专利名称：利用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的新方法
技术领域：
本发明属于生物技术的植物检测，特别涉及一种利用离体叶片失绿进程快速鉴定 杨树耐盐潜力的新方法。
背景技术：
盐害是影响植物生长和作物产量以及森林面积的主要因素，全世界盐碱地面积为 9. 54亿公顷，并且由于次级盐渍化，世界盐碱地面积还在进一步扩大。林木在维护和改善生 态环境及水土保持方面发挥着重要的作用，随着盐渍化问题的进一步突出，人们对林木耐 盐碱性研究的也越来越重视，希望能通过提高林木耐盐碱性来改善土壤盐渍化问题。杨树 属于杨柳科落叶乔木，是世界上广泛栽培的重要造林树种和防护林之一。杨树在缺林少木 的盐碱、干旱、贫瘠和荒漠地区栽植，可迅速恢复植被，减少风沙危害、降低地下水位、保护 农田、减少地表蒸发，增加森林覆盖率，也为纸浆用材林建设和工业商品林建设提供足够的 原材料。耐盐杨树的选育一直世界各国的研究重点，通过杂交技术、转基因技术和耐盐突变 体筛选，已经获得了许多不同耐盐性的杨树新品种。但由于耐盐能力容易受植株发育阶段、 生长状况、土壤类型和结构、降雨量和蒸发量等许多不可控因素的影响，筛选出可遗传变异 的机会极少，杨树耐盐能力的改良进程极为缓慢。如何准确地鉴别和筛选耐盐的优良基因 型，成为科学家苦苦探索的关键技术。在盐胁迫环境中，杨树逐渐出现生长缓慢、叶片失绿、叶缘褐化、枝条干稍等特点。 所以，对杨树的耐盐碱能力主要是通过比较其存活率、相对生长量、鲜干重比等进行直接的 盐碱地筛选鉴定。但是杨树生长期长，评价生长性状、物候性状、生长期等需要的时间较长， 费时费力，误差大，效率低，而且受环境因素的影响较大，准确性差。在高盐溶液环境中，杨树根系吸收的盐离子随水份运送到地上部分，首先在叶片 中进行积累，积累到一定程度后破坏了叶片的膜系统和叶绿体结构，使叶绿素含量下降，最 后导致叶片细胞死亡，从而出现叶片失绿，逐渐变黄的现象。如果把杨树叶片直接放在盐溶 液中，盐离子可以通过叶柄和叶片切口直接进入叶片细胞，从理论上讲也会对叶片细胞造 成伤害，破坏叶绿体结构，出现叶片失绿，叶绿素含量降低。在相同的盐胁迫环境中，耐盐基 因型的叶片失绿情况和不耐盐的基因型应该有明显的区别。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐 潜力的新方法。快速准确地判断基因型的耐盐潜力，所需材料极少，测定周期短，工作效率 极高。本发明的技术方案是—种用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的新方法，其特征在于利用耐 盐能力不同的杨树基因型，其离体叶片在盐溶液中的失绿进程有很大的差异；采用离体叶 片在高盐溶液中处理，观察测定叶片的失绿情况，能够快速准确地反映基因型的耐盐能力叶片失绿程度大的，叶片细胞受害严重，叶绿素含量低，耐盐能力差；叶片失绿程度小的，叶 片细胞受害较轻，叶绿素丧失速率慢，耐盐能力强。高盐溶液是选择MS液体培养基，添加化学纯的NaCl，溶液浓度一般以200mM、 400mM为宜；离体叶片在高盐溶液中处理时间6天。将离体叶片剪成长1. 5c m,宽1. 5cm的叶盘，置于含有200mM、400mMNaCl的MS培 养液中，6天后观测叶盘失绿情况及叶绿素含量的变化。
本发明效果是利用叶片失绿进程鉴定技术，能够准确判断基因型的耐盐潜力，所需材料少，检测 时间短，工作效率高，具有非常广阔的应用前景。对其他植物耐盐潜力的快速鉴定具有重要 参考价值。本发明具有以下优点和特点1.该技术体系以植物叶片的失绿进程和叶绿素含 量的降低为依据，只需要少量的杨树叶片，通过较短的时间，迅速准确地鉴定出植株的耐盐 能力，具有效率高、重复性好、费用低廉等优点。2.根据叶片失绿进程鉴定技术淘汰大量不 耐盐的基因型，可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提高优良耐盐基 因型的筛选效率，加速耐盐植物育种的步伐。
