专利名称：基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法
技术领域：
本发明涉及一种基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、制作及使用方法，属于 生物分析技术领域。
背景技术：
汞是高毒的全球性环境污染物，尤其是其具有高迁移性、持久性、甲基化作用性、 生物富集性及食物链放大性的特点，即便是极微量的存在于环境中，对动植物及人类的健 康也是极大的威胁。全世界的汞一年的排放量约1. 5万吨，主要来源于汞矿、冶金、氯碱工 业、电器工业和矿物燃料的燃烧。汞以多种形式存在与环境中，水溶性的二价汞离子(Hg2+) 是汞污染最常见和最稳定的形式之一。
如何有效地进行环境中汞离子含量的测定，成为摆在广大分析工作者面前的一个 问题。目前传统的汞离子检测方法主要有原子(吸收，发射，荧光)光谱法及电感耦合等 离子质谱仪(Inductively coupled plasma mass spectrometry, I CP-MS)。虽然这些方法 能够得到比较精确的检测结果，但这些技术依赖大型仪器设备、耗费耗时、需进行样品预处 理，需要专门的技术人员进行操作，检测成本高，很难满足产地现场快速检测的要求，并且 其中有些方法还需要用到有毒试剂，难以被分析人员接受。因此，在很多重要的场合，人们 迫切需要简便、快速、经济、准确的分析检测汞离子的方法。目前，国内外对汞离子进行现场 检测的方法在灵敏度和专一性上不能够满足要求。
近来的研究表明，一个汞离子能特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形 成稳定的T-Hg2+-T结构。基于汞离子的这一特殊的性质，已发展了各种Hg2+检测方法如 荧光法(A. Ono, H. Togashi, Angew. Chem. Iht. Ed. Engl. 2004，43，4300.)、纳米金聚集比色 法(J. S. Lee, M. S. Han, C. A. Mirkin, Angew. Chem. Iht. Ed. Engl. 2007，46，4093.)，电化学 法(Z. Zhu, Y. Su, J. Li, D. Li, J. Zhang, S. Song, Y. Zhao, G. Li, C. Fan, Anal. Chem. 2009,81, 7660.)。这些方法普遍具有选择性好、特异性强等特点，但操作繁琐，并不适合高通量的检 测。
生物芯片是本世纪八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术， 它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统， 以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他物质的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的主要特 点是高通量、微型化和自动化，能够实现对微量样品快速、准确的检测。
本发明的发明人设想如能将上述汞离子的特异性地与两个胸腺嘧啶碱基(T)共 价结合形成稳定的T-Hg2+-T结构的这一特性以及生物芯片的优点结合起来，提供一种基于 寡核苷酸链的Hg2+检测芯片，以实现对Hg2+低成本、高灵敏、准确、快速的检测。从而引导出 本发明的构思。发明内容
本发明的目的在于提供一种寡核苷酸链的汞离子检测芯片。本发明所述的汞离子检测芯片的特征在于利用Hg2+可特异性地与DNA的两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合，介 导T-T配对形成稳定的T-Hg2+-T结构。具体的说，将合成的富T寡核苷酸链固定在经修饰 的玻片上；然后荧光标记的互补链与固定在玻片上的富T寡核苷酸链杂交，形成双链结构， 制备好Hg2+检测芯片；再加入待测样品，检测荧光信号。若待测样品中含Hg2+时，则Hg2+能 特异性地与富T寡核苷酸链上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链上的T-T配对 形成稳定的分子间T-Hg2+-T结构，从而诱导带有荧光基团的互补链的释放，导致芯片斑点 处荧光减弱。汞离子存在与否，可通过荧光扫描仪定量分析。
本发明的基于寡核苷酸链的Hg2+检测芯片的利记博彩app及其应用方法，其特征在 于
本发明中Hg2+检测芯片的利记博彩app包括如下步骤
(1)化学修饰的富T寡核苷酸链固定在化学修饰的玻片上
2-20 μ M化学修饰的富T寡核苷酸链按1 1(V/V)的比例加入2Χ点样缓冲液。 通过以接触式Cartesian microarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片。点样完毕，将玻 片置于一定湿度，比如70%湿度、室温条件下48 72h进行固定。分别用0. 2% SDS、去离 子水洗2次，每次2min，然后用醛基封闭液(0. Ig硼氢化钠，30mL PBS, IOmL 99%乙醇)封 闭15min。再依次用0.2% SDS、去离子水各洗2次，每次aiiin，吹干，备用。
