专利名称：检测一种序列特异性表位抗体的elisa试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，涉及一种ELISA (酶联免疫吸附测定法)检测方法， 具体为检测识别蛋白质N末端、C末端以及中间位置Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys特 异性氨基酸序列抗体的ELISA方法。
背景技术：
由氨基酸序列 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)组成的序列表位 在很多文献中被称为FLAG标签表位，它是人工设计的一种连续线性序列表位，被成功得 应用于重组蛋白的识别和分离纯化，而识别这一序列的标签抗体通常被称为FLAG标签抗 体，已经广泛应用于各种含FLAG标签序列的重组蛋白实验中。但是，由于重组蛋白中所含 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列的氨基酸位置分为三种蛋白质的 N-末端、中间位置和C-末端，因此所产生的抗体也因此分为三种识别N-末端的抗体、识 别中间位置的抗体、识别C-末端的抗体。并且，目前市场上也存在着这三种不同的商业抗 体，这给应用带来了的麻烦。为了能够有效鉴别三种不同识别位置的FLAG抗体，我们开发 了检测识别这三种位置的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)标签抗体 ELISA 试剂盒，该试剂盒能够有效鉴别以上三种不同识别位置的抗体，从而方便了后续的应用。ELISA是一种成熟的免疫分析方法，具有特异、灵敏、经济和快速方便的优点，在临 床医学和检验医学等诸多方面得到十分广泛的应用，因此，本试剂盒采用ELISA的方法来 检测三种不同识别位置的抗体，是考虑了多方面的优点。目前，国际上还没有专门用于检测Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)标签抗体的试剂盒，因此，该试剂盒的开发和应用，是填补了这方面的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测程序简便的检测样本中识别 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特异性表位的抗体浓度和该抗体所识 别的表位在蛋白质上的位置(N末端、中间位置和C末端)的ELISA试剂盒及其制备方法。本发明的目的是通过以下方法实现的首先我们用化学合成方法合成了用于检测 的六种多肽(上海吉尔生化有限公司合成)。其中NA、CA和MA肽段是用来与酶标板上预先包 被好的HBsAg蛋白特异性结合的，这三种多肽均含有Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu 序列，这一序列是用噬菌体表面展示技术筛选出的能特异性结合HBsAg蛋白的肽段。NA肽 段在多肽的N末端含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位，CA肽段在多 肽的C末端含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位，MA肽段在多肽的中 间位置含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位。在ELISA检测中，我们 使用了双抗原(表位)夹心法来检测识别这一不同位置表位的抗体。NA、CA和MA肽段分别是双抗原夹心法中使用的一种抗原表位，另一对应的抗原表位是NB、CB、MB肽段。也就是 说，NA和NB肽段共同构成双抗原(表位)夹心来检测识别N末端表位的抗体，CA和CB肽段 共同构成双抗原(表位)夹心来检测识别C末端表位的抗体，MA和MB肽段共同构成双抗原 (表位)夹心来检测识别中间位置表位的抗体。NB、CB和MB肽段是生物素标记的三种肽段， NB肽段在多肽的N末端含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位，与NA肽 段相对应，共同构成两个一致的N末端表位，使用双抗原(表位)夹心来检测识别N末端表位 的抗体。CB肽段在多肽的C末端含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表 位，与CA肽段相对应，共同构成两个一致的C末端表位，使用双抗原(表位)夹心来检测识别 C末端表位的抗体。MB肽段在多肽的中间位置含有Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序 列特异性表位，与MA肽段相对应，共同构成两个一致的中间位置表位，使用双抗原(表位)夹 心来检测识别中间位置表位的抗体。我们用商品化的HBsAg蛋白(上海科华生物有限公司)来预先包被酶标板，用封 闭液封闭后，洗涤，干燥，制成预包被板。使用时，将待测样品与NA、NB肽段同时加入孔中 来检测识别N末端表位抗体、或将待测样品与CA、CB肽段同时加入孔中来检测识别C末 端表位抗体、或将待测样品与MA、MB肽段同时加入孔中来检测识别中间位置表位抗体， 经过孵育洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素，避光孵育、彻底洗涤后 再加入底物显示，最后用硫酸终止反应并在450nm处检测吸光度值。通过标准品的浓度 和相应的吸光值绘制标准曲线，待测样品中的抗体浓度就可以通过它的吸光值并对应标 准曲线得到；根据第一步加入NA、CA或MA肽段所代表的孔，就能确定该抗体所识别的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位在蛋白质中所处的位置N末端、C末 端或中间位置。本发明检测识别Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特异性表 位抗体的ELISA试剂盒，其包括以下组成
(1)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mMNaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 值为 7. 4 ；
