专利名称：一种新型生物条形码检测方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域中的检测方法及其应用，特别是涉及一种新型的简易生 物条形码检测方法及其在生物检测中的应用。
背景技术：
生物条形码检测技术(bio-bar codes assay, BCA)是美国西北大学Mirkin 教授领导的课题组于2003年首次报道的一种新型标记免疫测定技术，其突出特点 是具有极高的灵敏度，可达常规ELISA方法的IO6倍(Nam JM, Thaxton CS, Mirkin CA.Nano—particle—based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science,2003，301(5641) 1884-1886)。BCA技术的基本原理是利用被检物单抗标记的磁性微球探针(magnetic micropar-ticles, MMPs)和被检物多抗及特异DNA双链标记的金纳米颗粒探针 (nanoparticle,NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP探针上 标记的特异DNA链释放出来，再通过常规PCR方法或芯片检测方法(金标银染法)鉴定这 些释放的DNA链就可确定被检物的存在。BCA技术中，NP探针标记有双链DNA (48bp)和病原的多克隆抗体，双链DNA的 其中一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码 DNA,每一个直径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(Hurst SJ, Lytton-Jean AR,Mirkin CA. Maximizing DNA loading on a range of gold nanoparticle sizes. Anal Chem, 2006，78 =8313-8318) ；MMP探针是对应于分选磁场的直径约为1 μ m的磁 珠微球，其表面上包被有抗病原的单克隆抗体。BCA技术通过抗原抗体高度特异性反应捕获 抗原，再通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于双链DNA标记的一次放大以 及PCR反应和芯片检测的二次放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。迄今为止，BCA技术已在某些病原标志物的检测上取得了很好的进展。Nam等 人首先利用BCA技术对前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)进行了 检测，检测下限可达3amol/L，比传统ELISA方法低6个数量级(Nam JM, Thaxton CS, Mirkin CA. Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science, 2003, 301 (5641) : 1884-1886)。Georganopoulou 等人利用 BCA 技术对 β-淀粉样蛋白源性播散性配基(amyloid β -derived diffusible ligands，ADDL)进行 了检测，能在15 μ 1脑脊液中检测至Ij 50个ADDL分子(Georganopoulou DG, Chang L，Nam JM, et al. Nano-particle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzh-eimer' s disease. Proc Natl Acad Sci,2005,102 (7) 2273-2276)。Stoeva等人利用BCA技术对血清中的三种肿瘤标志物PSA、人体绒毛膜促 性腺激素(human chorionic gona-dotropin, HCG)禾口 α 月台JL球蛋白(α -fetoprotein, AFP)进行 了联合检测，检测限度可达 170f mol/L(Stoeva Si，Lee JS, Smith JE, et al.Multiplexed detection of protein can—cer markers with biobarcodednanoparticle probes. Am Chem Soc,2006,128(26) :8378_8379)。综上所述，BCA技术与现代标记免疫检测技术的金标准-ELISA技术相比，具有非 常显著的优点，具体表现在以下几个方面(I)BCA技术显示了比常规的ELISA方法高出六 个数量级(100万倍)的敏感性；(2)针对不同的被检物设计不同长度和序列的条形码DNA， 可分析复杂样本中的多种物质；(3)具有较高的特异性，其特异性决定于检测系统使用的 单克隆抗体的特异性，只要使用高特异的抗目标检物的单克隆抗体就能保证检测系统的高 特异性；(4)检测范围广，只要被检物具有单抗和多抗，就可对其进行检测，这使得它在检 测一些不适宜用PCR技术检测的微量物质方面具有很大的优势。