(2)互补链与富T寡核苷酸链的杂交
标记了荧光基团的互补链用杂交液稀释成1-10 μ M。将稀释好的互补链溶液加在 芯片的斑点处，盖上盖玻片。芯片置于25°C湿盒中，12-16小时后，用IOmM M0PS[(3_(N_吗 啉代)丙磺酸],IOOmM NaNO3, pH 7. 2洗5_10min，吹干，备用。
所述的Hg2+检测芯片的使用方法包括如下步骤
用杂交液稀释制备好不同浓度的Hg2+，加不同浓度的Hg2+溶液于芯片斑点处，室 温，反应 10_60min。IOmM MOPS, IOOmM NaNO3, pH 7· 2 洗 3 次，吹干。用 General Scanning 公司的芯片信号分析系统kanarray 3000扫描并分析结果。
综上所述，本发明利用了在Hg2+存在的情况下，Hg2+能特异性地与富T寡核苷酸链 上的τ碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链上的T-T配对形成稳定的分子间T-Hg2+-T结 构，从而诱导已经与富T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。如果互补链预先标记荧光基团， 释放使荧光信号降低。汞离子荧光检测芯片的制备包括三个步骤首先设计相应的化学修 饰的富T寡核苷酸链和荧光修饰的互补链，然后将末端修饰的富T寡核苷酸链固定在经修 饰的玻片上，最后将荧光标记的互补链与玻片上的富T寡核苷酸链杂交，制备好汞离子检 测芯片。使用上述芯片进行汞离子的检测只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时 间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析。通过荧光信号的变化， 实现对的Hg2+检测。样品中Hg2+浓度越高，荧光信号减弱的越多。该方法可以检测的Hg2+ 的浓度范围是ΙηΜ-100 μ M。该汞离子检测芯片也可以使用其它各种各样的信号标记，比如 放射性标记、量子点、酶或纳米金等。
本发明的技术效果
1、本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测芯片的利记博彩app简单、易行。
2、本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测芯片具有检测灵敏度和专一性高。
3、应用本发明基于寡核苷酸链的Hg2+检测芯片检测Hg2+时，样品、试剂消耗量少，4成本低。
4、使用本发明的检测的结果用普通的扫描仪扫描观察及分析即可，不需要复杂的 昂贵设备，使现场检测更方便、易行。
图1是芯片上基于寡核苷酸链荧光检测汞离子的原理图。
图2(A)-图2(G)，是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链荧光检测汞离子的时 间动力学。荧光扫描照片中荧光强度平均指依次是反应anin时(A)，缓冲液组61356， 10 μ M Hg2+ 组 33296,100 μ M Hg2+ 组 22273。反应 5min 时(B)，缓冲液组 59859，10 μ M Hg2+ 组 28697，100 μ M Hg2+组 15833。反应 IOmin 时(C)，缓冲液组 60761，10 μ M Hg2+组 18440， 100 μ MHg2+组 10121。反应 20min 时(D)，缓冲液组 662187，10 μ M Hg2+组 12726，100 μ M Hg2+ 组 6755。反应 40min 时(E)，缓冲液组 59893，10 μ M Hg2+ 组 9441，100 μ M Hg2+ 组 5369。反 应 60min 时(F)，缓冲液组 61789，10 μ M Hg2+组 7882，100 μ M Hg2+组 3612。G 为制备好的 100 μ M Hg2+(曲线1)和10 μ MHg2+(曲线2)荧光强度随时间曲线减弱。
图3(A)-图3(B)，是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链荧光检测的检测芯片检 测Hg2+的荧光扫描照片(A)及标准曲线(B)。荧光扫描照片中荧光强度平均指依次是缓 冲液组 61789，IOnM Hg2+组 49411，IOOnM Hg2+组 35127，1 μ M Hg2+组 20666，10 μ M Hg2+组 7882，100 μ M Hg2+组 3612。
图4(A)-图4(B)，发明一个实施例中基于寡核苷酸链荧光检测的检测芯片检测 Hg2+和其他二价离子的荧光扫描照片及结果。荧光扫描照片中荧光强度平均指依次是缓 冲液组 60961，Hg2+ 组 8996，Pb2+ 组 59408，Zn2+ 组 59753，Ca2+ 组 59945，Cu2+ 组 59630，Ni2+ 组 59370，Mg2+组 60433。
