专利名称：一种基于铕配合物的一氧化氮荧光探针及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一氧化氮的荧光测定技术领域，具体地说是一种可用于水溶液及生物 体系中一氧化氮荧光测定的铕配合物荧光探针及其应用。
背景技术：
在生物体系中，一氧化氮(NO)能通过生物体自动合成并能在动物、植物、真 菌、细菌体内与其他一些自由基分子或金属蛋白快速反应，从而发挥重要的生理、病理 作用。在生物体内，低浓度的NO作为细胞内及细胞间一种信号传导分子在血液循环、 免疫、神经系统中发挥重要的作用(文献1 :R. Μ. J. Palmer, A. G. Ferrige，S. Moncada， Naturel987，327，524 ；文献 2 :S. H. Snyder，Sciencel992，257，494 ；文献 3 :V. Holan, M. Krulova, A. Zajicova, J. Pindjakova, Mol. Immunol. 2002, 38,989 ；文献 4 :S. Jasid, Μ. Simontacchi, C. G. Bartoli, S. Puntarulo, Plant Physiol. 2006，142，1246)，而当 NO 的 浓度过高时，便与体内其他活性氧物种(ROS)反应产生大量的活性氮物种(RNS)(文献5 F. L. M. Ricciardolo, P. J. Sterk, B. Gaston, G. Folkerts, Physiol. Rev. 2004，84，731)，进而 对核酸、脂肪以及蛋白质等生物分子造成损害。由于NO具有非常重要的生理作用，建立灵敏的NO检测方法，特别是生物体系中的 NO检测方法越来越引起人们的关注。目前，NO检测主要有以下几种方法(1)利用NO是一种自由基特征的磁共振波谱法(文献6 :T. Yoshimura, H. Yokoyama, S. Fujii, F. Takayama, K. Oikawa, H. Kamada, Nat. Biotechnol. 1996,14,992 ；文 献 7 :Y. Katayama, N. Soh, Μ. Maeda, Chem. Phys. Chem. 2001，2，655)，但是，由于 NO 在液相中 半衰期极短，极容易被氧化成其它氮氧化物，使得该方法灵敏度、特异性、稳定性和应用范 围上略有不足。(2)分光光度法，利用NO易被氧化成N02_，进而在酸性条件下与Griess试剂反 应生成重氮化物的方法(文献 8 :L. C. Green，D. A. Wagner, J. Glogowski, P. L. Skipper, J. S. ffishnok, S. R. Tannenbaum, Anal. Biochem. 1982，126，131)，该方法操作简单，但准确
度、灵敏度较低。(3)电化学法，利用NO容易被氧化而发生电化学反应，从而对NO浓度进行测 定的方法(文献 9 :T. Malinski, Ζ. Taha, Naturel992, 358,676 ；文献 10 :F. Bedioui, N. Villeneuve, Electroanal. 2003，15，15)，该方法灵敏度高、电极稳定性好、使用寿命长， 但可用于细胞内NO测定的电极制作困难，且将这种电极插入细胞会对细胞产生较大的损 伤。(4)化学发光法，用氧化剂将NO氧化成二氧化氮后利用激发态二氧化氮返回基态 时释放能量而发光的方法(文献 11 J. F. Brien, B. E. McLaughlin, K. Nakatsu, G. S. Marks, Methods Enzymo 1. 1996，268，83)，该方法灵敏度高，但是操作复杂，而且在操作过程中使用 的氧化剂如臭氧、过氧化氢等对细胞的损害很大，很难用于细胞体系中NO的测定。(5)使用荧光探针的测定法(文献 12 :H. Kojima，N. Nakatsubo, K. Kikuchi,S. Kawahara, Y. Kirino, H. Nagoshi, Y. Hirata, T. Nagano, Anal. Chem. 1998,70, 2446 ；文 献 13 :M. H. Lim, D. Xu, S. J. Lippard, Nat. Chem. Biol. 2006，2，375 ；文献 14 :Ε· W. Miller, C. J. Chang, Curr. Opin. Chem. Biol. 2007,11,620)，该方法具有操作简单、灵敏度高、选择 性好等特点，是目前最为理想的检测方法之一。