专利名称：一种采用dna为探针的电化学检测环境污染物方法
技术领域：
本发明属于生化分析和生物传感领域，特别是涉及DNA电化学传感器检测环境中基因毒性化合物的方法。
背景技术：
DNA传感器检测主要分为靶DNA检测和DNA突变测定两种。这些测定在人类疾病诊断、环境中病原体检测、食品安全、检疫等方面有广泛的应用。随着人们对环境安全及身体健康的日益关注，迫切需要能对各种重大疾病进行早期诊断和治疗，迅速对周边环境进行安全评价。然而，目前对环境中具有基因毒性物质的筛查检测，主要通过动物试验和细胞毒理学评价来得到其毒性强弱的数据，此方法费用高昂、 周期长，不适合大批量化合物的毒性筛查。气相色谱-质谱联用(GC-MQ和液相色谱-质谱联用(LC-MQ，可以对已知基因毒性化合物定性定量，然而其设备大型昂贵很难实现现场检测，且检测项目单一，通量小，样品前处理复杂耗时。另外，色谱-质谱联用的方法无法对未知化合物和新化合物可能的毒性效应进行评价。由于动物试验和色谱-质谱联用实验存在的缺点，20世纪70年代以后，国内外学者开始利用微生物传感器来检测基因毒性物质引起的DNA损伤或序列改变，主要有Ames 法，SOS显色反应等及其从中衍生出来的方法。然而，Ames法检测假阳性高；SOS显色反应灵敏度不够。本发明所使用的DNA电化学传感器结合了 DNA和电化学的优点，总体来说，包括以下几个方面的优势1)、特异性好，DNA分子双链之间通过特定的碱基配对而具有非常高的特异性识别能力。2)、稳定性好，离体DNA比多数蛋白质(酶)分子的热稳定性好，制成的传感器可以保存较长时间。3)、制备简单，可以大批量合成。4)、电化学响应快，操作比较简便。5)、灵敏度高，成本低廉，适合大批量筛查检测。然而电化学方法直接检测DNA产生的响应信号较低，微弱的响应信号容易受到噪声干扰，发生基线偏移，降低了仪器的灵敏度。而环境中基因毒性化合物的浓度低，引起的电信号变化不明显。本发明使用信号分子探针增大DNA电化学传感器的灵敏度，使得低至皮摩尔浓度的基因毒性化合物产生的电信号变化也能够被检测到。本发明提供了一种简易、快速而灵敏的基因毒性化合物的筛选方法，不仅可以评价已知基因毒性化合物毒性强弱；还可以评价未知化合物的毒性效应；筛查实际样品中是否含有基因毒性化合物。仪器设备小型廉价，检测通量大，样品前处理简单，适合现场快速筛查检测。可直接应用于食品和环境样品的现场筛查与检测，达到经济、灵敏、准确和快速大批量筛查的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作方便、检测灵敏度高、结果准确可靠，并且能够用于现场筛查检测环境污染物尤其是基因毒性化合物的生物传感器检测方法。用于基因毒性化合物筛查的DNA电化学传感器，应用其对目标分析物检测，结果准确可靠，步骤简单，灵敏度高，适合大批量样品的现场筛查。核酸传感器检测基因毒性化合物的原理基因毒性化合物与核酸传感器上的固载 DNA作用后，通过与双链DNA非共价结合、DNA碱基损伤等方式会引起DNA双链的结构或配对的细微变化，上述变化通过在双链DNA上引入与DNA特异性结合的电化学活性分子亚甲基蓝(MB)能够进行信号放大。通过记录核酸传感器与基因毒性化合物作用前后的电信号变化可以判断目标分析物是否具有基因毒性及其毒性大小。对于单一的目标分析物，该核酸传感器的信号变化强度与目标分析物的浓度在一定范围内线性相关。对于水、土壤、食品、空气、烟道气等复杂的目标样品，该核酸传感器能够快速筛查目标样品中是否含有基因毒性化合物。该核酸传感器还可以通过与毒性已知的化合物的比对实验评价新合成或毒性未知的化合物的毒性效应。本发明使用的DNA捕获探针和封闭剂(巯基己醇)通过末端标记的巯基固定在金电极表面。互补靶核酸片段在15 30°C与金电极上固载的DNA捕获探针在缓冲体系(pH 7. 0)中反应1 2小时。本发明在核酸传感器的检测溶液中加入与核酸传感器特性结合的具有氧化还原活性的信号分子亚甲基蓝(MB)，增加了电极的响应电流信号。