专利名称：转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法
技术领域：
本发明涉及一种转甜菜碱醛脱氢酶BADH基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法， 属于分子生物学领域。
背景技术：
利用转基因技术将外源抗逆基因引入玉米是显著提高玉米抗逆能力、大幅度提高 产量和改善品质的最现实有效的途径。美国等发达国家已利用转基因技术培育出一批转 基因玉米新种质或新品种(Cathy，2007)，中国是世界第二大玉米生产国，常年种植2400万 hm2，转基因玉米即将进入生产阶段。虽然自然界的物种之间一直存在基因交流，但是转基因技术克服了种间甚至是类 群间的界限，植物、微生物、动物甚至是人类的基因都可以在各自的基因组内相互转化。这 样做的结果是转基因作物的基因流所携带的可能就不仅仅包括自身的基因，也包括来自其 他生物的外源基因。这种不确定性及其可能存在的后果也是目前生物安全论争的焦点。因此在关注转基因玉米所带来的巨大社会、经济和生态效益的同时，也带来了一 系列的生物安全问题。其中比较令人关注的是外源基因的逃逸，从而对生态环境造成一定 的危害(Kiran等，2002，2005)。外源基因的逃逸可以通过传播种子和传播花粉两种方式发 生，而花粉传播是其中最主要的方式(Hardy等，2004 ;Kenta等，2004)。花粉介导的基因流 及其生态后果是转基因作物生态风险评估及其生态影响监测的主要内容。有关转基因玉米通过花粉发生基因逃逸的研究大多集中于转基因玉米借助风媒 或虫媒与非转基因玉米及其野生亲缘种进行异花授粉，形成含有转基因的杂交后代。与野 生亲缘种相比，转基因玉米更容易与其同种作物杂交，并由此产生相关的环境、生产、贸易 和人畜健康等安全性问题。多数研究表明，玉米花粉的漂移率从距离花粉源10 20m以外 开始逐渐降低，最大漂移距离为200m(Chilcutt等，2004 ；Ma等，2004)，也有在300m仍检测 到0. 02%异交率的报道(Stevens等，2004)。现有的证据显示，基因漂移和花粉流之间存在 明显的相关性。而关于抗除草剂玉米外源基因逃逸的研究，我国仅有路兴波等(2005)和邸 宏(2008)两篇报道。而有关转基因玉米花粉中外源基因表达蛋白在土壤中的降解存留情 况的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种转甜菜碱醛脱氢酶BADH基因耐盐碱玉米环境安全性检 测方法，以玉米花粉为检测对象，与不同PH值盐碱土混合后，进行保温保湿处理，不同时间 段检测甜菜碱醛脱氢酶BADH的活性，达到建立一个操作简便、结果可靠的耐盐碱转甜菜碱 醛脱氢酶BADH基因玉米环境安全性检测方法的目的。上述的目的通过以下的技术方案实现转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法，该方法包括如下步骤(1)玉米的种植挑选发育良好转甜菜碱醛脱氢酶BADH基因耐盐碱玉米种子，采用盆栽方式种植，盆深45-55cm，盆直径45-55cm，常规管理；(2)盐胁迫处理在玉米拔节期开始直至玉米植株抽雄，每隔4-7天灌浇氯化钠水 溶液，每次灌浇IOOOml/盆；(3)采集花粉与盐碱土混合进行花粉降解试验玉米开始散粉后收集0. Ig花粉与 3. 15g 土壤充分混勻，放入盖子上打有Φ2mm小孔的50ml离心管中，加入0. 965ml蒸馏水， 放进人工气候箱，保持黑暗，进行花粉降解试验；(4)甜菜碱醛脱氢酶活性检测在分解30天时取样，提取甜菜碱醛脱氢酶，采用分 光光度计法测定甜菜碱醛脱氢酶活性。所述的转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法，步骤(2)中所述 的氯化钠水溶液的质量百分浓度为0. 3%。所述的转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法，所述的人工气候 箱设定的参数为温度25°C，湿度65% -85%。有益效果(1)本发明对转基因玉米盐胁迫浓度、玉米花粉与盐碱土混合比例、玉米花粉与盐 碱土混合后保温保湿处理条件和时间等条件，进行了详细的研究，确立了适宜的范围，建立 了一种转BADH基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法。(2)本发明步骤简单，以转基因玉米花粉作为评价对象，试验材料易于获取，试验 周期短，效率高。(3)本发明的转BADH基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法具有适用范围广的特 点，适用于耐盐碱转基因玉米的环境安全性检测。
附图1是本发明的步骤框图。附图2是不同土壤pH下，BADH蛋白降解的速度曲线。