但目前已有的NO荧光探针所使用的荧光 团都是有机荧光分子，这些有机荧光团存在光稳定性差、易被光漂白、Stokes位移较小，在 用于复杂生物体系测定时易受到体系共存杂质背景荧光干扰等缺点(文献15 :Z. Zhang, S. Achilefu, Org. Lett. 2004，6，2067)。另外，虽然这些荧光探针分子能够穿过细胞膜与细 胞内的NO反应而产生荧光信号，但这些探针分子与NO的反应产物也很容易从细胞中溢出 (文献 16 :L. Ε. McQuade, S. J. Lippard, Curr. Opin. Chem. Biol. 2009，14，1)，从而在荧光测 定时产生误差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、选择性及水溶性好、适用范围广、 可用于水溶液及生物体系中NO荧光测定的铕配合物荧光探针及应用。本发明的技术方案如下以三价铕离子与有机配位体4，- [4- (3，4- 二氨基苯氧基)苯基]-2，2，6，，2 ”_联 三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸形成的配合物(简称DATTA-Eu3+)为一氧化氮荧光探针，其中 所述有机配位体DATTA结构式为 与细胞共培养可进入细胞的三价铕离子与有机配位体4’ -[4-(3，4_ 二氨基苯氧 基)苯基]_2，2’:6’，2”-联三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸的乙酸亚甲基酯形成的配合物为
一氧化氮荧光探针，其中所述有机配位体结构式为 所述基于上述铕配合物的NO荧光探针的应用过程为在各类生物及非生物环境 中，利用所述的铕配合物荧光探针-Eu3+与体系中NO反应生成DATTA的苯并三唑衍生物 4，-[4-(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，:6，，2”-联三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸与Eu3+的 配合物(简称ΒΡΤΤΑ-Eu3+)，导致探针在612nm波长处的荧光强度显著增强，然后通过荧光 测定法确定NO的产生及生成量。所述荧光测定法除了常规的荧光测定法外，还包括时间分 辨荧光测定法、荧光显微镜成像测定法及时间分辨荧光显微镜成像测定法。所述NO测定用铕配合物荧光探针可用于含有其组份的测定试剂盒及相关试剂 中。本发明的荧光探针具有如下优点1.具有很好的水溶性，适用于水溶液中各种化学、生物化学、细胞及生物组织等体 系中NO的测定。2.荧光寿命长，可用于百微秒级的时间分辨荧光测定，以消除背景荧光对测定的 干扰。3.稳定性高，能长期保存使用。4.具有较高的NO测定灵敏度，最低检测下限为8. 4nmol/L。5.对NO有很好的选择性，与其他的活性氧物种作用时荧光信号几乎无变化。6.在生理pH值的水溶液中可迅速与NO反应导致荧光强度增强，其荧光量子效率 增大47倍。7.经溴甲基乙酸酯酯化后在普通培养条件下即可进入活细胞内，特异性地与细胞 内的一氧化氮反应，引起探针的荧光强度显著增强，进而用于活细胞中NO的荧光测定。
图1是有机配位体DATTA的合成路线图。图2是BPTTA-Eu3+与NO的反应原理图及反应前后溶液的荧光颜色变化。图3 是在 pH 值 7. 4 的 0. 05mol/L 硼酸缓冲溶液中 DATTA_Eu3+(2· 0 μ mol/L,实线) 及其与NO反应产物BPTTA-Eu3+(2. 0 μ mol/L，虚线)的荧光光谱图。图 4 是 DATTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)及其与 NO 反应产物 BPTTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)在 不同PH值的0. 05mol/L硼酸缓冲溶液中的荧光强度变化图。图 5 是 DATTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)及其与 NO 反应产物 BPTTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)在不同PH值的0. 05mol/L硼酸缓冲溶液中的荧光寿命变化图。图6是DATTA-Eu3+(0. 1 μ mol/L)在pH值7· 4的0. 05mol/L硼酸缓冲溶液中与各 种活性氧物种(10 μ mol/L)反应产物的荧光强度比较图。图7 是 DATTA-Eu3+(1. 0 μ mol/L)与不同浓度 NO 在 pH 值 7. 4 的 0. 05mol/L 硼酸缓 冲溶液中反应后其产物荧光光谱的变化情况图。图8是DATTA-Eu3+在pH值7. 4的0. 05mol/L硼酸缓冲溶液中检测NO的工作曲线图。图9是DATTA-Eu3+标记的桅子细胞在不同培养时间下的明场成像、荧光成像及时 间分辨荧光成像测定结果图。
