专利名称：抗m3型受体变构肽抗体测定在干燥综合征诊断中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及胆碱能M3型受体变构肽的制备及其作为抗原在检测干燥综合征及其 它疾病中的应用。
一背景技术：
干燥综合征(Sjogren's Syndrome, SS)是一种以侵及泪腺和唾液腺等外分泌腺为 特征的全身性自身免疫疾病。该病最常见的临床表现为眼干、口干，并可累及肺、肾脏、淋巴 系统、血管及肝脏等器官。此病无明显的地区分布差异，可发生于任何年龄，以40-60岁， 特别是绝经后的女性居多，男女之比为1 9。在我国的患病率为0.77%，在老年人群中 的患病率高达4%，全国有近800万患者。干燥综合征可分为原发性干燥综合征(Primary Sjogren，s syndrome)禾口继发性干燥综合征(Secondary Sjogren，s syndrome)两类。该 病单独发生时，称为原发性干燥综合征；与其它诊断明确的自身免疫性疾病如类风湿关节 炎(rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疫(systemic lupus erythematosus, SLE) 等合并存在时，称为继发性干燥综合征。近年来，人们对干燥综合征的病因及发病机理进行了大量研究，但至今无突破性 进展。目前在临床上尚未发现理想的血清学诊断方法，除临床症状外，主要靠唇腺活检及 腮腺造影等有创检查明确诊断，由于患者的医从性差，常常延误诊断，并丧失最佳的治疗时 机。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的检测方法，对干燥综合征的早期诊 断及治疗具有重要意义。为此，本发明人经过多年研究发现了可以用于干燥综合征早期 诊断的血清学特异性抗原——胆碱能M3型受体变构肽(altered M3 receptor peptide, AM3RP)，该变构肽可以特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体——抗AM3RP抗 体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如酶联免疫吸附法)检测出来。并且 具有很高的敏感性和特异性。二、发明概述本发明的目的之一是提供能够有效检测干燥综合征的特异性抗原——AM3RP。本发明的另一目的是提供所述的AM3RP在诊断干燥综合征中的用途。最后，本发明提供了将含有所述AM3RP及类似物做为抗原用于检测干燥综合征的 方法。本发明所用术语“AM3RP”指具有共同序列CLFWQYFVGKRTVPPGEC (即Cys-Leu-Ph e-Trp-Gln-Tyr-Phe-Val-Gly-Lys-Arg-Thr-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Cys 半胱氨酸-亮氨 酸_苯丙氨酸_色氨酸_谷氨酰胺_酪氨酸_苯丙氨酸_缬氨酸_甘氨酸_赖氨酸_精氨 酸_苏氨酸_缬氨酸_脯氨酸_脯氨酸_甘氨酸_谷氨酸_半胱氨酸)的氨基酸、多肽类 似物及蛋白。胆碱能M3型受体是一种主要分布于外分泌腺及平滑肌的胆碱能受体，也是一种 G-蛋白偶联受体。它结合胆碱能神经释放的神经递质——乙酰胆碱，激活磷脂酶C、A2、D 通路，电压依赖性钙通道开放，使钙内流增加，细胞内钙的浓度升高，cAMP增加，引起腺体分泌和平滑肌收缩。近年来的研究发现SS患者血清中的抗胆碱能M3型受体抗体可以识别并 激活M3型受体，该抗体与M3型受体的长期结合，不仅降低胆碱能M3型受体对乙酰胆碱的 敏感性，还造成M3型受体的进行性破坏，导致受体的降解，进而影响信号传导通路、干扰水 通道蛋白的分布，致使SS患者出现腺体分泌减少、膀胱逼尿肌收缩力减弱等胆碱能神经功 能异常的临床表现。1996年，Bacman等报道[1] 了 SS患者血清中存在着抗胆碱能M3型受体抗体，并进 一步指出该抗体对于SS的诊断具有较高的特异性。该文献中选用的是大鼠腮腺的膜蛋白 提取物，是一种混合的蛋白成分。该文献中通过测定一种可以结合所有M型受体的已知标 记蛋白的含量，来间接计算M3受体的含量；而且大鼠M3受体用于检测SS患者的特异性较 差。国外至今也没有这方面大样本的临床研究，而且国内外都没有建立切实可行的该抗体 的临床检测方法。本小组经过多年研究发现了可以用于干燥综合征诊断的血清学特异性抗原—— 抗胆碱能M3型受体，该蛋白可以特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体——抗 胆碱能M3型受体抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如免疫印迹法) 检测出来，并且具有很高的敏感性和特异性。本发明目的是提供有效检测干燥综合征特异性抗原的检测方法，并应用于干燥综 合征的诊断。基于以上研究，本发明人将M3受体序列205-221之间的17个氨基酸的亮氨酸的 末端加上一个半胱氨酸，与221位的氨基酸构成一 18个氨基酸的环状多肽。
