专利名称：一种桔霉素人工抗原的制备方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术领域，涉及一种桔霉素与蛋白质载体大分子偶联制备人工抗原的方法。
背景技术：
桔霉素(citrinin，简称CIT)是一种真菌的次级代谢产物，自然界中多种青霉和曲霉都可以产生。它的污染常发生在玉米、小麦等食品及饲料中，能直接或者间接进入食品链，威胁人或动物的健康和生命安全。CIT作用的靶器官是肾脏，毒性较明显，能引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状，还可以致畸、导致肿瘤、 诱发突变，小鼠口服半数致死量LD5tl为110mg/kg。目前CIT的检测方法主要有比色法、薄层层析法(thin layer chromatography, 简称 TLC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，简称 HPLC)和酶联免疫吸附法(enzyme-liked immunosorbent assay，简称ELISA)。前两种方法灵敏度达不到限量检测的要求，而高效液相色谱法的前处理比较复杂、检测费用高、费时费力。ELISA 法的灵敏度高、特异性好、前处理简单、检测成本低，是目前使用最多的免疫学检测方法，且抗原和抗体是免疫分析技术的核心试剂和技术源头。由于CIT是小分子半抗原，只具有反应原性，不具有免疫原性，因此对其进行改造，合成完全抗原是获得抗桔霉素抗体并且建立免疫学检测的关键步骤，但是目前几乎所有关于CIT的免疫学检测都是采用Marmich法合成CIT的完全抗原，但是此法制备CIT完全抗原存在偶联比低、毒素利用率不高等特点。
发明内容
(一 )要解决的技术问题本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足而提供一种CIT-载体蛋白偶联物的合成方法。( 二 )技术方案为达到上述目的，本发明采用的技术方案是将CIT的羟基封阻，使其羧基暴露，经N-羟基琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysuccinimide,简称 NHS)和 N，N，- 二环己基碳酰亚胺(N， N' -dicyclohexylcarbodiimide，简称DCC)的活化，使之能与载体蛋白的氨基进行偶联。
图 ICIT 结构图2CIT与载体蛋白的偶联机理
具体实施例方式实施例18-甲氧基-桔霉素-牛血清白蛋白(8-MeO-CIT-BSA)人工抗原的制备
1. 8-甲氧基-桔霉素(8-MeO-CIT)的制备将Img CIT溶于2. 5mL无水丙酮中，在N2保护下加入等摩尔的K2CO3负载试剂和 (CH3)2S04，58°C避光回流反应他；将反应液溶液旋转蒸发，溶于少量甲醇，用二维薄层层析， 以甲苯、乙酸乙酯、甲酸(7 3 1，ν/ν/ν)和氯仿、甲醇、正己烷(32 1 17，v/v/v)为展开剂，分离目标封阻产物8-MeO-CIT。2. 8-MeO-CIT-BSA人工抗原的制备(1)取0. 5mg 8-MeO-CIT与等摩尔NHS和DCC溶于200 μ L无水四氢呋喃，室温震荡反应池。所得反应液4000r/min离心15min，以无水四氢呋喃洗涤固形物2 3次，合并上清，待四氢呋喃挥发，残留物溶于100 μ L 二甲基甲酰胺。(2)取 5mg 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)溶于 400 μ L 0· 13Μ 的 NaHCO3。(3)将(1)所得缓慢滴入0)，室温振荡反应12h。反应体系溶液中即含偶联物 8-甲氧基-桔霉素-牛血清白蛋白(8-MeO-CIT-BSA)。(4)将(3)所得溶液置于0. 05mol/L pH 7. 4的PBS中透析2d，每间隔4h更换1 次透析液，然后再用去离子水透析ld，将透析袋中的溶液分装，经冷冻干燥，即得到桔霉素人工抗原 8-MeO-CIT-BSA。实施例28-甲氧基-桔霉素-卵清蛋白(8-MeO-CIT-OVA)人工抗原的制备1. 8-MeO-CIT 的制备将Img CIT溶于2. 5mL无水丙酮中，在N2保护下加入等摩尔的K2CO3负载试剂和 (CH3)2S04，58°C避光回流反应他；将反应液溶液旋转蒸发，溶于少量甲醇，用二维薄层层析， 以甲苯、乙酸乙酯、甲酸(7 3 1，ν/ν/ν)和氯仿、甲醇、正己烷(32 1 17，v/v/v)为展开剂，分离目标封阻产物8-MeO-CIT。2. 8-Me0-CIT-0VA 人工抗原的制备(1)取0. 5mg 8-MeO-CIT与等摩尔NHS和DCC溶于200 μ 1无水四氢呋喃，室温震荡反应池。所得反应液4000r/min离心15min，以无水四氢呋喃洗涤固形物2 3次，合并上清，待四氢呋喃挥发，残留物溶于100μ 1 二甲基甲酰胺。