具体实施例方式下面结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。本实施例仅用于对本发 明进行说明，基于相同原理和类似原料的方法也属本发明的范围。实施例1 有机配位体DATTA的合成合成路线如图1所示，基体操作过程如下。(1)4，-(4-甲氧基苯基)_2，2，6，，2”_联三吡啶(化合物1)的合成在300mL含有24. 2克(0. 2mol) 2_乙酰基吡啶的溶液中加入20mL的10mol/L氢 氧化钾，室温搅拌30分钟后加入13. 6克的4-甲氧基苯甲醛(0. Imol)，室温继续搅拌15 分钟后再加入150mL的浓氨水。反应液在50°C下搅拌12小时，过滤收集沉淀，用水充分洗 涤后再用少量的冷甲醇洗涤。粗产品经过乙醇重结晶后得到17克的化合物1，产率50%。 1HNMr(CDCI3)测定结果8. 74(s，2H)，8· 69 (d, J = 8. OHz, 2H) ,7. 92-7. 90 (m, 4H), 7. 37 (t, J =6. 4Hz，2H)，7. 04 (d, J = 8. OHz, 2H) ,3. 89(s，3H)。(2)6，6”_ 二腈基-4，-(4-甲氧基苯基)_2，2，6，，2”_联三吡啶(化合物2)的 合成将1. 82克化合物1 (5. 4mmol)溶于IOOmLCH2Cl2后加入3. 70克的间氯过氧化苯甲 酸(m-CPBA，21.4mmol),反应液室温搅拌24小时。用IOOmL的10% Na2CO3水溶液洗涤有机 相2次，再用无水硫酸钠干燥有机相，蒸去溶剂。所得固体真空干燥后溶于40mL的CH2Cl2 中，加入3. 73克的三甲基氰基硅(37. 5mmol)，室温搅拌20分钟后，慢慢滴加入3. 02克的苯 甲酰氯，反应液室温搅拌24小时。蒸去一半的溶剂后，加入30mL的10% K2CO3水溶液，室温 搅拌1小时。过滤收集沉淀，用水充分洗涤后再用少量的CH3CN洗涤，真空干燥。粗产品经二 氧六环重结晶后得到1.40克的目标化合物2，产率67%。1HNMR(CDCI3)测定结果8. 86 (d, J = 8. 4Hz，2H)，8. 79(s，2H)，8· 02 (t，J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 89 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，7· 76 (d, J = 7. 6Hz,2H)，7. 10 (d, J = 8. 4Hz,2H)，3. 92 (s, 3H)。 (3) 4，- (4-甲氧基苯基)-2，2， 6，，2 ” -联三吡啶-6，6 ” - 二甲酸二甲酯(化合物 3)的合成 将1. 56克的化合物2(4. Ommol)加入50mL的40%氢溴酸与25mL的冰乙酸中， 110°c下搅拌反应8小时后反应液倒入200mL的冰水中，过滤收集沉淀，水充分洗涤后真空 干燥。将产物加入到含有在4. 77克氯化亚砜(40. Immol)的120mL甲醇溶液中，搅拌回流 18小时后，减压蒸去溶剂，产物用饱和NaHCO3水溶液及纯水洗涤后，真空干燥。粗产品经二氧六环重结晶后得到1. 17克的目标化合物3，产率64%。1HNMR(CDCI3)测定结果8. 84 (d, J = 8. 0Hz, 2H) ,8. 79(s，2H)，8· 19 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 03 (t, J = 8. OHz, 2H) 7. 88 (d, J = 8. 8Hz，2H)，7. 06 (d, J = 8. 4Hz，2H)，4. 07(s，6H)，3. 90(s，3H)。(4) 6，6”-二羟甲基-4，-(4-甲氧基苯基)-2，2，:6，，2”-联三吡啶(化合物4)的 合成将1. 50克的化合物3 (3. 3mmol)及0. 50克的NaBH4 (13. 2mmol)加入60mL的无水乙醇 中，反应液室温搅拌2小时后，再回流搅拌8小时。减压蒸除溶剂，加入IOmL的饱和NaHCO3 水溶液，回流搅拌10分钟，反应液倒入30mL的冰水中。