本发明检测的非水溶性已知化合物在助溶剂N，N- 二甲基甲酰胺的作用下溶于检测体系进行电化学检测分析。未知化合物通过电化学分析检测，其检测结果与六氯苯的检测结果对比评价未知化合物的基因毒性效应。目标分析物为实际样品时，可以通过电化学分析检测确定样品中是否含有基因毒性化合物。本发明的检测方法包括以下步骤a).将单链DNA捕获探针的一端固定在电化学装置的工作电极表面，得到核酸捕获探针，采用封闭剂与工作电极表面的剩余位点结合；b).在杂交条件下，将互补靶DNA片段与上述的核酸捕获探针杂合，得到双链DNA 修饰的工作电极探针；C).采用与双链DNA特异性结合的电活性信号分子溶液浸泡双链DNA修饰的工作电极探针，得到核酸传感器；将核酸传感器、参比电极和辅助电极置于检测缓冲体系中，进行电化学扫描并记录得到的电化学信号Ia，氮气吹干。在修饰电极表面滴加空白缓冲溶液，处理10 40分钟， 随后浸入含有2 20 μ M信号探针(MB)的检测溶液，扫描电化学信号，作空白对照。；d).取出核酸传感器，将液态的目标分析物滴加到核酸传感器表面，静置10 30 分钟，缓冲溶液淋洗，得到处理后的核酸修饰传感器；然后将处理后的核酸修饰传感器重新浸入到上述检测缓冲体系，进行电化学扫描并记录响应信号Ib ；e).通过电流下降百分比(Ia-Ib)/Ia是否彡8%，对基因毒性化合物进行筛选检测分析；通过与标准化合物(六氯苯)的电流下降百分比对比，对目标分析物进行毒性效应评价；通过核酸传感器电化学分析检测确定实际样品中是否含有目标分析物；所述的未知化合物通过核酸传感器检测的电流下降百分比，来评价未知化合物的基因毒性效应。核酸传感器的制备与样品的检测过程可以分为以下三个步骤本发明使用峰电流信号下降百分比评价化合物毒性大小n为N，N_ 二甲基甲酰胺缓冲溶液处理双链DNA修饰的金电极后扫描的峰电流，即背景溶液扫描的峰电流;m为3， 3’，4,4'-TePCB等检测化合物溶液处理双链DNA修饰的金电极后扫描的峰电流；w为3，3’， 4,4' -TePCB等检测化合物溶液处理前后峰电流信号下降百分比。峰电流信号下降百分比公式如下w = [(n-m)/n]*100%相对于现有技术，本发明具有如下优点1、检测结果可靠、准确。DNA传感器具有比蛋白质(酶)传感器对环境更好的稳定性，从而只有具有基因毒性的化合物才会引起电信号变化，提高了检测结果的可靠、准确性。可以用来筛查实际样品中是否含有基因毒性化合物。2、扩大了检测范围。非基因毒性助溶剂的使用，使得大量不溶于水的已知有机污染物列入了 DNA传感器的检测范围；同时可以对未知溶液进行检测，确定是否具有基因毒性。3、可以实现便捷、快速高通量筛查。检测设备由一个微型化的电化学工作站、一个三电极体系以及一个检测池组成，设备简单，易于携带，适合野外现场筛查。
图1为本发明方法中基因毒性化合物与检测探针作用模式示意图。图2为本发明方法实施例1中监测DNA探针与电极组装过程，A图中a为裸金电极在ImM铁氰化钾溶液中的循环伏安(CV)曲线，b为DNA和巯基己醇修饰金电极的CV曲线。B图中a为修饰单链DNA(捕获核酸探针)的金电极在10 μ M MB溶液中的CV曲线，b 为修饰双链DNA的金电极在10 μ M MB溶液中CV曲线。插图中a为修饰单链DNA的金电极在10 μ M MB溶液中微分脉冲扫描(DPV)曲线，b为修饰双链DNA的金电极在10 μ M MB溶液中DPV曲线。图3为核酸修饰电极在MB溶液中不同扫速下扫描曲线，自上到下为80、60、40、20、 10mV/s ；插图为扫描速度与电信号线性相关曲线。图4为本发明方法实施例2的六氯苯浓度与电信号关系的曲线。图5为本发明方法实施例3中六氯苯与双链核酸探针作用的紫外可见曲线。分别为曲线a表示MB溶液；曲线b表示MB-DNA溶液；曲线c表示2 μ 1 1(Γ2Μ的六氯苯作用于 MB-DNA。