但是，从BCA技术检测的过程和显示体系可以看出，这种技术存在着明显的缺陷。 在PCR反应中，由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应，最终导致PCR 反应不再以指数形式进行而进入“平台期”，一些反应的终产物比另一些要多，因此终点PCR 反应方法定量不准确；其次，终点PCR容易交叉污染，产生假阳性。传统BCA技术标记的DNA 为双链，长度为48bp左右，不仅操作繁琐、检测过程冗长，而且也间接影响到检测灵敏度， 此外还不适宜于进行基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测，不能对样品模板进行精确 定量分析。条形码DNA的芯片检测由于银染试剂自身的缺点而易产生假阳性，阴阳性不易 界定，染色结果因时间、环境因素变化很大。
发明内容
本发明提供了一种用于病原抗原高灵敏度检测的生物条形码(BCA)检测方法。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种生物条形码检测方法，是在 普通生物条形码检测方法的基础上，将标记的条形码DNA链改进为单链，并将其长度延长 为适于进行荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，三明治反应复合物中条形码DNA链 不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法或普通PCR方法对三明治 反应复合物中条形码DNA链进行定性、定量检测的生物条形码检测方法。具体来讲，所述生物条形码检测方法可包括以下步骤(I)NP探针的制备设计适用荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的条形码DNA单 链，然后利用金纳米颗粒、抗待测物的多克隆抗体和条形码DNA单链制备NP探针；(2)MMP探针的制备用磁性微球和抗待测物的单克隆抗体制备MMP探针；(3)条形码DNA检测利用NP探针、MMP探针和待测物通过抗原、抗体作用制备三 明治复合物，然后将复合物上标记的条形码DNA链直接进行基于TaqMan荧光探针的实时荧 光定量PCR检测或普通PCR检测，以对待测物进行定性、定量检测。在上述生物条形码检测方法中，所述步骤(1)中的金纳米颗粒直径可为10 40nm，优选为15nm ；优选的用于生物条形码检测的单链条形码DNA链可具有序列表中SEQ IDNo 1的核苷酸序列。所述步骤(2)中磁性微球的直径可为0. 5 3 μ m，优选为2. 8 μ m。所述步骤(3)中优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对 的上游引物具有序列表中SEQ ID No :2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQID No 3 的核苷酸序列，TaqMan荧光探针具有序列表中SEQ ID No 4的核苷酸序列。为获得更好的检测效果，所述步骤(1)和步骤(2)中还包括对NP探针和MMP探针
4进行纯化的步骤。所述新型生物条形码检测方法的检测范围较广阔，对病毒、细菌、毒素(如蓖麻毒 素)、生物战剂、类固醇、脂类、维生素、肿瘤特异性标志物等均可进行检测。当待测物为蓖麻毒素时，可用蓖麻毒素蛋白作为检测对象进行生物条形码检测。 所述检测方法中使用的MMP探针标记有抗蓖麻毒素蛋白的单克隆抗体，NP探针标记有抗蓖 麻毒素蛋白的多克隆抗体。当待测物为蓝舍病病毒时，可用VP7蛋白作为检测对象进行生 物条形码检测。所述检测方法中使用的MMP探针标记有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针标 记有抗VP7蛋白的多克隆抗体。依此类推，针对不同的检测物，只需要改变检测目标蛋白， 在检测方法中对应调整目标蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，这些单克隆抗体和多克隆抗 体均可采用生物技术领域中的常规方法制备，也可从公司直接购买。本发明的第二个目的是提供一种生物条形码检测试剂盒。本发明所提供的试剂盒包括包被有抗待测物单克隆抗体的MMP探针，包被有抗待 测物多克隆抗体和条形码单链DNA链的NP探针，以及用于实时荧光定量PCR检测的引物和 TaqMan荧光探针。