图1杨树107、18-1叶盘在不同浓度NaCl胁迫6d后的叶盘失绿情况图2杨树107、18-1叶盘在不同浓度NaCl处理下的叶绿素含量变化图片中的叶片失绿进程鉴定试验结果表明，在含有400mM NaCl的MS培养液中放 置6天，耐盐品种18-1的叶盘失绿程度不明显，叶绿素丧失速率比普通品种107低的很多， 107杨叶片失绿程度严重，叶片变黄，叶绿素含量显著降低。说明杨树植株的耐盐能力和叶 片的耐盐能力高度相关，用400mM NaCl溶液进行处理，通过观察叶片失绿程度及测定叶片 叶绿素的含量，能快速、准确地筛选出耐盐杨树植株。
具体实施例方式一种用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的新方法1)杨树叶片在高浓 度氯化钠环境中，叶片细胞受害，叶绿素含量逐渐降低，叶片逐渐失绿变黄，耐盐能力不同 的叶片失绿速率不同。2)将叶片剪成长1. 5cm,宽1. 5cm的叶盘，置于含有200mM、400mM NaCl的MS培 养液中，6天后观测叶盘失绿情况及叶绿素含量的变化，从而判断耐盐能力不同的杨树基因 型。在高盐溶液中处理一定的时间，叶片失绿进程能够快速准确地反映基因型的耐盐能力。针对传统技术鉴定植物耐盐潜力所需时间长、所需材料多、工作效率低的问题，发 明人进行了大量的研究工作，最终建立了利用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的 新方法。以叶片失绿程度及叶绿素含量为依据，可以快速、准确地确定不同基因型的耐盐潜 力，从而筛选耐盐潜力高的优良基因型，在短时间内淘汰大量的无用材料，进而选育出耐盐 的优良杨树新品种。本发明旨在提供一种科学高效的耐盐快速鉴定方法，通过该方法淘汰大量不耐盐 的基因型，实现耐盐基因和高产优质基因的结合，加速耐盐杨树新品种的选育。根据梯度试验确定杨树叶片失绿速度的临界盐浓度
将杨树叶片用剪刀剪成长1.5cm，宽1. 5cm的叶盘，分别置于含有50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600mM NaCl 的 MS 培养液中，6d 后观测其叶盘失绿情
况及叶绿素含量的变化。200mM NaCl处理的叶片失绿程度较轻，叶绿素含量变化不明显； 浓度越高，相同处理时间内的叶片失绿情况及叶绿素含量降低的程度越严重；600mM时由 于浓度过高，叶片细胞死亡，叶片呈棕褐色。400mM NaCl处理，107杨叶片出现严重失绿，叶 绿素含量急剧降低，而且对时间长短的灵敏性较低，可重复性较好；耐盐品种18-1的叶片 失绿程度较轻。因此，我们把400mM作为NaCl胁迫的临界盐浓度。杨树叶片失绿程度临界盐胁迫时间的确定将杨树叶片用剪刀剪成长1. 5cm,宽1. 5cm的叶盘，置于含有400mM NaCl的MS培 养液中，2、4、6、8天后观测其叶盘失绿情况及叶绿素含量的变化。400mM NaCl胁迫2天后， 叶片失绿程度较轻，叶绿素含量变化不明显；胁迫时间越长，相同浓度处理内的叶片失绿情 况及叶绿素含量降低的程度越严重。400mMNaCl处理6天，107杨叶片出现严重失绿，叶绿 素含量急剧降低，而且对时间长短的灵敏性较低，可重复性较好；耐盐品种的叶片失绿程度 较轻。因此，我们把400mM处理6天作为NaCl胁迫的临界时间。叶片失绿与耐盐性的相关性研究叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的试验结果表明，在含有400mM NaCl的MS 培养液中放置6天，耐盐品种18-1的叶盘失绿程度不明显，叶绿素丧失速率比普通品种107 低的很多，107杨叶片失绿程度严重，叶片变黄，叶绿素含量显著降低。说明杨树植株的耐盐 能力和叶片的耐盐能力高度相关，用400mMNaCl溶液进行处理，通过观察叶片失绿程度及 测定叶片叶绿素的含量，能快速、准确地筛选出耐盐杨树植株。施例1 从中科院引进的 IO7 号杨(PopulusXeuramericana ‘Neva，)和转 NTHKl 基因杨树18-1。