(pLFWQYFVGKRTVPPGEj(艮口 Cys-Leu-Phe-Trp-Gln-Tyr-Phe-Val-Gly-Lys-Arg-Thr-Val-Pro-Pro-Gly-G Iu-Cys 半胱氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸_色氨酸_谷氨酰胺_酪氨酸_苯丙氨酸_缬氨 酸_甘氨酸_赖氨酸_精氨酸_苏氨酸_缬氨酸_脯氨酸_脯氨酸_甘氨酸_谷氨酸_半 胱氨酸)合成环状变构肽作为抗原，用ELISA的方法检测干燥综合征、类风湿关节炎、系统 性红斑狼疮及正常人血清中的抗胆碱能M3型受体抗体，从而达到通过血清学的方法诊断干燥综合征的目的，为干燥综合征的临 床诊断提供客观的实验室依据。本发明的AM3RP及其类似物可通过多种方法(例如酶联免疫吸附法、免疫印迹 法、金标记法等)对干燥综合征患者进行检测，其检测方法为本领域技术人员所熟知的。同 时，检测的M3型受体抗体类型可为IgG型、IgA型或其它类型的免疫球蛋白。本发明所述的AM3RP可以用本领域人员所熟知得方法得到，例如固相合成法、基 因工程表达纯化法等。
图1. ELISA检测原理示意图。图2.由图可见，ELISA方法检测抗AM3RP抗体IgG的吸光度(OD)在pSS、sSS、RA、 SLE及正常对照组中的平均值分别为0. 85,0. 62,0. 25,0. 31,0. 27。在SS患者组中抗体吸光度平均水平明显高于其它结缔组织病和正常人对照组(P均< 0. 05或< 0. 01)。图3.由图可见抗AM3RP抗体在原发性和继发性干燥综合征中的阳性率均明显高 于SLE、RA及正常对照(P < 0. 05或P < 0. 01)。
图4.由图可见，在原发性干燥综合征中抗AM3RP抗体的敏感性和特异性分别为 85. 1%,91% ；而抗M3RP抗体的敏感性和特异性分别为45%，88%。由此可见，以M3型受 体变构肽作为抗原能明显提高检测的敏感性(P < 0. 05或P < 0. 01)。
具体实施例方式实施例1AM3RP的设计及合成前述的研究工作(1_4)已经证明，从sigma公司购进sf9细胞真核表达的人胆碱能 M3型受体蛋白能够特异性的结合干燥综合征患者体内的胆碱能M3型受体蛋白抗体，然后 通过特定的方法可以将其检出。本发明的试验中首先利用Flechsler等⑸报道的固相合 成法合成了一条共18个氨基酸的AM3RP，其序列如下 ( S卩 Cys-Leu-Phe-Trp-Gln-Tyr-Phe-Val-Gly-Lys-Arg-Thr-Val-Pro-Pro-Gly-G Iu-Cys)研究表明上述AM3RP具有能特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体 的作用，对干燥综合征的诊断具有重要的意义。实施例2AM3RP对干燥综合征患者血清中抗体的检测本研究采用酶联免疫吸附法(即ELISA法)对干燥综合征、类风湿关节炎(RA)、系 统性红斑狼疮(SLE)患者血清中的抗M3型受体抗体进行检测，以评价该变构肽抗体在各种 疾病中的分布。首先将AM3RP包被于酶联免疫吸附微孔板上，与待测血清一起孵育，如果血清中 存在抗AM3RP抗体，该抗体就会与包被的固相抗原结合，形成抗原_抗体复合物。将未 结合的抗体及其它成分冲洗干净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体 (IgG-HRP) 一起孵育，此时IgG-HRP就会与抗原-抗体复合物结合，形成抗原-抗体-酶标 抗体复合物，洗去未结合的成分，加入底物，若血清中含有抗AM3RP抗体，则会显出特定的 颜色，且抗体滴度越高颜色越深。加终止液后在450nm波长下测定OD值。检测原理示意图 见图1。本研究共检测78例原发干燥综合征(pSS)，16例继发干燥综合征(sSS)，80例类 风湿关节炎(RA)，80例系统性红斑狼疮，17例系统性硬化及200例正常人血清中的抗M3受 体变构肽抗体。采用待测标本OD值(A值)>正常人平均OD值(X) 士2X标准差(2s)为 阳性阈值。