专利名称：一种麝香抗炎活性的检测方法
技术领域：
本发明属于中药活性参数检测技术领域，具体是涉及一种麝香抗炎活性检测方法 的技术。
背景技术：
麝香作为中药具有开窍醒神、消肿止痛、活血调经的功效，临床上广泛用于治疗疮 疡肿毒，咽喉肿痛、跌打损伤等症，抗炎作用被认为是麝香的主要药理活性之一。现有技术在检验中药抗炎活性时，通常采用的药理实验方法是整体动物实验法， 该方法首先通过一些炎症介质致使动物某些部位发生炎症，然后对该炎症部位使用不同抗 炎药物进行对比实现，根据炎症部位的重量、体积等变化判断药物的抗炎活性强度，如小鼠 耳肿胀、大鼠足肿胀实验法等。一般来说，上述整体动物实验法难以给出精确地量化评价， 操作步骤复杂，费用高，干扰因素多，作为麝香的生物效价检测方法具有一定局限性。已有药物分析中发现，环氧酶(C0X)是花生四烯酸(AA)代谢过程中重要的限速酶 之一，C0X有两中结构型，即C0X-1和C0X-2，通过抑制C0X可以减轻炎症反应、从而实现抑 制炎症的发展。因此，cox途径是抗炎药物发挥作用的重要途径之一，然而由于C0X-1选择 性不强，药物对其抑制往往产生许多副作用；相比之下，特异性地抑制C0X-2的功能逐渐成 为研究开发抗炎药物的目标。
发明内容
本发明的目的是为了解决已有整体动物实验法检测中药抗炎活性时，检测结果不 能定量，成本高，操作步骤复杂的缺陷，利用抗炎中药对C0X-2活性抑制强度可以表征待测 品抗炎活性原理，提供了一种测定麝香抗炎活性的方法。实现上述目的本发明的技术方案为，一种麝香抗炎活性的检测方法，该方法包括 以下步骤(1)取麝香提取、提取液配制成不同浓度的溶液为待测品A ；(2)配制系列浓度的前列腺素(PG)标准品溶液B ；(3)配制系列浓度的的阿司匹林溶液作为阳性对照品C ；(4)分别配制背景组，环氧酶II (C0X-2) 100%初始活性组，阳性对照组及麝香供 试品组4种反应体系组；(5)进行环氧酶II(C0X_2)反应步骤即取上述步骤⑷所制得的四组反应液， 混勻，37°C水浴孵育10 20min ；孵育后的四组反应液中均加入10 yl花生四烯酸，混勻， 37 °C水浴孵育2min ；(6)取步骤(5)中经C0X-2反应的四组反应液，加入1M HC1 50 yl，停止水浴，每 组均加入100 U 1饱和SnC12溶液，混勻，室温放置5min ；(7)将步骤(6)所得的四组反应液分别稀释；(8)将步骤(7)获得的一系列前列腺素供试品，采用试剂盒，通过酶免疫法，测定各组反应液吸收度值，并以PG标准品溶液B得到的吸收度标准曲线计算各组反应液中前列 腺素的含量，供试品D、E、F、G的前列腺素含量分别为CD，CE，CF，CG ；(9)根据供试品D、E、F、G的前列腺素含量分别计算阳性对照组抑制率和麝香供试 品组抑制率；(10)根据(9)步得到的阳性对照组抑制率和麝香供试品组抑制率，采用“二剂量” 法对麝香供试品组抑制率进行可靠性检验，从而确定麝香抗炎活性效价。步骤(1)中的溶剂通常采用强极性溶剂，可以选自水、甲醇、乙醇中的一种或两种 以上的混合物，不同浓度待测品A的方法是以20-100倍麝香样品量的强极性溶剂进行分步 提取10-60分钟，滤过，收集滤液；或以20-100倍麝香样品量的强极性溶剂静置提取30分 钟后超声10分钟。步骤(1)、⑵、(3)中的待测品A浓度为大于0%小于100%，前列腺素(PG)标准 品溶液B对数浓度为3. 3、3、2. 7,2. 4,2. 1,1. 8,1. 5,1. 2及阳性对照品C的浓度为大于0% 小于80%。步骤(4)中4种反应体系组的配置方法为背景组反应缓冲液+经高温灭活的C0X-2+抗氧剂，体积比为97 1 1；C0X-2100%初始活性组反应缓冲液+C0X-2+抗氧剂，体积比为97 1 1 ；阳性对照组反应缓冲液+C0X-2+抗氧剂+阳性对照C，体积比为95 1 1 2 ；麝香供试品组反应缓冲液+C0X-2+抗氧剂+待测品A，体积比为95 1 1 2 ；其中，反应缓冲液的配制为Tris_HCl+EDTA+苯酚，并调节pH至8.0，质量比为 1. 6 0. 15 0. 02。步骤(7)中对4种反应体系组的稀释方法为背景组以EIA缓冲液稀释100 倍；C0X-2100%初始活性组以EIA缓冲液稀释1000倍；阳性对照组以EIA缓冲液稀释 1000倍；麝香供试品组以EIA缓冲液稀释1000倍；其中，EIA缓冲液的配制为磷酸盐 +NaCl+BSA+EDTA+叠氮化钠，质量比为 3. 4 23. 3 1. 0 0. 3 0. 1。步骤(9)中的阳性对照组抑制率计算方法为X 100%麝香供试品组抑