在上述试剂盒中，优选的与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No: 1的核苷酸序列；优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游 引物具有序列表中SEQ ID No 2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No 3的核 苷酸序列；优选的用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan荧光探针具有 序列表中SEQ ID No 4的核苷酸序列。本发明在传统生物条形码检测方法基础上，对标记的条形码DNA链进行了创新， 并引进基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR对标记DNA进行检测，不仅简化了检测步 骤，还可对标记DNA进行直接定性、定量检测。本发明与常规的生物条形码检测方法相比， 本发明的BCA检测方法采用长片段、单链条形码DNA链制备NP探针，可直接对反应复合物 上的条形码DNA链进行检测，不用预先解离，降低了检测成本，并大大简化了检测程序；此 外，利用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法对条形码DNA链进行检测，可对被 检物进行精确定量，并且消除了常规生物条形码检测方法的阴阳性界限不清等问题，具有 准确度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点。本发明对于各种目标蛋白的 高灵敏度检测具有较大的实际意义，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图(蓖麻毒素)图2为条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线图(蓖麻毒素)图3为条形码DNA链的常规PCR检测扩增产物电泳图(蓖麻毒素)图4 条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图(BTV VP7蛋白)图5为条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线图(BTV VP7蛋白)图6为条形码DNA链的常规PCR检测扩增产物电泳图(BTV VP7蛋白)
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物、条形码DNA链和 TaqMan荧光探针均由TaKaRa公司合成；纳米金颗粒购自Ted pella公司；磁性微球颗粒购自 Invitrogen公司；蓖麻毒素蛋白、抗蓖麻毒素蛋白多克隆抗体和抗蓖麻毒素蛋白单克隆抗体 均购自诺维森生物科技有限公司；其他目标蛋白及其多克隆抗体和单克隆抗体也均可商购。实施例1、蓖麻毒素的新型生物条形码(BCA)检测本实施例以对蓖麻毒素蛋白进行定性、定量检测为例，说明本发明的新型BCA检 测方法如何实施，具体包括以下步骤(I)NP探针的制备条形码DNA链合成设计并合成用于本发明中NP探针制备的条形码DNA链，其序 列为5，-GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG TGA AAT AGC CAG TTC TCG TGG CAT TTGCGT MT CCT GAT GTA TCG CTC GGT GGT TGC CAA CTA GAG AAC-3’(序列表中 SEQ IDNo :1)。NP探针制备取10. 5 μ g待检病原的多抗(购自诺维森生物科技有限公司)加入 到100 μ L纳米金(15nm，10 40nm均可)溶液里混合均勻，之后用0. IM NaOH调节pH值 至9. 5 ；室温下振荡30min ；加入20 μ L 100 μ M的单链DNA链，10°C下孵育16h，使溶液中的 纳米金粒子和抗体、DNA能充分作用；加入585yL 10%的BSA室温孵育30min ；4°C、13000g 离心20min，去除上清；之后用0. IM NaCl作为稳定剂，边加边混勻，使稳定剂的终浓度为 0. 1M，静置7 IOh以上，重悬沉淀，定溶至原来的体积。4 8°C保存。(2) MMP探针制备缓冲液(Buffer)A6. 18g H3BO3 (MW 61. 83)添加到 800mL 蒸馏水中，用 5M NaOH调 节pH值到9. 5，使用蒸馏水定溶至1L。缓冲液B:2. 62g NaH2PO4 H2O (MW137. 99)、14. 42g Na2HPO4 2H20 (MW 177. 99)用蒸 馏水定溶到lL，pH值为7.4。缓冲液C 在缓冲液A或缓冲液B中溶解39. 64g (NH4) 2S04,用NaOH或者HCl调节 PH值至9. 5或7. 4，最后用缓冲液A或缓冲液B定溶至100mL。缓冲液D0. 88g NaCl (MW 58. 4)、0· 5% (w/v)BSA to 80mL0. OlM PBS (pH 7. 4)，充 分混勻后定溶至lOOmL，用0. OlM PBS (pH 7. 