(2)洗涤液为含0. 05%Tween-20 的 PBS，其成分为 PBS，0. 05%Tween_20 ；
(3)封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；
(4)加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；
(5)反应终止液成分为2MH2SO4 ；
(6)已经包被好HBsAg抗原的酶标板；
(7)与HBsAg抗原特异性结合的三种肽段，浓度为4μ g/ml
a.检测识别N末端Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位抗体的肽 段一NA肽段序列
Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-S er-Thr-LyS-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu ；
b.检测识别C末端Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位抗体的肽 段一CA肽段序列
Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-A sp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ；c.检测中间位置Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位抗体的肽段一 MA 肽段序列Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ；
(8)生物素标记的三种肽段，浓度为4μ g/ml 检测N末端表位抗体的NB肽段(序列B iotin-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)、检测 C 末端表位 抗体的 CB 肽段(序列=Biotin-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp -Asp-Lys)、检测中间位置表位抗体的MB肽段
(序列:Biotin-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)；
(9)辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素，浓度200μ g/ml ；
(10)底物TMB ；
(11)标准品，浓度为100μ g/ μ 1。本发明检测识别Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特异性表 位抗体的ELISA试剂盒的使用步骤如下
(1)在已经包被有HBsAg抗原的酶标板中，加入4μ g/ml的ΝΑ、CA或MA肽段，以100 μ 1/ 孔加入酶标板，4°C孵育12小时；
(2)弃去包被液体，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤三次，加入封闭液PBS_1%BSA 200μ 1/孔，37°C孵育 Ih ；
(3)弃去封闭液，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤一次，加入待测样品或倍比稀释的 标准品50 μ 1/孔，同时加入4 μ g/ml的NB、CB、MB肽段50 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(4)用PBS-1%BSA按照1:1000比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素储 存液，终浓度为200yg/L;
(5)弃去样品和标准品，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤三次，加入稀释好的辣根 过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素50 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(6)弃去辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗 涤三次，加入底物TMB 50 μ 1/孔，37°C避光孵育Ih ；
(7)加入2MH2SO4终止液50 μ 1/孔;
(8)读板酶标仪450nm波长处测OD值；
(9)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；
(10)通过标准曲线和未知浓度样品的OD值计算待测样品中的抗体浓 度；根据第一步加入NA、CA或MA肽段所代表的孔，来确定该抗体所识别的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位在蛋白质中所处的位置N末端、C末 端或中间位置。本试剂盒采用的是ELISA方法中检测抗体比较常用的双抗原夹心法，并对它进 行了改进。传统的双抗原夹心法仅仅检测针对某个蛋白质抗原的抗体，而不针对该蛋白 质抗原上的某个特定的氨基酸序列表位的识别抗体，而本发明将双抗原夹心法进一步 深化到双表位夹心法，以此来检测识别特定的氨基酸序列表位的抗体。在本发明中对 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特异性表位抗体进行检测。特别重要 的是，本发明还能检测针对特定位置表位的抗体，如N末端表位抗体、C末端表位抗体或中
6盒的一个最显著特色和创新。本发明还具有良好的特异性、敏感性和稳定性，操作时间短，成本低。
具体实施例方式本发明中的一些术语与缩写BSA 牛血清白蛋白；Tween-20 吐温20 ;TMB 四甲 基联苯胺；HBsAg 人乙型肝炎表面抗原；OD 吸光度。试剂配方
1.缓冲液
包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mM NaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 1. 8mM KH2PO4, pH 值为 7· 4 ；