Le—ID；
制率计算方法为^^ X 100%。本发明与现有技术相比具有以下有益效果(1)本发明的技术方案克服了目前抗 炎活性实验中整体动物实验方法难以精确给出量化评价，操作步骤复杂、费用高、干扰因素 多的局限性，具有易于操作且结果稳定的优点；(2)本发明的技术方案开创了一种新的检 测中药麝香抗炎活性的方法，通过生物学手段来实现对麝香抗炎活性定性定量的检测。
图1是图IPG标准曲线。
具体实施例方式为便于本发明技术方案的理解，下面结合具体的实施方式进行介绍。(1)取一定量 的麝香样品，向其中加入20 100倍样品量的强极性溶剂进行分步提取10 60分钟，滤
5过、收集滤液；或以20 100倍麝香样品量的强极性溶剂静置提取30分钟后超声10分钟， 滤过、收集滤液，加入不同量强极性溶剂经过上述步骤后所收集的滤液中所得的麝香待测 品A的浓度将不同，从而配制成为一系列不同浓度的待测品A，浓度范围可以是0% 100% 之间，不包括两个端点。这里所使用的强极性溶剂为选自水、甲醇、乙醇中的一种或两种以 上的混合物。(2)配制系列浓度的前列腺素(PG)标准品溶液B，取试剂盒中前列腺素(PG)标 准品冻干粉，加入1ml EIA缓冲液制成lOng/ml的储备液，并用EIA缓冲液稀释成2000pg/ ml(SI)、1000pg/ml(S2)、500pg/ml(S3)、250pg/ml(S4)、125pg/ml(S5)、62. 5pg/ml(S6)、 31. 3pg/ml (S7)、15. 6pg/ml (S8)的标准品溶液，上述溶液的对数浓度为3. 3、3、2. 7、2. 4、 2. 1、1. 8、1. 5、1. 2。(3)配制系列浓度的阿司匹林溶液作为阳性对照品C，精密称取阿司匹林20. Omg, 加反应缓冲液5. 0ml，该缓冲液含0. 1M Tris-HCl、5mM EDTA、2mM苯酚，pH 8.0，超声使溶解， 制成4. 0mg/ml的对照品溶液，并以反应缓冲液稀释成不同浓度的阳性对照品溶液，上述系 列阳性对照品C的浓度为大于0%小于80%，置4°C冰箱中保存备用；(4)分别配制背景组，环氧酶II (C0X-2) 100%初始活性组，阳性对照组及麝香供 试品组4种反应体系组，背景组反应缓冲液+经高温灭活的C0X-2+抗氧剂，体积比为 97 1 1 ;C0X-2100%初始活性组反应缓冲液+C0X-2+抗氧剂，体积比为97 1 1 ； 阳性对照组反应缓冲液+C0X-2+抗氧剂+阳性对照C，体积比为95 1 1 2;麝香供 试品组反应缓冲液+C0X-2+抗氧剂+待测品A，体积比为95 1 1 2;其中，反应缓冲 液的配制为Tris-HCl+EDTA+苯酚，并调节pH至8. 0，质量比为1.6 0. 15 0.02;(5)进行环氧酶II (C0X-2)反应步骤即取上述步骤⑷所制得的四组反应液，混 勻，37°C水浴孵育10 20min ；孵育后的四组反应液中均加入1份花生四烯酸(反应体系 组花生四烯酸=99 1)，混勻，37°C水浴孵育2min;(6)取步骤(5)中经C0X-2反应的四组反应液，加入1M HC1 50 yl，停止水浴，每 组均加入等体积饱和SnCl2溶液，混勻，室温放置5min ；(7)将步骤(6)所得的四组反应液分别稀释，稀释方法如下背景组以EIA缓冲液 稀释100倍；C0X-2100%初始活性组以EIA缓冲液稀释1000倍；阳性对照组以EIA缓冲液 稀释1000倍；麝香供试品组以EIA缓冲液稀释1000倍；(8)将步骤(7)获得的一系列前列腺素供试品，采用试剂盒，通过酶免疫法，测定 各组反应液吸收度值，并以PG标准品溶液B得到的吸收度标准曲线计算各组反应液中前列 腺素的含量，供试品D、E、F、G的前列腺素含量分别为CD，CE，CF，Q ；具体测定各组反应液吸收 度值如下将上一步骤获得的供试品在试剂盒提供的96孔酶标板中进行酶免疫测定，设置 空白孔(Blk)、非特异性吸附孔(NSB)、最大结合孔(B0)、全活性孔(TA)、PG标准品孔(S1 S8)、背景孔(BC)、100%初始活性孔(IA)、麝香供试品孔(AM)，分别在NSB孔中加入100 u 1 EIA 缓冲液和 50 ill PG tracer ；在 BQ 孔中加入 50ii 1 EIA 缓冲液、50 yl PG tracer 和 50 ill PG antiserum ；在PG标准品孔(SI S8)、背景孔(BC)、100%初始活性孔(IA)、麝 香供试品孔(AM)中加入50iU前列腺素(PG)标准品或PGs供试品溶液、50iU PG tracer 和50 ill PG antiserum。用塑料膜盖好酶标板，室温振摇孵育18小时后；用缓冲液洗板5 次，然后每孔分别加入200 ill Ellman试剂，TA孔另加5ii 1 PG tracer，盖好，暗室中振摇孵育30 90min，放入405_420nm酶标仪，测定吸光度，Btl孔的吸光度应在0. 3 0. 8A. U.范 围内(扣除空白)；PG标准品溶液B得到的吸收度标准曲线就是PG标准品孔(Si S8)吸 光度与最大结合孔(Btl)吸光度的比值乘以100得Β/Β0%，如图1，是绘制的PG标准曲线， y = -38. 923x+140. 75，结果表明，在15. 6 2000pg/ml的浓度范围内，Β/Β0%值与PG的 浓度的对数值具有良好的线性关系；将各组反应液吸收度值与标准曲线对比即可得供试品 D、E、F、G的前列腺素含量分别为CD，CE, Cf, Cg ；(9)据供试品D、E、F、G的前列腺素含量分别计算阳性对照组抑制率和麝香供试品
组抑制率，阳性对照组抑制率计算方法为^^ χ 100%麝香供试品组抑制率计算方 (10)根据(9)步得到的阳性对照组抑制率和麝香供试品组抑制率，采用“二剂量” 法对麝香供试品组抑制率进行可靠性检验，从而确定麝香抗炎活性效价。下面具体给出测定的相关结果，表1是图1数据的具体数值。表IPG浓度Β/Β0 %值表 利用阿司匹林对照品和麝香样品对C0X-2抑制作用分别进行了测试，结果见表2。表2不同浓度的麝香和阿司匹林对C0X-2的抑制率
一样品C/mg ml-l抑制率(％ )
~阿司匹林(S) LO 123733 74Λ
2.0 81.183.3 84.9 麝香(T) 10.0 68.970.8 73.9 __200__76.3 77.2__85.3麝香抗炎效价测定以C0X-2抑制率(1% )为指标，以阿司匹林(S)为参照，采用二剂量法计算麝香 (T)的效价，结果见表3。表3麝香抗炎效价测定可靠性检验结果 由表3可见，可靠性检验表明剂间和回归项差异非常显著(P <0.01)，偏离平行差 异不显著(P > 0. 05)，因此S和T两条直线呈平行直线关系，可按照平行线原理的方法 计算 麝香的抗炎效价及可信限。研究结果表明，以阿司匹林的效价1000U/mg计算，麝香的效价为81. lU/mg，可信 限率FL = 20. 0%，基本符合生物测定的要求。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员 对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之 内。
权利要求
一种麝香抗炎活性的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)取麝香提取、提取液配制成不同浓度的溶液为待测品A；(2)配制系列浓度的前列腺素(PG)标准品溶液B；(3)配制系列浓度的的阿司匹林溶液作为阳性对照品C；(4)分别配制背景组，环氧酶II(COX-2)100％初始活性组，阳性对照组及麝香供试品组4种反应体系组；(5)进行环氧酶II(COX-2)反应步骤即取上述步骤(4)所制得的四组反应液，混匀，37℃水浴孵育10～20min；孵育后的四组反应液中均加入1份花生四烯酸，混匀，37℃水浴孵育2min；(6)取步骤(5)中经COX-2反应的四组反应液，加入1M