4)调节pH 7. 4。缓冲液E 0. 88g NaCl (MW 58. 4)、0· 1% (w/v) BSA 到 80mL 0. OlM PBS (pH 7. 4)充 分混勻后用0. OlM PBS (pH 7. 4)定溶至IOOmL0把66 μ L 磁珠(直径为 2·8μπι，0·5 3μπι均可，2X109beads/mL)移入 EP 管后 置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清和除去磁场；加入ImL Buffer A或BufTerB重 悬磁珠，反复吹打；重新置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清；除去磁场；之后加入 40 μ L待检病原的单抗(购自诺维森生物科技有限公司)和20 μ L的Buffer Α,反复涡旋； 加入40 μ L Buffer C之后涡旋振荡，37°C孵育12 18h ；重新置入磁场，使磁珠沉淀，去除 上清；除去磁场；加入ImL Buffer D 37°C孵育Ih ；再次置入磁场，使磁珠再次完全沉淀，去 除上清和磁场；加入ImL Buffer Ej^m 5 IOsec ；置入磁场，使磁珠完全沉淀，去除上清 和除去磁场；之后重复用ImL Buffer E洗涤；最后用96 μ L的Buffer E重悬磁珠，使磁珠溶液浓度为20mg/mL。4 8°C保存。(3)蓖麻毒素新型BCA检测中三明治检测复合物的形成将15 μ L MMP (20mg/mL)加入30 μ L蓖麻毒素蛋白(100fg/mL)中，37°C剧烈振荡 Ih ；加入磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连接的蓖麻毒素蛋白和其它杂质； 加入45 μ L NP探针，剧烈振荡30min ；加入磁场，用500 μ LPBS反复冲洗4次，除去未连接 的NP探针。反复冲洗后用50 μ L超纯水溶解。得到MMP-蓖麻毒素蛋白-NP三明治结构， 复合物中的条形码DNA链可用于下一步的定性、定量检测。(4)条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测对步骤(3)中的条形码DNA链进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检 测。25 μ 1反应体系为2XPCR缓冲液12. 5μ 1，上游引物1 μ 1 (50mM)，下游引物 1 μ 1 (50mM)，TaqMan 荧光探针 1 μ 1 (25mM)，三明治复合物样品 2 μ 1，ddH20 7. 5 μ 1。反应条件为95°C 10s,95°C 5s，52°C 20s，共45个循环，每一循环退火结束时收
集FAM荧光信号。上游引物5，-GTTCTC TAG TTG GCA ACC ACC-3，(序列表中 SEQ ID No 2)下游引物5，-GTGACT GCA AGT CCA TTG AGG-3，(序列表中 SEQ ID No 3)TaciMan 荧光探针5，-FAM-AGT TCT CGT GGC ATT TGC GTA ATC C TAMRA-3，(序 列表中 SEQ ID No 4)条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图如图1所示(曲线a、b、c、d、e和 f 分别为 102fg/mL、lO'fg/mL, 10°fg/mL、lO—fg/mL、l(T2fg/mL 和 l(T3fg/mL，曲线 g 为阴性 对照。)，条形码DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线如图2所示(标准曲线方程为y = 45. 02-3. 35x)，上述检测结果表明本检测的蓖麻毒素蛋白检测灵敏度可达10_2fg/mL。(5)条形码DNA链的常规PCR检测对步骤(3)中的条形码DNA链进行常规PCR检测。25 μ 1 PCR反应体系为2 XPCR 缓冲液12. 5 μ 1，上游引物1 μ 1 (50mM)，下游引物1 μ 1 (50mM)，三明治结构2 μ 1，ddH20 8. 5μ 1。PCR 反应条件为95°C 10s，95°C 5s, 52°C 20s, 72°C 20s，共 35 个循环；最后 72°C 7min，4°C终止反应。反应结束后，取PCR扩增产物各10 μ 1进行3%琼脂糖凝胶电泳检测 (100V 电泳 40min)。上游引物5，-GTTCTC TAG TTG GCA ACC ACC-3'(序列表中 SEQ ID No 2)下游引物5，-GTGACT GCA AGT CCA TTG AGG-3'(序列表中 SEQ ID No 3)常 规PCR检测结果如图3所示(泳道M为DL2000 DNA Marker,泳道a g分别为102fg/mL、 lO^g/mL, 10°fg/mL、lO^fg/mL, 10_2fg/mL、10^fg/mL和阴性对照。)