(2)取 IOmg 卵清蛋白(ovalbumin, OVA)置于 400 μ 1 0. 13Μ 的 NaHCO3，尽量将其溶解，于8000r/min高速离心lOmin，取上清。(3)将⑴所得缓慢滴入(2)中所得上清，室温振荡反应12h。反应体系溶液中即含人工抗原8-Me0-CIT-0VA。(4)将(3)所得溶液置于0. 05mol/L PH 7. 4的PBS中透析2d，每间隔4h更换1 次透析液，然后再用去离子水透析ld，将透析袋中的溶液分装，经冷冻干燥，即得到桔霉素人工抗原 8-Me0-CIT-0VA。CIT-载体蛋白偶联物的鉴定采用紫外分光光度计对载体蛋白、CIT标品及偶联物进行扫描，根据其特征吸收峰来确定偶联是否成功。结果显示，CIT-载体蛋白偶联物在可见光区有明显吸收峰出现，与CIT的最大吸收峰(319nm)相比有红移现象。根据可见分光光度法，按以下公式，可以计算出CIT与载体蛋白的偶联比。
公式[Aconjugate 319πιιι/ ε CIT 319nm] / [ (AconjUgate 278nm_-^conjugate319niii ^ ￡ CIT278nm/ ￡ CIT319nm) / ￡ protein 278mn]Aconjugate
319nm · 偶联物在319nm的吸光度；Aconjugate
278nm · 偶联物在278nm的吸光度；ε CIT 319nm =CIT在319nm处的摩尔消光系数；ε CIT 278nm :CIT在278nm处的摩尔消光系数；ε protein 319nm 载体蛋白在319nm处的摩尔消光系数；ε protein 278nm 载体蛋白在278nm处的摩尔消光系数。经过计算，CIT与载体蛋白的偶联比在6 1左右，证明成功制备了 CIT完全抗原。核心参考文献[1]胡晓清，陈福生，刑淑婕，刘畅.红曲中桔霉素的薄层层析分析.食品科学， 2003,2 :126-129[2]李云，阎雪秋.红曲与桔霉素.食品与发酵工业，2000，沈:82-86[3]刘仁荣，余宙，何庆华，许杨.抗桔青霉素单克隆抗体的研制与鉴定.卫生研究，2007，36 :190-192[4]许赣荣，陈蕴，虞慧玲.高效液相色谱法测定红曲莫纳可林及桔霉素-如何防治色素的干扰.食品与发酵工业，2002，10 59-60[5]黄祖新，林应椿，郑广乐，林辉煌.HPLC法测定福建红曲中的桔霉素.福建师范大学学报，2003，19 37-39[6]Abramson D,Usleber E,Martlbauer Ε. An indirect enzyme immunoassay for the mycotoxincitrinin. App1. Environ. Microbiol,1995,61(5) :2007-2009[7]Abramson, D. , Usleber, Ε. , Martlbauere, Ε. ,1996. Determination of citrinin in barley by indirectand direct enzyme immunoassay. Journal of AOAC International. 79，1325-1329[8]Abramson, D. , Usleber, Ε. , Martlbauere, Ε. , 1999. Rapid determination of citrinin in corn byfluorescence liquid chromatography and enzyme immunoassay. Journal of AOACInternational. 82,1353—1356[9]Bao-junXu, Xiao-qinjia, Li-juanGu, Chang-keunSung.Review on the qualitative and quantitativeanalysis of the mycotoxin citrinin. food control, 2006,17(4) :271-285[10]Duan,Z. H.，Lin，Z. S.，Yao，H. R.，Gao，Y. H. ,Zhang, K. ,Zhao, S. Q.，Zhu，Z. Y.， 2009. Preparation ofArtificial Antigen and Egg Yolk-derived Immunoglobulin(IgY) of Citrinin for Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay. Biomedical and Environmental Sciences. 22,237-243[ll]Meister, U. New method of citrinin determination by HPLC after polyamide column clean-up. European Food Research and Technology,2004,218 (1) 394-399[12]Rasheva, Τ. V. , Nedeva, T S, et al. Characterization of a non-pigmentproducing Μ. purpureusmutant strain. Applied and Environmental Microbiology, 2003,83(3) :333-340