洗涤液为含 0. 05%Tween-20 的 PBS，其成分为 PBS，0. 05%Tween_20 ； 封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA ； 加样缓冲液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA ； 反应终止液为2M H2SO4
2.蛋白抗原
商品化的HBsAg (上海科华生物有限公司)
3.多肽表位抗原
本发明中的多肽均由上海吉尔生化有限公司合成。A.与HBsAg抗原特异性结合的三种肽段，浓度为4 μ g/ml
a.检测识别N末端Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位抗体的肽 段一NA肽段序列
三字母缩写序列
Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-S er-Thr-LyS-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu ； 单字母缩写序列 DYKDDDDKSGGGGSGGGGSTKTFTVTE ；
b.检测识别C末端Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位抗体的肽 段一CA肽段序列
三字母缩写序列
Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-A sp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ； 单字母缩写序列 TKTFTVTEGGGGSGGGGSDYKDDDDK ；
c.检测中间位置Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位抗体的肽段一 MA肽段序列
三字母缩写序列
Thr-Lys-Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-A sp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ；
7单字母缩写序列
TKTFTVTEGGGGSDYKDDDDKSGGGGS ；
B.生物素标记的三种肽段，浓度为4 μ g/ml
a.生物素标记的检测N末端表位抗体的肽段一NB肽段序列 三字母缩写序列
Biotin-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ； 单字母缩写序列 Biotin-DYKDDDDKSGGGGS ；
b.生物素标记的检测C末端表位抗体的肽段一CB肽段序列
三字母缩写序列
Biotin-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ； 单字母缩写序列 Biotin-ASGGGGSDYKDDDDK ；
c.生物素标记的检测中间位置表位抗体的肽段一MB肽段序列
三字母缩写序列
Biotin-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Gl y-Gly-Gly-Gly-Ser ； 单字母缩写序列 Biotin-ASGGGGSDYKDDDDKSGGGGS ； 4.酶标板 Nunc八联孔酶标条
本发明检测识别Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)序列特异性表位抗 体的ELISA试剂盒的使用步骤如下
(1)在已经包被有HBsAg抗原的酶标板中，分别加入4μ g/ml的ΝΑ、CA或MA肽段，以 100 μ 1/孔加入酶标板，4°C孵育12小时；
(2)弃去包被液体，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤三次，加入封闭液PBS_1%BSA 200μ 1/孔，37°C孵育 Ih ；
(3)弃去封闭液，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤一次，加入待测样品或倍比稀释的 标准品50 μ 1/孔，同时对应加入4 μ g/ml的NB、CB、MB肽段50 μ 1/孔(已加入NA肽段的 孔中加入NB肽段、已加入CA肽段的孔中加入CB肽段、或已加入MA肽段的孔中加入MB肽 段)，37 °C孵育lh；
(4)用PBS-1%BSA按照1:1000比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素储 存液，终浓度为200yg/L;
(5)弃去样品和标准品，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤三次，加入稀释好的辣根 过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素50 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(6)弃去辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗 涤三次，加入底物TMB 50 μ 1/孔，37°C避光孵育Ih ；
(7)加入2MH2SO4终止液50 μ 1/孔;
(8)读板酶标仪450nm波长处测OD值；(9)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；
(10)通过标准曲线和未知浓度样品的OD值计算待测样品中的抗体浓 度；根据第一步加入NA、CA或MA肽段所代表的孔，来确定该抗体所识别的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位在蛋白质中所处的位置N末端、C末 端或中间位置。
权利要求