，检测结果表明本检测蓖 麻毒素蛋白检测灵敏度可达10_2fg/mL。实施例2、蓝舌病病毒(BTV)的新型生物条形码(BCA)检测用本发明的新型BCA检测方法对蓝舌病病毒BTV VP7蛋白进行定性、定量检测，具 体方法包括以下步骤(I)NP探针的制备抗BTV VP7蛋白的多克隆抗体的制备利用蓝舌病病毒免疫新西兰大白兔制备抗 VP7蛋白的多克隆抗体，具体方法包括以下每只雄性新西兰大白兔免疫前，都由耳缘静脉取血2mL，静置分离血清，-20°C保存，以待作为阴性对照用；免疫方案首次免疫，每只家兔 注射2mL的乳化抗原，于足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、领下、耳后等处皮下多点注射， 对照兔子注射等量生理盐水，2周后以同样的剂量(含等体积弗氏不完全佐剂)加强免疫， 背部多点注射，2周后再次加强免疫，10天后进行第3次加强免疫，约10天以后进行末次免 疫，直接用2mL乳化抗原静脉注射。每次加强免疫后7-10天从兔耳缘静脉采血2-3mL，用间 接ELISA法检测抗体效价。结果末次免疫后抗体效价达104，符合要求，末次免疫后7天即 用颈动脉放血法采血，4°C静置过夜(10-12小时)，次日4000rpm离心lOmin，收集上清，分 装后-20°C保存。条形码DNA链合成设计并合成用于本发明中NP探针制备的条形码DNA链，其序 列为5’ -GTG ACT GCA AGT CCA TTG AGG TGA AAT AGC CAG TTC TCG TGG CAT TTG CGT AAT CCT GAT GTA TCG CTC GGT GGT TGC CAA CTA GAG AAC-3’(序列表中 SEQ ID No :1)。NP探针制备取10. 5 μ g BTV VP7的多抗加入到100 μ L纳米金(15nm, 10 40nm 均可)溶液里混合均勻，之后用0. IM NaOH调节pH值至9. 5 ；室温下振荡30min ；加入20 μ L 100 μ M的单链DNA链，10°C下孵育16h，使溶液中的纳米金粒子和抗体、DNA能充分作用； 加入585 μ L 10%的BSA室温孵育30min ；4°C、13000g离心20min，去除上清；之后用0. IM NaCl作为稳定剂，边加边混勻，使稳定剂的终浓度为0. 1M，静置7 IOh以上，重悬沉淀，定 溶至原来的体积。4 8°C保存。(2) MMP探针制备缓冲液(Buffer)A6. 18g H3BO3 (MW 61. 83)添加到 800mL 蒸馏水中，用 5M NaOH调 节pH值到9. 5，使用蒸馏水定溶至1L。缓冲液B:2.62g NaH2PO4 H2O (MW137. 99)、14. 42g Na2HPO4 2H20 (MW 177. 99)用蒸 馏水定溶到lL，pH值为7.4。缓冲液C 在缓冲液A或缓冲液B中溶解39. 64g (NH4) 2S04,用NaOH或者HCl调节 PH值至9. 5或7. 4，最后用缓冲液A或缓冲液B定溶至100mL。缓冲液D 0. 88g NaCl (MW 58. 4)、0· 5% (w/v)BSA to 80mL 0. OlM PBS (pH 7. 4)， 充分混勻后定溶至lOOmL，用0. OlM PBS (pH 7. 4)调节pH 7. 4。缓冲液E 0. 88g NaCl (MW58. 4)、0· 1% (w/v) BSA 到 80mL 0. OlM PBS (pH 7. 4)充 分混勻后用0. OlM PBS (pH 7. 4)定溶至IOOmL0抗BTV VP7蛋白的单克隆抗体的制备用杂交瘤细胞免疫BALB/c小鼠制备抗VP7 蛋白的单克隆抗体，方法为采用6-8周雌性BALB/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前7天，预先 腹腔注射0. 5mL灭菌液体石蜡；然后，每只鼠腹腔注射含1-5X IO6个杂交瘤细胞的0. 5mL 的培养液；当小鼠产生腹水时(1-3周)，腹部穿刺放出腹水(l_5mL)，隔天穿刺直至小鼠死 亡；随后，3000rpm离心15min，除去腹水中的细胞；将上清无菌储存或加0.01%叠氮钠置 于-70°C冰箱保存备用。把66 μ L 磁珠(直径为 2·8μπι，0·5 3μπι均可，2X109beads/mL)移入 EP 管后 置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清和除去磁场；加入ImL Buffer A或BufTerB重 悬磁珠，反复吹打；重新置入磁场中，使磁珠完全沉淀下来，去除上清；除去磁场；之后加入 40 μ L BTV VP7的单抗和20 μ L的Buffer A，反复涡旋；加入40yL BufferC之后涡旋振荡， 37°C孵育12 18h ；重新置入磁场，使磁珠沉淀，去除上清；除去磁场；加入ImL Buffer D