过滤收集沉淀，用水充分洗涤后再 用少量的CH3CN洗涤，真空干燥，得到1.22克的目标化合物4，产率93%。1HNMR(⑶Cl3)测 定结果8. 68(s，2H)，8· 58 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 89 (t, J = 8. OHz, 2H) ,7. 82 (d, J = 8. 4Hz, 2H)，7. 29 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7. 08 (d, J = 8. 8Hz，2H)，4. 88(s，4H)，4. 06 (br, 2H), 3. 91 (s, 3H)。(5) 6，6”-二溴甲基-4，-(4-甲氧基苯基)-2，2，6，，2”_联三吡啶(化合物5) 的合成将3. 65克PBr3 (13. 5mmol)加入70mL的干燥二甲基甲酰胺，室温搅拌15分钟后 加入2. 17克的化合物4(5. 4mmol)，继续搅拌反应24小时。溶液中加入饱和NaHCO3水溶 液中和，过滤收集沉淀，用水充分洗涤后，再用少量ch3cn洗涤，真空干燥，得到2. 67克的 目标化合物 5，产率 94%。1HNMr(CDCI3)测定结果8. 73 (s，2H)，8. 57 (d，J = 7.6Hz，2H)， 7. 86-7. 92(m，4H)，7. 51(d，J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 08 (d, J = 8. 8Ηζ，2Η)，4· 69 (s，4Η)，3· 91 (s， 3H)。(6) 6，6”-二溴甲基-4，- (4_羟基苯基)_2，2，6，，2”_联三吡啶(化合物6)的 合成在0°C氩气氛围下将含有2. 82克BBr3 (11. 3mmol)的15mLCH2Cl2溶液慢慢滴加入 含有1. 48克的化合物5(2. 8mmol)的130mLCH2Cl2溶液中，反应液在搅拌下逐渐升至室温 并继续搅拌过夜。滴加入80mL的冷水，搅拌30分钟后，过滤收集沉淀，用水充分洗涤，真空 干燥。粗产品经甲醇重结晶后得到0. 71克的目标化合物6，产率49%。1HNMR(DMSO-CI6)测 定结果8. 67(s，2H)，8. 60 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 08 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7. 81 (d，J = 8. 4Hz, 2H),7. 71 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 02 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，4· 87(s，4H)。(7)4，-(4-羟基苯基)-2，2，:6，，2”-联三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸乙酯(化合 物7)的合成在氩气氛围下将0. 13克NaH(5.4mm0l)加入到含有1.02克二乙酸乙酯基胺 (5. 4mmol)的60mL干燥CH3CN中，室温搅拌15分钟后加入1. 15克的化合物6 (2. 2mmol)。室 温搅拌14小时后过滤收集滤液，蒸除溶剂，产物再溶于20mLCHCl3中，用20mL水洗涤CHCl3 溶液2次，无水Na2SO4干燥有机相，蒸除溶剂。粗产物用硅胶柱分离，淋洗剂为1 1的 石油醚-乙酸乙酯，产物再用1 5的乙醇-水重结晶得到0.67克的目标化合物7，产率 41%。1HNMr(CDCI3)测定结果8. 61(s，2H)，8. 53(d，J = 7. 6Hz，2H)，7. 88 (t，J = 7. 6Hz, 2H)，7· 69(d, J = 8. 4Hz，2H)，7· 66(d, J = 8. 0Hz，2H)，7· 97(d, J = 8. 4Hz，2H)，4. 22(s，4H)， 4. 16 (q, J = 7. 2Hz，8H)，3. 70(s，8H)，1. 23 (t, J = 7. 2Hz, 12H)。(8)4，-[4-(3-氨基-4-硝基苯氧基)苯基]_2，2，6，，2” -联三吡啶 _6，6” - 二 甲胺四乙酸乙酯(化合物8)的合成