权利要求
1.一种桔霉素(citrinin，简称CIT)人工抗原的制备方法，其特征在于首先用硫酸二甲酯封阻桔霉素分子的羟基，减少CIT分子内氢键的形成，使其羧基暴露，然后利用活性酯法的原理以N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，简称NHS)和N，N，-二环己基碳酰亚胺(N，N' -dicyclohexylcarbodiimide，简称DCC)将其活化，与载体蛋白质的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥即得到桔霉素人工抗原。
2.按权利要求1所述的CIT人工抗原的制备方法，其特征在于所述的硫酸二甲酯封阻 CIT羟基的过程为将Img CIT溶于2. 5mL无水丙酮中，在N2保护下加入等摩尔的K2CO3负载试剂和(CH3)2S04，58°C避光回流反应他；将反应液溶液旋转蒸发，溶于少量甲醇，用二维薄层层析，以甲苯、乙酸乙酯、甲酸(7 3 1，ν/ν/ν)和氯仿、甲醇、正己烷(32 1 17， ν/ν/ν)为展开剂，分离目标封阻产物8-甲氧基-桔霉素(8-MeO-CIT)。
3.按权利要求1或2所述的CIT人工抗原8-甲氧基桔霉素-牛血清白蛋白 (8-MeO-CIT-BSA)的制备方法，其特征在于所述的CIT封阻产物在两相体系中与载体蛋白质的氨基相连过程为(1)取0.5mg 8-MeO-CIT与等摩尔的NHS和DCC溶于200 μ L无水四氢呋喃，室温震荡反应池。所得反应液4000r/min离心15min，以无水四氢呋喃洗涤固形物2 3次，合并上清，待四氢呋喃挥发，残留物溶于IOOyL 二甲基甲酰胺；(2)取5mg 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)溶于 400 μ L 0. 13Μ 的 NaHCO3 ；(3)将(1)所得缓慢滴入0)，室温振荡反应12h。反应体系溶液中即含桔霉素完全抗原 8-MeO-CIT-BSA。
4.按权利要求1或2所述的CIT人工抗原8-甲氧基桔霉素-卵清蛋白 (8-MeO-CIT-OVA)的制备方法，其特征在于所述的CIT封阻产物在两相体系中与载体蛋白质的氨基相连过程为(1)取0.5mg 8-MeO-CIT与等摩尔的NHS和DCC溶于200 μ L无水四氢呋喃，室温震荡反应池。所得反应液4000r/min离心15min，以无水四氢呋喃洗涤固形物2 3次，合并上清，待四氢呋喃挥发，残留物溶于IOOyL 二甲基甲酰胺；(2)取IOmg卵清蛋白(ovalbumin,OVA)置于400 μ L 0. 13Μ的NaHC03，尽量将其溶解， 于8000r/min高速离心lOmin，取上清；(3)将⑴所得缓慢滴入(2)中所得上清，室温振荡反应12h。反应体系溶液中即含桔霉素完全抗原偶联物8-MeO-CIT-OVA。
5.按权利要求1或3所述的桔霉素(citrinin，简称CIT)人工抗原的制备方法，其特征在于所述的透析、冷冻干燥过程为将最终保留的含偶联物的溶液密闭于透析袋中， 在0. 05mol/LpH 7. 4的PBS中透析2d，每间隔4h更换1次透析液，然后再用去离子水透析ld，将透析袋中的溶液分装，经冷冻干燥，即得到桔霉素人工抗原8-MeO-CIT-BSA或者 8-Me0-CIT-0VA。
全文摘要
本发明涉及一种桔霉素人工抗原的制备方法。该方法根据甲基化反应的原理，先将桔霉素结构中的羟基封阻，减少桔霉素分子内氢键的形成，使其羧基充分暴露，然后利用活性酯法的原理以N-羟基琥珀酰亚胺和N，N’-二环己基碳酰亚胺将其活化，与载体蛋白质的氨基相连，最后通过透析、冷冻干燥即得到桔霉素人工抗原。本发明有益效果是1.能够有效的制备出桔霉素人工抗原，提高偶联物的偶联比；2.提高桔霉素的利用率；3.本方法制备的桔霉素人工抗原具有很好的稳定性。
文档编号G01N21/31GK102329389SQ20101022434
公开日2012年1月25日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者刘爱平, 王小红, 陈福生 申请人:刘爱平, 王小红, 陈福生