837°C孵育Ih ；再次置入磁场，使磁珠再次完全沉淀，去除上清和磁场；加入ImL Buffer Ε, 涡旋5 IOsec ；置入磁场，使磁珠完全沉淀，去除上清和除去磁场；之后重复用ImL Buffer E洗涤；最后用96 μ L的Buffer E重悬磁珠，使磁珠溶液浓度为20mg/mL。4 8°C保存。(3) BTV VP7新型BCA检测中三明治检测复合物的形成将15yL MMP (20mg/mL)加入 30 μ L BTV VP7 蛋白(100fg/mL)中，37°C 剧烈振荡 Ih ；加入磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连接的VP7蛋白和其它杂质；加入 45 μ L NP探针，剧烈振荡30min ；加入磁场，用500 μ L PBS反复冲洗4次，除去未连接的NP 探针。反复冲洗后用50 μ L超纯水溶解。得到MMP-BTV VP7-NP三明治结构，复合物中的条 形码DNA链可用于下一步的定性、定量检测。(4)条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测对步骤(3)中的条形码DNA链进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR检 测。25 μ 1反应体系为2XPCR缓冲液12. 5 μ 1，上游引物1 μ 1 (50mM)，下游引物 1 μ 1 (50mM)，TaqMan 荧光探针 1 μ 1 (25mM)，三明治复合物样品 2 μ 1，ddH20 7. 5 μ 1。反应条件为95°C 10s,95°C 5s，52°C 20s，共45个循环，每一循环退火结束时收
集FAM荧光信号。上游引物5，-GTTCTC TAG TTG GCA ACC ACC-3，(序列表中 SEQ ID No 2)下游引物5，-GTGACT GCA AGT CCA TTG AGG-3，(序列表中 SEQ ID No 3)TaciMan 荧光探针5，-FAM-AGT TCT CGT GGC ATT TGC GTA ATC C-TAMRA-3，(序 列表中 SEQ ID No 4)条形码DNA链的荧光定量PCR检测扩增曲线图如图4所示(曲线a、b、c、d、e和 f 分别为 102fg/mL、lO'fg/mL, 10°fg/mL、lO—fg/mL、l(T2fg/mL 和 l(T3fg/mLBTV VP7)，条形码 DNA链的荧光定量PCR检测标准曲线如图5所示(标准曲线方程为y = 33. 46-3. 32x)，上 述检测结果表明本检测的BTV VP7检测灵敏度可达10_2fg/mL。(5)条形码DNA链的常规PCR检测对步骤(3)中的条形码DNA链进行常规PCR检测。25 μ 1 PCR反应体系为2 XPCR 缓冲液12. 5 μ 1，上游引物1 μ 1 (50mM)，下游引物1 μ 1 (50mM)，三明治结构2 μ 1，ddH20 8. 5μ 1。PCR 反应条件为95°C 10s，95°C 5s, 52°C 20s, 72°C 20s，共 35 个循环；最后 72°C 7min，4°C终止反应。反应结束后，取PCR扩增产物各10 μ 1进行3%琼脂糖凝胶电泳检测 (100V 电泳 40min)。上游引物5，-GTTCTC TAG TTG GCA ACC ACC-3'(序列表中 SEQ ID No 2)下游引物5，-GTGACT GCA AGT CCA TTG AGG-3'(序列表中 SEQ ID No 3)常规PCR检测结果如图6所示(泳道M为DL2000 DNA Marker,泳道a g分别 为 103fg/mL、102fg/mL、lO'fg/mL, 10°fg/mL、lO—fg/mL、l(T2fg/mL 和 l(T3fg/mL)，检测结果表 明本检测BTV VP7蛋白检测灵敏度可达10_2fg/mL。利用本发明方法针对多种来源(如病毒、细菌、毒素、生物战剂、类固醇、脂类、维 生素、肿瘤特异性标志物)的检测物，仅需确定检测的目标蛋白，检测过程与实施例1和实 施例2所列步骤完全相同，所不同的是需使用目标蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体(这些 单克隆抗体和多克隆抗体均可采用生物技术领域中的常规方法制备，也可直接购买)，在此不一一赘述；针对不同目标蛋白用本发明方法进行检测，也能达到与实施例1和实施例2类 似的检测效果。实施例3、新型BCA检测试剂盒的制备将实施例中的条形码DNA链、上游引物、下游引物、TaqMan荧光探针、金钠米颗粒 和磁性微球共同包装，得到新型BCA检测试剂盒。
权利要求
一种生物条形码检测方法，是在普通生物条形码检测方法的基础上，将标记的条形码DNA链改进为单链，并将其长度延长为适于进行荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法或普通PCR方法对三明治反应复合物中条形码DNA链进行定性、定量检测的生物条形码检测方法。