在氩气氛围下将0.024克NaH(LOmmol)加入到含有0. 73克化合物7 (1. Ommol) 的35mL干燥CH3CN中，室温搅拌15分钟后加入0. 23克的5-氟-2-硝基苯胺(1. 5mmol)。 反应液50°C下搅拌8小时，过滤收集滤液，蒸除溶剂，产物再溶于20mLCHCl3中，用2OmL水 洗涤CHCl3溶液2次，无水Na2SO4干燥有机相，蒸除溶剂。粗产物以2 1的石油醚-乙酸 乙酯为淋洗剂用硅胶柱分离纯化，得到0.71克的目标化合物8，产率82%。1HNMR(⑶Cl3)测 定结果8. 71(s，2H)，8. 56 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 13 (d, J = 9. 6Ηζ，1Η)，7· 92 (d, J = 8. 4Hz, 2H)，7· 88 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7· 65 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7· 22 (d, J = 8. 0Hz，2H)，6· 39 (d, J = 9. 6Hz, 1H), 6. 35 (br, 2H), 6. 27 (s, 1Η), 4. 21 (s, 4Η), 4. 16 (q, J = 7· 2Hz，8Η)，3· 70 (s，8Η)， 1. 24 (t, J = 7. 2Hz, 12Η)。(9)4’ -[4_(3，4-二氨基苯氧基)苯基]_2，2，6，，2”-联三吡啶 _6，6” - 二甲胺 四乙酸乙酯(化合物9)的合成将0. 82克化合物8(0. 95mmol)溶于40mL乙醇后加入0. 05克10%的Pd/C催化 剂，在氩气氛围下滴加入20mL含有1. 0克NaH2PO2 (11. 4mmol)的水溶液，反应液搅拌回流6 小时，过滤除去Pd/C催化剂，滤液减压蒸去溶剂，产物再溶于20mL的CHCl3中，用20mL水洗 涤CHCl3溶液2次，无水Na2SO4干燥有机相，蒸除溶剂。粗产物以1 5的石油醚-乙酸乙 酯为淋洗剂用硅胶柱分离纯化，得到0. 46克的目标化合物9，产率58%。1HNMR(⑶Cl3)测 定结果8. 68(s，2H)，8· 54 (d, J = 8. OHz, 2H) ,7. 86 (t, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 83 (d, J = 8. 8Hz, 2H)，7· 63(d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 09(d, J = 8. 8Hz，2H)，6· 72(d, J = 8. OHz, 1H)，6· 50 (s, 1H)，
6.46 (d, J = 8. OHz, 1Η)，4· 19(s，4H)，4· 16 (q, J = 7. 2Ηζ，8Η)，3· 70(s，8H)，1. 23 (t, J =
7.2Hz,12Η)。(IO)DATTA 的合成在氩气氛围下将0. 46克的化合物9 (0. 55mmol)加入0. 93克K0H_20mL乙醇_5mL 水的溶液中，室温搅拌24小时后，减压蒸去溶剂，产物再溶于15mL水中，用1. Omol/L的盐 酸调节溶液的PH值到2-3，室温搅拌3小时。过滤收集沉淀，用水洗涤后真空干燥。将产 物加入20mL的干燥CH3CN中，搅拌回流10分钟，过滤收集沉淀真空干燥，得到0. 24克的 目标化合物 DATTA，产率 60%。1MR(DMSO-Cl6)测定结果8. 65 (s，2H)，8. 53 (d，J = 7. 6Hz, 2H)，8. 01(t，J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 89 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，7· 62 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 08 (d, J =8. 4Ηζ，2Η)，6. 59 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，6. 35 (s, 1Η)，6. 22 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，4. 10(s，4H)， 3. 57(s，8H)。13CNMR (DMS0-d6)测定结果:172· 93，160. 6，159. 05，156. 0，154. 80，149. 25， 147. 72，138. 42，137. 53，131. 17，128. 79，123. 89，119. 83，117.85，115.99，108.74，106.89， 59. 