图5(A)-图5(C)，是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链荧光检测的检测芯片检 测相同浓度的标准缓冲液中Hg2+和饮用水中掺入的Hg2+荧光扫描照片及结果。
具体实施方式
下面，通过实施例的描述，进一步阐明本发明的实质性特点和显著的进步。为清楚 起见，先将本发明使用的核酸探针的序列列于表1
表1 本发明中使用的核酸探针序列。
权利要求
1.一种汞离子荧光检测芯片，其特征在于所述的检测芯片基于寡核苷酸链，利用Hg2+ 特异性地与DNA的两个胸腺嘧啶碱T共价结合，介导T-T配对形成稳定的T-Hg2+-T结构。
2.制作如权利要求1所述的检测芯片的方法，其特征在于将合成的富T寡核苷酸链固 定在经修饰的玻片上；然后荧光标记的互补链与固定在玻片上的富T寡核苷酸链杂交，形 成双链结构。
3.按权利要求2所述的利记博彩app，其特征在于所述的方法包括以下步骤(1)化学修饰的富T寡核苷酸链固定在化学修饰的玻片上2-20 μ M化学修饰的富T寡核苷酸链按1 1体积比加入2Χ点样缓冲液，通过以接触 式Cartesian microarray制作系统点阵于化学修饰的载玻片表面；点样完毕，将玻片置于 70%湿度，室温条件下48 7 进行固定；分别用0. 2% SDS、去离子水洗2次，每次2min， 然后用醛基封闭液封闭15min ；再依次用0. 2% SDS、去离子水各洗2次，每次2min，吹干；(2)互补链与富T寡核苷酸链的杂交标记了荧光基团的互补链用杂交液稀释成1-10 μ M。将稀释好的互补链溶液加在芯片 的斑点处，盖上盖玻片。芯片置于25°C湿盒中，12-16h后用IOmM MOPS, IOOmM NaNO3,pH 7.2 洗5-10min，吹干。
4.按权利要求3所述的利记博彩app，其特征在于步骤(1)中所述的封闭液是由0.Ig硼氢 化钠、30mlPB S和IOml质量百分数为99%的乙醇组成。
5.使用如权利要求1所述的芯片的方法，其特征在于用杂交液稀释制备好不同浓度的 Hg2+，加不同浓度的Hg2+溶液于芯片斑点处，室温，反应10-60min ；用IOmM NaNO3, pH7. 2洗 3次，吹干；然后用General Scanning公司的芯片信号分析系统kanarray 3000扫描并分 析结果。
6.按权利要求5所述的使用方法，其特征在于①加入100μ M、10 μ M的Hg2+后反应2min，相对于缓冲液对照组，荧光强度分别下降了 63%,45% ；20min 完成了 95%的反应；②在Hg2+离子存在的情况下，芯片斑点处荧光强度减弱，当Hg2+浓度为IOnM时，与缓冲 液组的荧光强度相比，斑点处荧光强度减弱20%，随着Hg2+浓度增加，荧光信号逐渐减弱。
7.按权利要求5所述的使用方法，其特征在于用IOmMMOPS, IOOmM NaNO3, pH 7. 2稀释 制备ΙΟμΜ的不同的二价金属离子，加不同二价金属离子溶液于制备好的芯片斑点处，室 温，反应 Ih ；用 IOmM MOPS, IOOmM NaNO3, pH 7. 2 缓冲液洗 3 次，吹干；用 General Scanning 公司的芯片信号分析系统kanarray 3000扫描照片；只有在Hg2+存在的情况下，芯片斑点 处荧光强度大大减弱，Hg2+为ΙΟμΜ时，与缓冲液组的荧光强度相比，荧光强度减弱了 85%; 而当加入10 μ M其他二价金属离子，荧光强度只有在0.9% 2. 6%范围的微小的减弱。
8.按权利要求5所述的使用方法，其特征在于所述的芯片检测Hg2+的检测极限为InM， 检测的范围为ΙηΜ-10 μ M。
9.按权利要求1所述的荧光检测芯片的应用，其特征在于所述的检测芯片用于检测掺 入在饮用水中的Hg2+。
全文摘要
本发明涉及一种基于寡核苷酸链的汞离子荧光检测芯片、利记博彩app及其使用方法。所述的检测芯片由Hg2+能特异性地与富T寡核苷酸链上的T碱基共价结合，介导两条富T寡核苷酸链上的T-T配对形成稳定的分子间T-Hg2+-T结构，从而诱导已经与富T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。检测芯片使用时只需要将待测样品添加到芯片上，并保持一段时间，然后利用芯片信号分析系统扫描芯片，并对荧光信号进行分析。通过荧光信号的变化，实现对的Hg2+检测。样品中Hg2+浓度越高，荧光信号减弱的越多。该方法可以检测的Hg2+的浓度范围是1nM-100μM。
文档编号G01N21/64GK102031306SQ201010533018
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者刘美英, 娄新徽, 赵建龙 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所