2.根据权利要求1所述的生物条形码检测方法，其特征在于所述生物条形码检测方 法包括以下步骤(1)NP探针的制备设计适用荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的条形码DNA单链， 然后利用金纳米颗粒、抗待测物的多克隆抗体和条形码DNA单链制备NP探针；(2)MMP探针的制备用磁性微球和抗待测物的单克隆抗体制备MMP探针；(3)条形码DNA检测利用NP探针、MMP探针和待测物通过抗原、抗体作用制备三明治 复合物，然后将复合物上标记的条形码DNA链直接进行基于TaqMan荧光探针的实时荧光定 量PCR检测或普通PCR检测，以对待测物进行定性、定量检测。
3.根据权利要求2所述的生物条形码检测方法，其特征在于所述步骤(1)中的金纳 米颗粒直径为10 40nm，优选为15nm ；用于生物条形码检测的单链条形码DNA链具有序列 表中SEQ ID No 1的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的生物条形码检测方法，其特征在于所述步骤(2)中磁性微 球的直径为0. 5 3 μ m，优选为2. 8 μ m。
5.根据权利要求2所述的生物条形码检测方法，其特征在于所述步骤(3)中用于对 条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No 2 的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No 3的核苷酸序列，TaqMan荧光探针具有 序列表中SEQ ID No 4的核苷酸序列。
6.根据权利要求2所述的生物条形码检测方法，其特征在于所述步骤(1)和步骤(2) 中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。
7.权利要求1-6任一项所述的生物条形码检测方法在检测病毒、细菌、毒素、生物战 剂、类固醇、脂类、维生素和肿瘤特异性标志物中目标蛋白的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述毒素为蓖麻毒素，目标蛋白为蓖麻毒素 蛋白，检测中使用的MMP探针标记有抗蓖麻毒素蛋白的单克隆抗体，NP探针标记有抗蓖麻 毒素蛋白的多克隆抗体；所述病毒为蓝舍病病毒，目标蛋白为VP7蛋白，检测中使用的MMP 探针标记有抗VP7蛋白的单克隆抗体，NP探针标记有抗VP7蛋白的多克隆抗体。
9.一种生物条形码检测试剂盒，包括包被有抗待测物单克隆抗体的MMP探针，包被有 抗待测物多克隆抗体和条形码单链DNA链的NP探针，以及用于实时荧光定量PCR检测的引 物和TaqMan荧光探针。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述与NP探针联结的条形码DNA链 具有序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列；用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检 测的引物对的上游引物具有序列表中SEQ ID No :2的核苷酸序列，下游引物具有序列表中 SEQ ID No 3的核苷酸序列；用于对条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan荧 光探针具有序列表中SEQ ID No 4的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种生物条形码检测方法及其应用。该方法是在普通生物条形码检测方法的基础上，将标记的条形码DNA链改进为单链，并将其长度延长为适于进行荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，三明治反应复合物中条形码DNA链不用解离，直接用基于TaqMan荧光探针的实时荧光定量PCR方法或普通PCR方法对三明治反应复合物中条形码DNA链进行定性、定量检测的生物条形码检测方法。本发明降低了检测成本，简化了检测程序，可对被检物进行精确定量，具有准确度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低廉等优点。本发明对于各种目标蛋白的高灵敏度检测具有较大的实际意义，应用前景广阔。
文档编号G01N33/577GK101986157SQ201010530060
公开日2011年3月16日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者尹惠琼, 杨姝, 章金刚, 贾茗娴 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所