54，54. 91。元素分析测定结果计算值(C37H35N7O9 · 1. 5H20) =C = 59. 35%,H = 5. 12%, N = 13. 09% ；测定值C = 58. 96%，Η = 5. 08%，Ν = 12. 94%。质谱(ESI-MS)测定结果 m/z = 720. 2[Μ-ΗΓ。实施例2 =DATTA的乙酸亚甲基酯(简称AM-DATTA)的合成在氩气氛围下将11. 58毫克的DATTA · 1. 5Η20(15. 5 μ mol)溶于193微升的二甲 基亚砜中，加入61微升的乙酸溴甲基酯(618 μ mol)及89微升的三乙基胺(617 μ mol)，溶 液室温下搅拌14小时，离心除去微量的不溶物后，上清液即为AM-DATTA的溶液，4°C保存待 用。质谱(ESI-MS)测定结果m/z = 1009.8，[M+H]+。实施例3 =DATTA与NO反应产物(简称BPTTA)的合成
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(1)4，-[4_(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，6，，2” -联三吡啶_6，6” - 二甲胺四 乙酸乙酯(化合物10)的合成将430 毫克 4，- [4- (3，4_ 二氨基苯氧基)苯基]_2，2，:6，，2 ”-联三吡啶 _6，6，，- 二 甲胺四乙酸乙酯(实施例1中化合物9，0. 52mmol)溶于含有63毫克乙酸的4mL水中，5°C 下滴加入含有43毫克NaNO2 (0. 62mmol)的2mL水溶液，5°C下搅拌10分钟后再室温搅拌5 小时。反应液中加入20mL的CHCl3搅拌10分钟，分出有机相。用20mL水洗涤CHCl3溶液 2次，无水Na2SO4干燥有机相，蒸除溶剂。粗产物以1 2的石油醚-乙酸乙酯为淋洗剂用 硅胶柱分离纯化，得到171毫克的目标化合物，产率39%。1HNMR(⑶Cl3)测定结果8. 64(s, 2H)，8· 54 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 93 (d, J = 8. 8Hz, 1Η)，7· 85 (t, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 79 (d, J =8. 4Ηζ，2Η)，7· 60 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 34 (s，1Η)，7· 17 (d, J = 7. 6Hz, 1Η)，7· 12 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，4· 22(s，4H)，4· 15 (q, J = 7. 2Ηζ，8Η)，3· 71(s，8H)，1. 20 (t, J = 7. 2Hz, 12Η)。(2)4，-[4_(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，6，，2” -联三吡啶_6，6” - 二甲胺四 乙酸(BPTTA)的合成将171毫克的化合物10 (0. 20mmol)加入336毫克K0H_20mL乙醇_5mL水的溶液 中，室温搅拌24小时后，减压蒸去溶剂，产物再溶于15mL水中，用1. Omol/L的盐酸调节 溶液的PH值到2-3，室温搅拌3小时。过滤收集沉淀，用水洗涤后真空干燥。将产物加入 IOmL的干燥CH3CN中，搅拌回流10分钟，过滤收集沉淀真空干燥，得到56毫克的目标化 合物 BPTTA，产率 38%。1HnMR(DMSO-CI6)测定结果8. 71 (s，2H)，8. 58 (d，J = 7. 6Ηζ,2Η), 8. 07-8. 00(m，5H)，7· 66 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7· 54 (s，1H)，7· 28-7. 26(m，3H)，4· 20(s，4H)， 3. 68(s，8H)。13CNMR(DMS0-d6)测定结果172. 55，158. 75，158. 23，156. 02，154. 66，149. 10， 138. 63，133. 02，129. 29，128. 67，124. 13，120. 05，119. 54，118. 14，59. 49，54. 90。元素分析 测定结果计算值(C37H32N8O9 · 4H20) =C = 55. 20%,H= 5.01%,N= 13. 