图6为本发明方法实施例4的基因毒性化合物(lOOng/ml)与几种非基因毒性化合物(lOOng/ml)引起的电信号下降百分比对照图1、硝酸钾；2、柠檬酸钠；3、草酸钠； 4、尿素；5、乙酸乙酯；6、碳酸二乙酯；7、三氯甲烷；8、3，3，，4，4，-TePCB ；9、3，3，，4，4，，5， 5，-PePCB ；10、l，2，3，4，7，8-HxCDD ； 11、2，3，7，8-TBrDF。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其它未具体注明的实验条件，按照常规或仪器制造厂建议的条件。紫外可见所用仪器为紫外可见分光光度计(SP-1901，中国)。紫外可见测量条件 光源为紫外和可见灯，光源在325nm处自动切换，扫描波长范围为190 700nm，扫描间隔为lnm。用3ml石英比色皿进行测量，样品体积为anl，室温。电化学检测所用仪器为上海辰华电化学工作站CHI440，三电极体系，检测体系处于氮气氛围。DNA双链(莫罗尼氏白血病毒片段)皆购于Takara (中国，大连)。DNA序列如表1所示。表1寡聚核苷酸碱基序列
功能名称碱基组成捕获探针(a)DNAl5'-SH-(CH2)6-AGCTGCGTCACGCCCA-3'互补片段(b)DNA25 '-TGGGCGTGACGCAGCT -3，双链探针(C)5'- AGCTGCGTCACGCCCA-3，DNA3TGGGCGTGACGCAGCT实施例1.核酸生物传感器组装金电极组装步骤1)表面积为0. 02cm2金电极用粒径分别为1，0. 3,0. 05 μ m的三氧化二铝粉末抛光，然后在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗3次，每次2分钟。放入IM硫酸溶液中在 0 1.7V之间循环扫描活化，当扫描曲线完全重合时，停止扫描(活化完成)。2)图2A中循环伏安曲线a表示活化的金电极放入2mM的铁氰化钾缓冲溶液， 在-0. 1 0. 6V之间扫描循环伏安曲线。该曲线氧化还原峰电位差小于75mV，说明金电极表面的铁氰化钾反应属于完全可逆反应，金电极表面没有杂质并且被完全活化。取出电极后， 用去离子水冲洗并氮气吹干，在电极表面滴加15μ 1 2μ M的巯基末端修饰的单链DNA(核酸捕获探针)，室温处理6小时；用去离子水和IOmM PBS缓冲液(ρΗ 7. 0)反复冲洗，氮气吹干，随后加入ImM巯基己醇(封闭剂)处理1小时，封闭电极表面剩余活性位点。3)图2Α中CV曲线b表示核酸捕获探针和封闭剂修饰后的金电极放入2mM的铁氰化钾溶液，在-0. 1 0.6V之间扫描循环伏安曲线。CV曲线中铁氰化钾的峰电流极大下降，说明核酸捕获探针和封闭剂已经完全结合到金电极表面。图2B中CV曲线a表示核酸捕获探针修饰的金电极浸入含有10 μ M MB分子探针的PBS (IOmM)缓冲液中，氮气氛围下搅拌10分钟，在-0. 5 OV范围内扫描(扫速为100mV/s)。图2B中CV曲线b表示15μ 1 2 μ M的互补链DNA滴加到核酸捕获探针修饰的金电极表面在室温条件下杂合2小时，随后用去离子水和IOmM PBS缓冲液(ρΗ 7.0)反复冲洗，氮气吹干后，在10 μ M MB的PBS (IOmM) 缓冲液中扫描。由于MB与单链捕获探针的相互作用大于与双链DNA相互作用，MB与单链的结合量大于双链，捕获探针修饰金电极产生的电信号高于双链DNA修饰金电极的电信号。4)图3为核酸捕获探针修饰金电极在10 μ M MB溶液中以10、20、40、60、80mV/s五个不同的扫速扫描，得出扫速与信号强度成线性相关，此反应属于电极表面控制反应。实施例2.核酸生物传感器检测六氯苯用N，N- 二甲基甲酰胺作助溶剂将六氯苯溶于IOmM的PBS缓冲液中，配成ΙΟΟρΜ、 ΙηΜ、ΙΟηΜ、ΙΟΟηΜ、1 μ M 的六氯苯溶液。图4表示向双链DNA修饰的金电极表面滴加15 μ 1六氯苯溶液，室温处理20分钟，然后浸入10μΜ MB的PBS(IOmM)缓冲液中氮气氛围下电化学扫描，得到浓度与电信号之间的相关曲线。