专利名称：一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法
技术领域：
一种4-氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
偶氮染料(偶氮基两端连接芳基的一类有机化合物)是纺织品服装在印染工艺中 应用最广泛的一类合成染料，在特殊条件下，它能分解产生20多种致癌芳香胺，经过活化 作用改变人体的DNA结构引起病变和诱发癌症。偶氮是国际环保要求的必检项目之一，检 验方法有以下三种薄层色谱法(TLC)，气相色谱及质谱联用法(GC-MSD)及高效液相色谱 法(HPLC)。标准规定被检产品中不得含有23种偶氮染料中间体，若检出其中一种即为不合 格产品，其限量为30ppm。4-氨基偶氮苯是这些有害芳香胺中的一种，在欧盟公布的偶氮染 料标准中，4-氨基偶氮苯属于禁用芳香胺中的MAK(III)A 2组中的一种。国外大部分现行 相关标准法规都将4-氨基偶氨苯列入禁用芳香胺行列，如德国《食品及日用消费品法》等， 而国内在涉及纺织品、染料、皮革制品的标准都没有将其列入，由于检测技术的限制，常规 的检验方法无法对其进行检测。近年来，国内外已经开展了对偶氮类免疫分析方法的研究， 但国内外尚没有针对4-氨基偶氮苯的酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要制 备4-氨基偶氮苯人工抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法。所制备的产品用 于4-氨基偶氮苯的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。本发明的技术方案一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法，以4-氨基偶氮苯为 半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；(1)人工抗原的制备A液取4-氨基偶氮苯0. Immol溶于2mL 1，4_ 二氧六环中，冰浴，加入IM盐酸调 PH 2. 0，冰浴，加入0. 02M亚硝酸钠至淀粉试纸变蓝，4°C下，搅拌孵育30min，为A液；B液牛血清白蛋白BSA 0. OOlmmol溶于2mL、pH 9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液 中，4°C保存待用，为B液；将A液逐滴加入B液中，调pH 9.0，然后置4°C下温孵半小时，室温反应4小时，即 得4-氨基偶氮苯人工抗原混合液；透析袋前处理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用；将4-氨基偶氮苯人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L (每次2L，共2次)的 0. OlMWpH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液和2 X2L (每次2L，共2次)的去离子水透析3天，最后 使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到4-氨基偶氮苯人工抗原；(2)人工抗原的鉴定4-氨基偶氮苯人工抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准
3曲线，计算其偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然 测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原 理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被 偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光 谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸光系数ε 配制4-氨基偶氮苯浓度为0，10，20，30 μ g.mL—1的0. OlM的PBS 溶液，通过紫外扫描可知4-氨基偶氮苯的最大吸收波长为400nm，在400nm处测吸光值，每 个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为ε =吸光值/摩尔浓度。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0，10，20，40，60，80，100 μ g -πιΓ1的牛血清白蛋 白溶液1. 5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混勻，30°C水浴温热5分钟，每个浓度做平 行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例 稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。偶联比测定配制150μ g · mL-1牛血清白蛋白的20 %乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到150 μ g .mL-1,在400nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，样品溶液、空白液 测出的吸光值分别为A1, A2，则偶联比率Y为γ = [(A1-A2)/ε ]/(150X10—766200)。其中ε为摩尔吸光系数(L ^or1),66200为牛血清白蛋白的分子量，150Χ10—3为 牛血清蛋白浓度(yg'mL-1)。本发明的有益效果本发明合成了 4-氨基偶氮苯的人工抗原，合成步骤简洁，有 效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研 究的需要。
图1 :4_氨基偶氮苯人工抗原制备前后的紫外扫描图。图2 4-氨基偶氮苯人工抗原电泳图。1、BSA ；2、4_氨基偶氮苯-BSA。
具体实施例方式(1)人工抗原的制备取4-氨基偶氮苯0. Immol溶于2mL 1，4_ 二氧六环中，冰浴，加入IM盐酸调pH 2. 0，冰浴，加入0. 02M亚硝酸钠至淀粉试纸变蓝，4°C下，搅拌孵育30min，为A液。牛血清白蛋白BSA 0. OOlmmol溶于2mL、0. 05mol/L CBS缓冲液中，为B液。把A液逐滴滴加入B液中，边加边调pH 9.0，于4°C下孵育半小时，室温反应4小 时，即得4-氨基偶氮苯人工抗原混合液。透析袋前处理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用。将4-氨基偶氮苯人工抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L的0. OlM的PBS溶液和 2X2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到4-氨基 偶氮苯人工抗原。(2) 4-氨基偶氮苯人工抗原的鉴定
摩尔吸光系数ε 配制4-氨基偶氮苯浓度为0，10，20 JOyg^mL-1的0. OlM的 PBS溶液，通过紫外扫描可知4-氨基偶氮苯的最大吸收波长为400nm，在400nm处测吸光 值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为ε =吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε =26749. 8L · mo Γ1。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0，10，20，40，60，80，100 μ g -πιΓ1的牛血清白蛋 白溶液1. 5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混勻，30°C水浴温热5分钟，每个浓度做平 行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例 稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。偶联比测定配制150μ g · mL-1牛血清白蛋白的20 %乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到150μ g · mL—1，在400nm处测吸光值，以20 %乙醇为空白，测出的吸光值为 A1, A2，则偶联比率 Y 为Y = [(A1-A2)/ε ]/(150X10—766200)。本实验计算得 Υ 23其中ε为摩尔吸光系数(L.morOjeZOO为牛血清蛋白的分子量，150Χ10—3为 牛血清蛋白浓度(yg'mL—1)。
权利要求
一种4 氨基偶氮苯人工抗原的合成方法，其特征在于以4 氨基偶氮苯为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比；(1)人工抗原的制备A液取4 氨基偶氮苯0.1mmol溶于2mL 1，4 二氧六环中，冰浴，加入1M盐酸调pH 2.0，冰浴，加入0.02M亚硝酸钠至淀粉试纸变蓝，4℃下，搅拌孵育30min，为A液；B液牛血清白蛋白BSA 0.001mmol溶于2mL、pH 9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液中，4℃保存待用，为B液；将A液逐滴加入B液中，调pH 9.0，然后置4℃下温孵半小时，室温反应4小时，即得4 氨基偶氮苯人工抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将4 氨基偶氮苯人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到4 氨基偶氮苯人工抗原；(2)人工抗原的鉴定4 氨基偶氮苯人工抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。
全文摘要
一种4-氨基偶氮苯人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以4-氨基偶氮苯为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了4-氨基偶氮苯的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对4-氨基偶氮苯研究的需要。
文档编号G01N21/31GK101899109SQ20101021551
公开日2010年12月1日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者季晓丹, 宋姗姗, 林菲, 殷祥刚, 胥传来, 董激文, 许宙, 陈连君 申请人:中华人民共和国无锡出入境检验检疫局