具体实施例方式实施例1 转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法，该方法包括如下步骤耐盐碱转甜菜碱醛脱氢酶BADH基因玉米H_14，由东北农业大学玉米研究所提供， 试验在东北农业大学园艺实验站隔离盆栽场和温室进行，试验时间为2009年5月 11月。 玉米采用盆栽方式种植，盆深(塑料桶)45cm，高45cm。生长期不施用任何农药，常规管理， 试验区周围500m范围内没有其它同期种植的玉米。试验设置重量百分浓度为0. 3% NaCl 作为盐胁迫处理浓度。盐胁迫前，每4 5天浇一次清水，每次浇水约2L/盆；盐胁迫开始 后，按处理要求每4天浇一次盐溶液IOOOml/盆，直至散粉。当转基因玉米抽雄后散粉前，将玉米植株雄穗套袋。开始散粉后第3天(高峰期) 时把纸袋取下，将玉米花粉充分混合。称取0. Ig花粉与3. 15g 土壤充分混勻，放入盖子上 打有小孔(2mm)的50ml离心管中，加入0. 965ml蒸馏水调节至土壤田间持水量。离心管 放进人工气候箱(25°C，湿度85%)，保持黑暗，进行花粉降解试验。土壤类型设置为普通 耕土(pH6. 96)、轻度盐碱土(pH8. 06)和中度盐碱土(pH9. 26) 3个处理，盐碱土取自黑龙江
4省安达市松嫩平原原生盐碱化草地。每处理7次取样，每次3个重复。试验始于2009年 7月10日，分别在分解0、5、10、15、30、60、90d时取样，每次取样后用胶带密封离心管上小 孔，-80°C冰箱保存。取样结束，统一采用分光光度计法测定BADH酶活性，标样为甘氨酸甜菜碱纯品， 购自美国Sigma公司。BADH的提取取1. Og样品，液氮下迅速研成粉末，加入IOml酶提取缓冲溶液 (50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0), lmmol/L EDTA,5mmol/L DTT)，研磨成勻浆，4°C下 14000r/ min离心lOmin。所得上清液再重复离心2次，收集上清液，即得酶粗提液。BADH的活性分析在2ml反应体系中，加入1. 9ml反应缓冲液(IOOmmol/ LTris-HCl，pH8. 0,0. 5mmol/LNAD’，5mmol/LDTT)，再加入 0. Iml 酶粗提液，共计 2ml。放在紫 外分光光度计的比色杯中，反应从加入0. Iml的lOmmol/L甜菜碱醛开始，测定波长为340nm 处的吸收值。以水(不加甜菜碱醛)为空白对照做同样测定.反应在30°C下进行，时间为 30mino紫外分光光度计340nm比色测定。酶活力单位定义为上述条件下每分钟消耗 lnmol/L NAD为1个酶活力单位U。由图2可见，在不同pH 土壤条件下，转基因玉米花粉中BADH酶活性均呈现快速降 解的趋势。到第5d时，普通耕土、轻度盐碱土和中度盐碱土三个处理玉米花粉中BADH酶活 性分别下降到初始量的37.2%、32. 8 %和28. 3 %，第IOd时减少到初始量的15. 7 %、11. 6 % 和10. 1%，到第15d时，减少到初始量的7.6%，3. 5%和2. 5%，第30d时，普通耕土样品中 BADH酶活性减少到初始量的1. 3%，其他两个处理中检测不到BADH的活性，到第60天时， 各处理中BADH酶活性均检测不到，证明BADH蛋白已经降解。试验结果表明，转BADH基因玉 米花粉散落到土壤中，BADH蛋白降解迅速，30天以上基本无活性。随着土壤pH值的升高， BADH蛋白降解的速度加快。
权利要求
一种转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法，其特征是该方法包括如下步骤(1)玉米的种植挑选发育良好转甜菜碱醛脱氢酶BADH基因耐盐碱玉米种子，采用盆栽方式种植，盆深45 55cm，盆直径45 55cm，常规管理；(2)盐胁迫处理在玉米拔节期开始直至玉米植株抽雄，每隔4 7天灌浇氯化钠水溶液，每次灌浇1000ml/盆；(3)采集花粉与盐碱土混合进行花粉降解试验玉米开始散粉后收集0.1g花粉与3.15g土壤充分混匀，放入盖子上打有Ф2mm小孔的50ml离心管中，加入0.965ml蒸馏水，放进人工气候箱，保持黑暗，进行花粉降解试验；(4)甜菜碱醛脱氢酶活性检测在分解30天时取样，提取甜菜碱醛脱氢酶，采用分光光度计法测定甜菜碱醛脱氢酶活性。
2.根据权利要求1所述的转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法，其 特征是步骤(2)中所述的氯化钠水溶液的质量百分浓度为0. 3%。
3.根据权利要求1所述的转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法，其 特征是所述的人工气候箱设定的参数为温度25°C，湿度65% -85%。
全文摘要
本发明涉及一种转甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐碱玉米环境安全性检测方法。有关转基因玉米花粉中外源基因表达蛋白在土壤中的降解存留情况的研究尚未见报道。本发明包括(1)玉米的种植挑选发育良好转甜菜碱醛脱氢酶BADH基因耐盐碱玉米种子，采用盆栽方式种植，常规管理；(2)盐胁迫处理在玉米拔节期开始直至玉米植株抽雄，每隔4-7天灌浇氯化钠水溶液，每次灌浇1000ml/盆；(3)采集花粉与盐碱土混合进行花粉降解试验；(4)甜菜碱醛脱氢酶活性检测在分解30天时取样，提取甜菜碱醛脱氢酶，采用分光光度计法测定甜菜碱醛脱氢酶活性。
文档编号G01N21/31GK101936887SQ20101024685
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者张 林, 王振华, 邸宏 申请人:东北农业大学