检测一种序列特异性表位抗体的ELISA试剂盒，其特征包括以下组成(1)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl， 10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH值为7.4；(2)洗涤液为含0.05%Tween 20的PBS，其成分为PBS，0.05%Tween 20；(3)封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；(4)加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；(5)反应终止液成分为2M H2SO4；(6)已经包被好HBsAg抗原的酶标板；(7)与HBsAg抗原特异性结合的三种肽段，浓度为4μg/mla. 检测识别N末端Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys序列特异性表位抗体的肽段—NA肽段序列Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu；b. 检测识别C末端Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys序列特异性表位抗体的肽段—CA肽段序列Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys；c. 检测中间位置Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys序列特异性表位抗体的肽段—MA肽段序列Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser；(8)生物素标记的三种肽段，浓度为4μg/ml检测N末端表位抗体的NB肽段(序列Biotin Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser)、检测C末端表位抗体的CB肽段(序列Biotin Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys)、检测中间位置表位抗体的MB肽段；(序列Biotin Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Trp Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser)；(9)辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素，浓度200μg/ml；(10)底物TMB；(11)标准品，浓度为100μg/μl。
2.检测一种序列特异性表位抗体的ELISA试剂盒，其使用方法包括以下步骤(1)在已经包被有HBsAg抗原的酶标板中，加入4μ g/ml的ΝΑ、CA或MA肽段，以100 μ 1/ 孔加入酶标板，4°C孵育12小时；(2)弃去包被液体，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤三次，加入封闭液PBS_1%BSA 200μ 1/孔，37°C孵育 Ih ；(3)弃去封闭液，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤一次，加入待测样品或倍比稀释的 标准品50 μ 1/孔，同时加入4 μ g/ml的NB、CB、MB肽段50 μ 1/孔(已加入NA肽段的孔中 加入NB肽段、已加入CA肽段的孔中加入CB肽段、或已加入MA肽段的孔中加入MB肽段)， 37 °C 孵育 Ih ；(4)用PBS-1%BSA按照1:1000比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素储 存液，终浓度为200yg/L;(5)弃去样品和标准品，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗涤三次，加入稀释好的辣根 过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素50 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；(6)弃去辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素，300μ 1/孔PBS-0. 05%Tween20洗 涤三次，加入底物TMB 50 μ 1/孔，37°C避光孵育Ih ；(7)加入2MH2SO4终止液50 μ 1/孔;(8)读板酶标仪450nm波长处测OD值；(9)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；(10)通过标准曲线和未知浓度样品的OD值计算待测样品中的抗体浓 度；根据第一步加入NA、CA或MA肽段所代表的孔，来确定该抗体所识别的 Asp-Trp-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列特异性表位在蛋白质中所处的位置N末端、C末 端或中间位置。
全文摘要
该试剂盒包括已包被有HBsAg抗原的酶标板；与HBsAg抗原特异性结合的三种肽段(该肽段分别包含有处于N末端的DYKDDDDK序列、C末端的DYKDDDDK序列和中间位置的DYKDDDDK序列)；生物素标记的三种肽段；辣根过氧化物酶(HRP)标记的链亲和霉素；底物TMB。其使用包括该试剂盒采用双抗原夹心法原理来检测三种不同的抗DYKDDDDK序列特异性表位抗体。在已经包被有HBsAg抗原的酶标板中加入与HBsAg抗原特异性结合的一种肽段，封闭后加入待检样品、生物素标记的同种相应肽段共孵育；经过彻底洗涤后加入底物TMB溶液反应显色，最后用硫酸终止反应并在450nm处检测吸光度值。通过标准样品的浓度和相应的吸光值绘制标准曲线，待检样品中的抗DYKDDDDK序列特异性表位抗体浓度就可以通过它的吸光值并对应标准曲线得到，并可得出该抗体所识别的序列位置。
文档编号G01N33/68GK101900736SQ201010172689
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月15日 优先权日2010年5月15日
发明者倪润洲, 李小彦, 李左宜 申请人:李小彦;倪润洲;李左宜