HCl 50μl，停止水浴，每组均加入与反应体系组等体积的饱和SnCl2溶液，混匀，室温放置5min；(7)将步骤(6)所得的四组反应液分别稀释；(8)将步骤(7)获得的一系列前列腺素供试品，采用试剂盒，通过酶免疫法，测定各组反应液吸收度值，并以PG标准品溶液B得到的吸收度标准曲线计算各组反应液中前列腺素的含量，供试品D、E、F、G的前列腺素含量分别为CD，CE，CF，CG；(9)根据供试品D、E、F、G的前列腺素含量分别计算阳性对照组抑制率和麝香供试品组抑制率；(10)根据(9)步得到的阳性对照组抑制率和麝香供试品组抑制率，采用“二剂量”法对麝香供试品组抑制率进行可靠性检验，从而确定麝香抗炎活性效价。
2.根据权利要求1所述的麝香抗炎活性的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所用的溶 剂为选自水、甲醇、乙醇中的一种或两种以上的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的麝香抗炎活性的检测方法，其特征在于，步骤(1)中配 置不同浓度待测品A的方法是以20-100倍麝香样品量的溶剂进行分步提取10-60分钟，滤 过，收集滤液；或以20-100倍麝香样品量的溶剂静置提取30分钟后超声10分钟。
4.根据权利要求1所述的麝香抗炎活性的检测方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3) 中的待测品A浓度为大于0%小于100%，前列腺素(PG)标准品溶液B对数浓度为3.3、3、 2. 7,2. 4,2. 1,1. 8,1. 5,1. 2及阳性对照品C的浓度为大于0%小于80%。
5.根据权利要求1所述的麝香抗炎活性的检测方法，其特征在于，步骤(4)中4种反应 体系组的配置方法为背景组反应缓冲液+经高温灭活的COX-2+抗氧剂，体积比为97 1 1 ；COX-2 100%初始活性组反应缓冲液+COX-2+抗氧剂，体积比为97 1 1 ；阳性对照组反应缓冲液+COX-2+抗氧剂+阳性对照C，体积比为95 1 1 2；麝香供试品组反应缓冲液+COX-2+抗氧剂+待测品A，体积比为95 1 1 2；其中，反应缓冲液的配制为Tris-HCl+EDTA+苯酚，并调节pH至8. 0，质量比为 1. 6 0. 15 0. 02。
6.根据权利要求1所述的麝香抗炎活性的检测方法，其特征在于，步骤(7)中对4种反 应体系组的稀释方法为背景组以EIA缓冲液稀释100倍；COX-2 100%初始活性组以EIA 缓冲液稀释1000倍；阳性对照组以EIA缓冲液稀释1000倍；麝香供试品组以EIA缓冲液稀 释1000倍；其中，EIA缓冲液的配制为磷酸盐+NaCl+BSA+EDTA+叠氮化钠，质量比为 3. 4 23. 3 1. O 0. 3 0. 1。
7.根据权利要求1所述的麝香抗炎活性的检测方法，其特征在于，步骤(9)中的f T I. T7阳性对照组抑制率计算方法为；^厂X 100%麝香供试品组抑制率计算方法为lE-lD；^^ X 100% gE-CD。
全文摘要
本发明公开了一种麝香抗炎活性的检测方法，方法包括待测品溶液的制备和对照品的制备，根据待测品对环氧酶Ⅱ(COX-2)产生的抑制作用，通过所建立的麝香抗炎活性效价测定方法，评价麝香质量，即，采用酶免疫测定法，测定麝香作用前后COX-2催化的由花生四烯酸(AA)生成前列腺素(PGs)量的变化，从而给出麝香对COX-2的抑制作用量效关系。根据测定结果，按照“二剂量”法进行可靠性检验及效价计算，获得麝香的抗炎活性效价。本发明首次建立了麝香的抗炎活性的生物测定方法，具有在检测过程中所受干扰因素少、操作简单、节约经费并可独立特异性表征麝香抗炎活性的优点。
文档编号G01N33/53GK101865914SQ20101018534
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者周健, 温瑞卿, 罗云, 肖小河, 赵艳玲, 金城 申请人:中国人民解放军第三〇二医院