六氯苯与DNA作用，通过与双链DNA非共价结合、DNA碱基损伤等方式引起DNA配对变化，导致核酸传感器电信号改变。随着浓度的升高，电信号逐步衰减，信号变化强度与六氯苯浓度在一定范围内线性相关。实施例3.紫外可见检测六氯苯与DNA的作用模式图5表示在石英比色皿中加入anl IOmM的PBS缓冲液，在190 700nm范围内全波长扫描空白，曲线a为向空白溶液中加入20 μ 1 ImM的MB，全波长扫描得到MB峰。曲线b为向MB溶液中加入6 μ 1 100 μ M的双链DNA，摇勻静置10分钟，扫描得到MB与DNA的混合峰。选择620-700nm处的无干扰峰为检测波长范围。曲线c为在MB和DNA的混合溶液中加入2 μ 1 IO-2M的六氯苯，测定溶液在620-700nm的吸收峰。由实验结果分析得到MB峰出现在190 ；350歷和620 700nm，而DNA峰的位置在220 270nm，与MB 190 350nm处的峰互相干扰，不宜作为分析研究对象。而MB 620 700nm的峰没有受到DNA的峰干扰，可以作为本实验的分析研究对象。DNA加入后，MB嵌入双螺旋DNA，发生π - π *共轭，MB峰强度明显减弱(减色效应)，且吸收峰的位置红移3nm。 当加入2 μ 1 IO-2M的六氯苯后，由于六氯苯与DNA间强烈的相互作用，六氯苯将部分MB从 DNA双链上取代下来，MB的吸收峰强度增大(增色效应)，并出现蓝移，当加入4μ1以上
六氯苯后，MB峰不再出现蓝移和增色效应，六氯苯与DNA的结合达到饱和。实施例4.核酸生物传感器筛查检测基因毒性化合物图6为用N，N- 二甲基甲酰胺作为助溶剂将下列12种化合物溶于IOmM的PBS， 配成lOOng/ml的溶液，用核酸传感器记录电信号变化；12种检测化合物分别为1、硝酸钾；2、柠檬酸钠；3、草酸钠；4、尿素；5、乙酸乙酯；6、碳酸二乙酯；7、三氯甲烷；8、3，3，，4， 4，-TePCB ;9、3，3，，4，4，，5，5，-PePCB ； 10、1，2，3，4，7，8-HxCDD ；11、2，3，7，8-TBrDF。在双链DNA修饰的电极表面，滴加15 μ 1上述化合物溶液，室温静置20分钟，然后浸入10 μ M MB 的PBS(IOmM)缓冲液中氮气氛围下扫描电化学信号。没有基因毒性的硝酸钾、柠檬酸钠、草酸钠、尿素、乙酸乙酯、碳酸二乙酯、三氯甲烷等几乎检测不到电信号下降，为阴性结果。(经数据分析得到电信号下降百分比小于 8%时，视为阴性结果)。2，3，7，8-TBrDF和1，2，3，4，7，8_Hx⑶D毒性大小相似，二者引起的电信号下降百分比接近。而PCB毒性相对较小，引起的电信号下降百分比小于2，3，7， 8-TBrDF和1，2，3，4，7，8_Hx⑶D。从而得出结论化合物基因毒性的大小不同，导致电信号不同程度的下降。此方法能够明显的区别背景和具有基因毒性的化合物的响应信号，因此可以用来做大批量环境样品的初筛；不但可以对已知基因毒性化合物筛查评价，确定其毒性与电信号强度的对应关系，而且可以评价未知化合物的毒性效应；筛查实际样品中是否含有基因毒性化合物。
与现有的生物传感器相比，该方法主要优点是1.灵敏度高，电活性信号分子与核酸探针结合，增大了响应电流；2.仪器设备小型廉价，检测通量大，样品前处理简单，适合现场快速筛查检测。此方法不但可以对已知基因毒性化合物进行筛查检测，而且可以评价新合成化合物的潜在毒性效应；筛查实际样品中是否含有基因毒性化合物。
权利要求