欧美杨107起源于意大利，是卡萨歹 蒙费拉托杨树栽培研究所SekaWain博士于 1973年进行人工控制杂交选育出来的。107号是中国林科院承担的国家"七五"科技成 果"国外杨树引种及区域化试验"中重点推出的新品种，又名"美丽天使"杨。该项目曾 获得1991年能源部科技进步三等奖，1993年林业部科技进步二等奖，1996年国家科技进步 三等奖殊荣。经近十年的苗期、无性系对比林测试和区域化试验，欧美杨107号表现良好， 适合我国黄河流域、淮河流域及辽河以南流域广泛栽植，成为我国北方包括西北地区防护 林带、用材林的主要造林树种之一。张劲松等(1999)等从烟草中克隆了乙烯受体基因类似物NTHK1，利用pBin438载 体，构建了含有烟草乙烯受体基因NTHKl的植物表达载体，运用农杆菌法，分别将上述载体 转化受体杨树107 (Populus Xeuramericana ‘Neva’ )中，经分子鉴定后，获得转基因植株 30多株。然后，将转基因杨树和受体去叶后分别置于含0. 2%，0. 4%，0. 6%和0. 8% NaCl 中进行耐盐性测试。筛选出耐0. 8% NaCl的NTHKl (烟草乙烯受体基因)转基因杨树新品 系 18-1。取18-1和107杨相同大小枝条，在不同海盐条件下水培，通过生长表现和根系发 育状况进行了对比试验研究，18-1杨能在0. 8%海盐条件下，107杨在0. 4%条件下能正常 生长。以107和18-1—年生扦插株系为材料，从植株顶端起，取第4、5片全展叶，用去离子水冲洗两次，用剪刀剪成长1. 5cm,宽1. 5cm的叶盘，置于含有400mM NaCl的MS培养液 中，6d后观测其叶盘失绿情况及叶绿素含量的变化。在含有400mM NaCl的MS培养液中放 置6天，耐盐品种18-1的叶盘失绿程度不明显，叶绿素丧失速率比普通品种107低的很多， 107杨叶片失绿程度严重，叶片变黄，叶绿素含量显著降低。说明400mM的NaCl溶液能够把 耐盐基因型鉴别出来。
权利要求
一种用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的新方法，其特征在于利用耐盐能力不同的杨树基因型，其离体叶片在盐溶液中的失绿进程有很大的差异；采用离体叶片在高盐溶液中处理，观察测定叶片的失绿情况，能够快速准确地反映基因型的耐盐能力叶片失绿程度大的，叶片细胞受害严重，叶绿素含量低，耐盐能力差；叶片失绿程度小的，叶片细胞受害较轻，叶绿素丧失速率慢，耐盐能力强。
2.根据权利要求1所述的用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的新方法，其特 征在于高盐溶液是选择MS液体培养基，添加化学纯的NaCl，溶液浓度一般以200mM、400mM 为宜；离体叶片在高盐溶液中处理时间6天。
3.根据权利要求1所述的用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的新方法，其特 征在于将离体叶片剪成长1. 5cm,宽1. 5cm的叶盘，置于含有200mM、400mM NaCl的MS培 养液中，6天后观测叶盘失绿情况及叶绿素含量的变化。
全文摘要
一种用离体叶片失绿进程快速鉴定杨树耐盐潜力的新方法。杨树离体叶片在高盐环境中，叶片细胞受害，叶绿素含量逐渐降低，叶片逐渐失绿变黄，耐盐能力不同的叶片失绿速率不同；叶片失绿程度大的，细胞受害严重，叶绿素含量显著降低；通过观测高浓度盐处理对叶片失绿进程及叶绿素含量的影响，从而判断耐盐能力不同的杨树基因型。在高盐溶液中处理一定的时间，叶片的失绿程度及叶绿素含量，能快速准确地反映基因型的耐盐能力。利用离体叶片失绿进程鉴定不同基因型叶片的耐盐潜力，所需实验材料少，测定周期短，工作效率极高，并且能够在控制条件下进行，实验误差小，具有非常广阔的应用前景。
文档编号G01N33/00GK101871926SQ201010190710
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者刘仲齐, 张颖, 杨迎霞 申请人:天津市农业生物技术研究中心