专利名称：血清中胆固醇酯的两步酶测定方法
技术领域：
本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生 颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中胆固醇 酯的两步酶测定方法。
背景技术：
血清中胆固醇以两种形式存在，一种为游离胆固醇(FC)；另一种为胆固醇与脂肪 酸结合的胆固醇酯(CHE)。胆固醇酯正常值为2. 34 3. 38mmol/L(占总胆固醇的60 80% )。测胆固醇酯(CHE)具有临床意义，其增高常见于胆道梗阻、甲状腺功能减退、高脂血 症和动脉粥样硬化等病症。其降低常见于严重肝病、甲状腺功能亢进、严重感染和营养不良 等病症。胆固醇酯增高更易患心脑血管疾病。当胆固醇水平随着年龄或饮食条件的改变而 上升时，胆固醇酯也同时上升。胆固醇酯与总胆固醇(TC)比值正常值为0.6 0.8 1。 胆固醇酯与总胆固醇比值有临床意义(1)鉴别肝内外黄疸阻塞性黄疸比值正常，肝细胞 性黄疸比值降低。(2)增高预示肝细胞损伤、病毒性肝炎早期、家族性卵磷酯胆固醇酰基 转移酶缺乏等病症。因此临床上经常需要检测胆固醇酯。血清中胆固醇的测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。早期测定方 法是萃取法和化学法。美国疾病控制中心总胆固醇的测定方法为Lidberman-Burchard改 良法。目前世界上大多数国家及我国检测血清胆固醇一般都采用酶法。另外还可采用高效 液相色谱仪测定血清中的胆固醇及总胆固醇，但其检测成本高，速度慢、不易自动化、难以 在临床推广。目前国内几乎所有临床实验室都采用酶法测定胆固醇。采用酶法检测血清胆固醇 的水平，一般都包括以下几个基本反应步骤先用表面活性剂将脂蛋白分解成胆固醇、胆固 醇酯和蛋白质。再选用最合适的胆固醇酯酶水解胆固醇酯，生成胆固醇和脂肪酸。水解后 的胆固醇和血清中原有的游离胆固醇被胆固醇氧化酶氧化生成H2O2，在过氧化物酶(POD) 的催化下，H2O2和4-氨基安替比林(4-AAP)、2，4-二氯酚(也可使用4-氯酚、苯酚衍生物、 苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色 染料(常为醌亚胺类)，这些物质的生成量与样本中胆固醇的含量成正比。最后通过分光光 度法计算出相应的胆固醇浓度。由于与血清中原有的游离胆固醇反应结果一起计算，所以 计算结果是总胆固醇浓度。具体反应见化学反应式1 4。
权利要求
一种血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I中含有双色原物质、胆酸钠、抗坏血酸氧化酶、POD、胆固醇氧化酶、表面活性剂及适量防腐剂；试剂II内含有胆固醇酯水解酶及适量防腐剂；其测定方法为待测血清样品先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离胆固醇与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II后于37℃温浴4～7分钟，胆固醇酯水解后产生胆固醇，经反应也生成醌亚胺；仪器在500nm～520nm波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，从试剂II反应产生的醌亚胺计算出胆固醇酯的含量，计算公式为ODCHE＝OD2 OD1×[SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]胆固醇酯浓度＝F×ODCHE其中ODCHE是胆固醇酯产生的吸光度，OD1是样品加入试剂I反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂II反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂I的体积，R2V2是试剂II的体积，F是校正因数。
2.根据权利要求1所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I中双 色原物质一个为4-氨基安替比林，另一个选自2，4_ 二氯酚、4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐和 苯磺酸盐中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I中表 面活性剂选自TritonX-100。
4.根据权利要求1所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I及试 剂II中防腐剂选自Proclin-300。
5.根据权利要求1所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I每 升 Tris-HCl 缓冲液内含 Tris IOOmmol 200mmol、2，4_ 二氯酚 2. Ommol 4. OmmoU 4-氨基安替比林 0. 8mmol 2. 4mmol、胆酸钠 3. Ommol 5. 5mmol、TritonX-1000. 08g 0. 15g、抗坏血酸氧化酶1000U 1200U、POD 800U 1600U、胆固醇氧化酶800 1600U、 Proclin-300100y 1 300 μ 1 ；试剂 II 每升 Tris-HCl 缓冲液内含 TrislOOmmol 200mmol、胆固醇酯水解酶 800U 2400U、Proclin-300100 μ 1 300 μ 1。
6.根据权利要求5所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I和试 剂II中Tris-HCl缓冲液的ρΗ值为7. 7士0. 2。
7.根据权利要求1所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于测定所用各 物品的体积比为样品试剂I 试剂II = I 75 80 25 20。
全文摘要
本发明公开了一种血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是试剂II中仅有胆固醇酯水解酶有效组分，双色原物质及其它有效组分同在试剂I中；其测定方法为血清先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离胆固醇与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II后于37℃温浴4～7分钟，胆固醇酯水解后生成胆固醇，经反应生成红色的醌亚胺。仪器在500nm～520nm波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，由试剂II反应产生的醌亚胺可测出胆固醇酯的含量。本发明检测时不受内源性游离胆固醇影响，其使用方法和范围与原有两步酶法相同，是一种快捷、准确性更高的胆固醇酯检测方法。
文档编号G01N21/75GK101975753SQ20101028459
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者李立和 申请人:李立和