专利名称：利用戊二醛诱发红外荧光测定溶液蛋白质浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种测量方法，尤其是一种测定蛋白质浓度的方法。
背景技术：
蛋白质浓度测定是在生命科学研究中经常使用的技术。目前有许多方法用于蛋白 质浓度测定，但是又各有局限经典的紫外分光光度法灵敏度有限；常规的BCA、L0Wry法等 又涉及相对复杂的试剂配制；有的方法，如公开号为CN168774的中国专利操作步骤复杂， 容易引入人为误差，导致测量结果的准确性下降；有的方法，如如欧洲专利G01N33/68A12， 美国专利US2010047913等，将液相层析和质谱联用，虽然提高了检测的灵敏度及准确性， 但是由于层析和质谱设备的昂贵限制了其使用，而且该类方法耗时较长，不易于实现快速 的批处理操作。
发明内容
为了克服现有技术计数成本高昂、操作耗时长等不足，本发明提供了一种测定蛋 白质浓度的方法，成本低廉，操作简便快捷。本发明解决其技术问题所采用的技术方案包括以下步骤1.将待测的未知浓度的实验组蛋白质溶液和1组至少4个已知浓度且浓度不同的 标准组蛋白质溶液各0. 5-2 μ L滴加在硝酸纤维素膜上；2.将硝酸纤维素膜自然晾干；3.将硝酸纤维素膜整个放入质量百分比浓度为0. 10%的戊二醛溶液，将溶 液和硝酸纤维素膜加热至40°C 80°C，并保温5 60分钟；4.用磷酸盐缓冲液(PBS)或水或生理盐水清洗硝酸纤维素膜两次以上；5.使用红外激光扫描成像系统，选择660nm-710nm之间任一波长激光激发，在大 于激发激光波长至少40nm处检测硝酸纤维素膜上各蛋白质溶液斑点的荧光强度；6.结合标准组蛋白质溶液的已知蛋白质浓度与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光 强度!与蛋白质溶液浓度Nia的关系公式I = aXNfe l+b，其中a为一元线性相关系 数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；7.根据标准曲线和实验组蛋白质溶液斑点的荧光强度It5s计算实验组蛋白质溶
液浓度N实验，即N^= (I实验_b)/a。由于通常情况下待测的实验组蛋白质溶液虽然未知浓度，但是其浓度的数量级基 本是可以确定的，因此，所述标准组蛋白质溶液中应至少有一个的蛋白质浓度大于实验组 蛋白溶液浓度，并且至少有一个的蛋白质浓度小于实验组蛋白溶液浓度。否则将导致无法 获得所述的标准曲线，就需要重新调整标准组蛋白质溶液浓度。所述硝酸纤维素膜应当足够大，至少使各蛋白质溶液滴加在其上后形成的斑点之 间不相互重叠干扰。所述的戊二醛溶液采用水或生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)作为溶剂配制。
本发明的有益效果是由于采用戊二醛溶液对点有蛋白质样品的硝酸纤维素膜进行浸泡处理，在起到固定蛋白质作用的同时，利用戊二醛与蛋白质相互作用产生红外荧光 这一现象，结合红外荧光检测设备对蛋白质进行定量，与现有技术相比，本发明体现了降低 成本，提高速度，减少操作时间，利于批量操作。下面结合实施例对本发明进一步说明。
具体实施例方式实施例1 使用本发明所述方法进行蛋白质定量1.牛血清白蛋白(BSA)以未知浓度(实验组)及已知浓度(标准组)1250ng/ μ L>625ng/μ L>312. 5ng/μ L>156. 25ng/μ L>78. 125ng/μ L>39. 06ng/μ L>19. 5ng/μ L> 9. 75ng/ μ L、4. 88ng/ μ L溶液，每个样品2 μ L滴加在硝酸纤维素膜上；2.将硝酸纤维素膜自然晾干；3.将硝酸纤维素膜整个放入戊二醛浓度为0. 的生理盐水溶液中，将溶液加热 到80°C，保温30分钟；4.用水清洗硝酸纤维素膜两次以上；5.使用红外激光扫描成像系统，选择680nm波长激光激发，在大于激发激光波长 720nm处检测样品的荧光强度；6.结合标准组已知蛋白质浓度与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度Iia与蛋 白质浓度&^的关系公式I = aXN +b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通 过标准曲线计算得知；7.根据标准曲线和实验组蛋白质样品的荧光强度计算实验组蛋白质浓度