92% ；测定值C = 55. 41%, H = 4. 88%, N = 14. 12%0 质谱(ESI-MS)测定结果:m/z = 731. 3[Μ_ΗΓ。实施例4 探针DATTA-Eu3+及其与NO反应产物BPTTA-Eu3+的性质测定(1)光谱性质用ρΗ值为7. 4的0. 05mol/L硼酸缓冲溶液作为溶剂测定了配合物DATTA-Eu3+及 BPTTA-Eu3+(两种配合物中配位体与金属离子的摩尔比为1 1)的紫外可见光谱、荧光光 谱、摩尔消光系数(ε)、荧光量子收率(φ)及荧光寿命(τ)。紫外可见光谱测定用仪器为 Perkin Elmer Lambda 35型分光光度计，荧光测定仪器为Perkin Elmer LS 50B荧光分光 光度计，荧光量子产率使用4’ -苯基_2，2，6’，2”_联三吡-6，6”_ 二甲胺四乙酸与Eu3+ 及Tb3+的配合物作为标准物按文献方法测得(文献16 :M. Latva, H. Takalo, J. Kankare, J. Lumin. 1997,75,149)。测定结果见表 1。表1. DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+在硼酸缓冲溶液中的吸收及荧光性质
化合物最大吸收波 长(nm)^326 nm (Cm-1Iiior1L)最大发光波 长(nm)Φ (%)荧光寿命 (ms)DATTA-Eu3+292,3262.03χ1046120.251.08BPTTA-Eu3+293,3262.05χ10461211.81.30
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由表1可见，探针DATTA-Eu3+与NO反应前后其荧光量子产率发生了很大的变化， DATTA-Eu3+的荧光量子产率只有0. 25%，而BPTTA-Eu3+的荧光量子产率达到了 11. 8%，表 明探针DATTA-Eu3+与NO反应后其量子产率增加了 47倍。DATTA-Eu3+与NO的化学反应式 如图2所示，两种化合物的荧光光谱如图3所示。(2)溶液pH值对DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+荧光性质的影响用不同pH值的0. 05mol/L的硼酸缓冲溶液作为溶剂测定了配合物DATTA-Eu3+及 BPTTA-Eu3+在不同pH值下的荧光强度与荧光寿命，结果见图4及图5。由图4可见，当pH大 于6时，DATTA-Eu3+的荧光非常微弱且稳定，但当pH小于6时，DATTA-Eu3+的荧光随着溶液 酸度的增加而逐渐变强，产生这种现象的原因是在酸性溶液中DATTA的2个氨基可发生质 子化反应，导致其对铕配合物发光部位的光诱导电子转移消光作用减弱。与DATTA-Eu3+相 比，BPTTA-Eu3+在pH小于6的溶液中可发出很强的荧光且强度不受pH的影响，但当pH大 于6时，BPTTA-Eu3+的荧光随着溶液酸度的减小而逐渐变弱，这是由于在碱性溶液中BPTTA 的三唑环上的氢可发生电离形成三唑环负离子，导致其对铕配合物发光部位的光诱导电子 转移消光作用增强。总体来看，在生理PH值范围内，BPTTA-Eu3+与DATTA-Eu3+的荧光强度 比值很大(在pH = 6. 5和pH = 7. 4时两者的荧光强度比值分别为50. 5和47. 4)，说明 DATTA-Eu3+可作为荧光探针用于生理条件溶液中NO的高灵敏测定。另外，图5结果说明 DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+的荧光寿命基本不受溶液pH值的影响。 (3)探针DATTA-Eu3+对NO测定的选择性分别考察了活性物种H2O2、· 0H、0C1_、单线态氧(1O2)、N02_、N03_、0N00_、02_ 以及 NO 与探针DATTA-Eu3+的反应情况，在相同浓度与反应条件(所有反应都在0. 05mol/L的pH值 7. 4的硼酸缓冲溶液中室温下进行，反应时间为1小时，DATTA-Eu3+浓度=0. 1 μ mol/L ；活 性物种浓度= ο μ mol/L)下9种活性物种与DATTA-Eu3+反应产物的荧光强度测定结果如 图6所示(测定仪器为PerkinElmer Victor 1420时间分辨荧光测定仪)。由图6可见， 探针DATTA-Eu3+与H2O2、· OH、0ClV02、N02_、N03_、0N00_、02_反应后的荧光强度没有发生明 显变化，表明DATTA-Eu3+不与这些活性物种发生反应。当DATTA-Eu3+与NO反应后，由于形 成了强荧光性的BPTTA-Eu3+，导致探针的荧光强度显著增强。