牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。该试剂盒包括用于ELISA检测的洗涤液、显色液、终止液，Streptavidin-HRP、阳性对照，阴性对照，其特征在于还有包被牛病毒性腹泻病毒单抗3D8的酶标板、生物素标记的牛病毒性腹泻病毒单抗3F9。用该试剂盒进行检测无交叉反应；可避免因体内抗体滴度低而出现漏检现象；特异性高，使用生物素-亲和素增敏剂，起放大作用，灵敏度增高，提高检出率，同时减少了二抗的用量，适于推广使用。
文档编号G01N33/577GK102023217SQ20101056845
公开日2011年4月20日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者吴圣龙, 姚丰华, 孟祥升, 朱军, 朱国强, 朱晓芳, 朱礼倩, 林燕清, 王建业, 舒燕, 蒋颖, 陶洁 申请人:扬州大学