本实施例主要通过以下几个方面阐明本发明变构肽在干燥综合征患者诊断中的 意义1、AM3RP抗体敏感性在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、其他结缔组织 病及正常人的比较本研究用ELISA方法检测了 AM3RP抗体在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人的阳性率，见表1。应用u检验比较各组数据，结果显示，AM3RP抗体在原发和 继发性干燥综合征的敏感性显著高于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、其他结缔组织病和 正常人，P值均< 0. 05。原发和继发性干燥综合征的AM3RP抗体的敏感性相近，无统计学差 异。而AM3RP抗体在系统性红斑狼疮和类风湿关节炎的敏感性显著高于正常人(ρ < 0. 05)。表1. AM3RP抗体IgG在结缔组织性疾病中的敏感性 注P值为各组AM3RP抗体的灵敏性与原发性SS组灵敏性的比较2. AM3RP抗体在不同疾病中的滴度比较ELISA方法检测AM3RP抗体IgG的吸光度(OD)在pSS、sSS、RA、SLE及正常对照组 中的平均值分别为0. 85,0. 62,0. 25,0. 31,0. 27。在SS患者组中抗体吸光度平均水平明显 高于其它结缔组织病和正常人对照组(图2)。3、AM3RP抗体_IgG，IgA, IgM三种亚型在SS中阳性率的比较为了验证以合成的AM3RP抗原检测SS患者自身抗体的方法能否应用于区分不同 亚型AM3RP自身抗体的检测，我们同时测定了 33例pSS患者和7例sSS患者的AM3RP抗 体-IgG，IgA和IgM的水平(见表2)，在pSS和sSS中AM3RP抗体IgG的阳性率均明显的高 于AM3RP抗体IgA和AM3RP抗体IgM的阳性率(P < 0. 01)。此夕卜，在pSS患者中AM3RP抗 体IgG阳性的患者IgG的平均水平为28. 23g/L，明显高于阴性患者的11. 25g/L(P < 0. 05)。表2AM3RP自身抗体在SS中的阳性率 注表示为AM3RP抗体IgG的阳性率与AM3RP抗体IgA和IgM阳性率相比P<0. 01
4AM3RP抗体与其他自身抗体在SS检测中的敏感性和特异性的比较AM3RP抗体在pSS患者中的敏感性为84.6%，显著高于抗α -胞衬蛋白抗体、SSA、 SSB及ANA ；AM3RP抗体的特异性也高于抗α -胞衬蛋白抗体、SSA、SSB和ANA(P < 0. 01，见 表3)。此外在抗α -胞衬蛋白抗体阴性、SSA阴性、SSB阴性和ANA阴性的pSS患者中AM3RP 抗体的阳性率分别为85 %，89. 3 %，88. 9 %和95. 2 % (见表4)。表3各种自身抗体在SS中的敏感性和特异性比较 表4AM3RP抗体在抗α -胞衬蛋白抗体，SSA，SSB和ANA阴性的SS患者中的阳性 5、AM3RP抗体IgG与SS患者临床表现及与其他实验室指标的相关性在SS中AM3RP抗体阳性与患者肺间质纤维化，肾小管酸中毒，血小板减少，肝功能 损害的发生率无显著相关性(P > 0. 05)。此外，免疫循环复合物(CIC)，血沉(ESR)，白细胞 和红细胞水平在两组间也无显著性差异(结果未显示)。
权利要求
具有胆碱能M3型受体变构肽序列CLFWQYFVGKRTVPPGEC(即Cys-Leu-Phe-Trp-Gln-Tyr-Phe-Val-Gly-Lys-Arg-Thr-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Cys半胱氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸-赖氨酸-精氨酸-苏氨酸-缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-半胱氨酸)的多肽及多肽类似物。
2.权利要求1的胆碱能M3型受体变构肽及其类似物在诊断干燥综合征中的应用。
3.权利要求1的胆碱能M3型受体变构肽及其类似物在制备M3抗体检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种M3型受体变构肽及其类似物用于干燥综合征的检测。这种变构肽抗原可特异性地结合干燥综合征患者体内的特异性抗体，具有很高的敏感性和特异性。
文档编号G01N33/53GK101880317SQ20101017515
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者何菁, 李英妮, 栗占国 申请人:北京大学人民医院