上述结果表明探针DATTA-Eu3+ 对NO测定具有很好的选择性。实施例5 使用DATTA-Eu3+测定水溶液中NO的浓度在pH值为7. 4的0. 05mol/L硼酸缓冲溶液中分别加入DATTA-Eu3+(0. 1 μ mol/L)和 不同浓度的N0，搅拌反应0.5小时后测定荧光强度。测定用仪器为Perkin Elmer LS 50B 荧光分光光度计，测定结果如图7所示。从图7可以看出，伴随着NO浓度的增加，探针的荧 光强度也逐渐增加，表明DATTA-Eu3+可用于定量测定溶液中生成的NO的浓度。图8给出了使用DATTA-Eu3+检测NO的工作曲线(测定仪器为Perkin ElmerVictor 1420时间分辨荧光测定仪)。如图所示，NO的浓度与荧光强度具有很好的线性关系，用本 底信号标准偏差的3倍计算最低检出限为8. 4nmol/L，表明使用DATTA-Eu3+定量检测NO具 有很高的灵敏度。实施例6 探针DATTA-Eu3+用于植物细胞中内源性NO的荧光成像测定将培养中的桅子细胞过滤收集后加入到含有200 μ mol/L的AM-DATTA及 200 μ mol/L的EuCl3的等渗盐溶液中形成密度为每毫升1. 7 X IO5细胞的悬浮液，在室温下振荡培养。每隔一段时间取一定量的细胞液在4°C下每分钟600转离心5分钟后，用等渗 盐溶液充分洗涤除去未进入细胞的配合物，将洗涤后的细胞置于载玻片上进行明场成像、 荧光成像及时间分辨荧光成像测定(测定用仪器为配有时间分辨荧光成像功能的Nikon TE2000-E 型倒置式荧光显微镜，见文献 17 :B. Song, G. L. Wang，Μ. Q. Tan, J. L. Yuan, J. Am. Chem. Soc. 2006，128，13442)。 图9给出了不同培养时间下桅子细胞的成像测定结果，由图可见，随着培养时间 的增加，细胞发出的荧光也明显增强，表明在培养过程中桅子细胞内可持续产生NO。通过对 细胞的荧光强度分布进行分析，发现细胞核区域的荧光强度要明显高于细胞质区域，说明 植物细胞内NO的生成发生在细胞核区域。另外，与常规荧光成像结果比较可以发现，时间 分辨荧光成像中不存在细胞的背景荧光，表明时间分辨荧光成像测定方式可有效消除生物 样品背景荧光对测定的干扰。
权利要求
一种基于铕配合物的一氧化氮荧光探针，其特征在于以三价铕离子与有机配位体4’ [4 (3，4 二氨基苯氧基)苯基] 2，2’6’，2” 联三吡啶 6，6” 二甲胺四乙酸形成的配合物为一氧化氮荧光探针，其中所述有机配位体结构式为。FDA0000023363620000011.tif
2.根据权利要求1所述的一种基于铕配合物的一氧化氮荧光探针，其特征在于与细 胞共培养进入细胞的三价铕离子与有机配位体4’ _[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]_2，2’: 6’，2”_联三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸的乙酸亚甲基酯形成的配合物为一氧化氮荧光探 针，其中所述有机配位体结构式为
3.权利要求1或2所述一氧化氮荧光探针的应用，其特征在于在各类生物及非生物 体系中，利用所述的铕配合物荧光探针与体系中的NO特异性反应，使得探针的荧光发光显 著增强，然后通过荧光测定法来确定NO的生成量及分布情况；所述荧光测定法包括常规的 荧光分光光度计测定法、时间分辨荧光分光光度计测定法、荧光显微镜成像测定法或时间 分辨荧光荧光显微镜成像测定法。
4.根据3所述的应用，其特征在于所述一氧化氮测定用铕配合物荧光探针用于含有 其组份的测定试剂盒及相关试剂中。
全文摘要
本发明涉及一种可用于一氧化氮特异性荧光测定的新型铕配合物荧光探针及其应用。该探针是以三价铕离子与有机配位体4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’6’，2”-联三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸形成的配合物(简称DATTA-Eu3+)，其中所述有机配位体结构式为该探针在生理pH值的含氧水溶液中可以特异性地与一氧化氮反应，导致探针的荧光强度增加47倍以上，从而实现对体系中一氧化氮的选择性荧光测定。
文档编号G01N21/64GK101921586SQ20101022816
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者叶志强, 王桂兰, 袁景利, 陈永刚 申请人:大连理工大学