1.一种采用双链DNA为检测探针的电化学检测环境污染物的方法，采用三电极体系的电化学装置进行检测，特征在于，该方法包括以下步骤a).将单链DNA捕获探针的一端固定在电化学装置的工作电极表面，得到核酸捕获探针，采用封闭剂与工作电极表面的剩余位点结合；b).在杂交条件下，将互补靶DNA片段与上述的核酸捕获探针杂合，得到双链DNA修饰的工作电极探针；c).采用与双链DNA特异性结合的电活性信号分子溶液浸泡双链DNA修饰的工作电极探针，得到核酸传感器；将核酸传感器、参比电极和辅助电极置于检测缓冲体系中，进行电化学扫描并记录得到的电化学信号Ia;d).取出核酸传感器，将液态的目标分析物滴加到核酸传感器表面，静置10 30分钟， 缓冲溶液淋洗，得到处理后的核酸修饰传感器；然后将处理后的核酸修饰传感器重新浸入到上述检测缓冲体系，进行电化学扫描并记录响应信号Ib ；e).通过电流下降百分比(Ia-Ib)/Ia是否彡8%，对基因毒性化合物进行筛选检测分析；通过与标准化合物(六氯苯)的电流下降百分比对比，对目标分析物进行毒性效应评价；通过核酸传感器电化学分析检测确定实际样品中是否含有目标分析物；所述的未知化合物通过核酸传感器检测的电流下降百分比，来评价未知化合物的基因毒性效应。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的双链核酸为含有12 30个碱基对， 并且鸟嘌呤(G)含量彡25%的双链核酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的电化学装置的工作电极是贵金属电极；所述的核酸捕获探针和封闭剂通过末端标记的功能基团固定在电极表面；所述的核酸捕获探针和封闭剂的功能基团为生物素、硅氧基、巯基或氨基中的一种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的电化学装置的工作电极是金电极；所述的核酸捕获探针和封闭剂的末端标记的功能基团为巯基。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述封闭剂为巯基末端修饰的封闭剂，即硫代链烃或硫代芳香烃，优选硫代链烃；所述的硫代链烃中的链烃是指分子中的碳原子结合成链的有机化合物，硫代芳香烃中的芳香烃是指分子中含有苯环结构的碳氢化合物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的硫代链烃的碳原子数个数为2 30 个，优选6 10个碳原子。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的杂交条件为0 60°C反应0.2 6 小时，优选15 30°C反应1 2小时。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的信号分子为与DNA特异性结合的具有氧化还原活性的化合物，优选的是亚甲基蓝(MB)或联吡啶钌或联吡啶钴。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的目标分析物为毒性已知化合物或毒性未知化合物；所述的毒性已知化合物为水溶性化合物或可溶于助溶剂的非水溶性化合物；非水溶性化合物在助溶剂的作用下溶于缓冲体系；所述的助溶剂为对检测结果无明显影响的N，N-二甲基甲酰胺；所述的毒性未知化合物为新合成的化合物或毒性效应未知的已合成化合物。
全文摘要
一种采用DNA为探针的电化学检测环境污染物方法，所述的生物传感器检测装置包括工作电极、辅助电极、参比电极、检测池和电化学工作站；工作电极表面修饰核酸探针，在缓冲体系中检测环境样品中的基因毒性化合物。当检测结果为阳性时，传感器的信号变化明显。与现有的生物传感器相比，该方法主要优点是1.灵敏度高，电活性信号分子与核酸探针结合，增大了响应电流；2.仪器设备小型廉价，检测通量大，样品前处理简单，适合现场快速筛查检测。此方法不但可以对已知基因毒性化合物进行筛查检测，而且可以评价新合成化合物的潜在毒性效应；筛查实际样品中是否含有基因毒性化合物。
文档编号G01N27/49GK102375021SQ20101026208
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者卢宪波, 吴立冬, 苏凡, 陈吉平 申请人:中国科学院大连化学物理研究所