(N实验)，艮口 N实验=(I实验_b)/a。采用本发明所述的方法对细胞进行计数，在线性范围广，数据结果平行性好，线性 程度高(R2 = 0. 998)，根据所得一元方程及测量样本的720nm处荧光强度，可以快速、准确 的计算出样本中的蛋白浓度。实施例2 使用本发明所述方法进行蛋白质定量1.牛血清白蛋白(BSA)以未知浓度(实验组)及已知浓度(标准组)625ng/ μ L>312.5ng/μ L>156.25ng/μ L>78.13ng/μ L>39.06ng/μ L>19. 5ng/μ L>9. 75ng/μ L> 4. 88ng/ μ L、2. 44ng/ μ L溶液，每个样品1 μ L滴加在硝酸纤维素膜上；2.将硝酸纤维素膜自然晾干；3.将硝酸纤维素膜整个放入戊二醛浓度为的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，将 溶液置于微波炉加热，反应5分钟；4.用磷酸盐缓冲液清洗硝酸纤维素膜两次以上；5.使用红外激光扫描成像系统，选择710nm波长激光激发，在大于激发激光波长 780nm处检测样品的荧光强度；6.结合标准组已知蛋白质浓度与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度Iia与蛋 白质浓度&^的关系公式I = aXN +b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通 过标准曲线计算得知；7.根据标准曲线和实验组蛋白质样品的荧光强度计算实验组蛋白质浓度(N实验)，艮口 N实验=(I实验_b)/a。采用本发明所述的方法对细胞进行计数，在线性范围广，数据结果平行性好，线性 程度高(R2 = 0. 997)，根据所得一元方程及测量样本的780nm处荧光强度，可以快速、准确 的计算出样本中的蛋白浓度。实施例3 使用本发明所述方法进行蛋白质定量1.牛血清白蛋白(BSA)以未知浓度(实验组)及已知浓度(标准组)2500ng/ μ L>1250ng/μ L>625ng/μ L>312. 5ng/μ L>156. 25ng/μ L>78. 125ng/μ L>39. 06ng/μ L> 19. 5ng/ μ L、9. 75ng/ μ L、溶液，每个样品0. 5 μ L滴加在硝酸纤维素膜上；2.将硝酸纤维素膜自然晾干；3.将硝酸纤维素膜整个放入戊二醛浓度为10%的水溶液中，将溶液加热到40°C， 保温60分钟；4.用生理盐水清洗硝酸纤维素膜两次以上；5.使用红外激光扫描成像系统，选择690nm波长激光激发，在大于激发激光波长 740nm处检测样品的荧光强度；6.结合标准组已知蛋白质浓度与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度Iia与蛋 白质浓度&^的关系公式I = aXN +b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通 过标准曲线计算得知；7.根据标准曲线和实验组蛋白质样品的荧光强度(I3^)计算实验组蛋白质浓度
(N实验)，艮口 N实验=(I实验_b)/a。采用本发明所述的方法对细胞进行计数，在线性范围广，数据结果平行性好，线性程度高(R2 = 0. 998)，根据所得一元方程及测量样本的740nm处荧光强度，可以快速、准确 的计算出样本中的蛋白浓度。
权利要求
利用戊二醛诱发红外荧光测定溶液蛋白质浓度的方法，其特征在于包括下述步骤1)将待测的未知浓度的实验组蛋白质溶液和1组至少4个已知浓度且浓度不同的标准组蛋白质溶液各0.5-2μL滴加在硝酸纤维素膜上；2)将硝酸纤维素膜自然晾干；3)将硝酸纤维素膜整个放入质量百分比浓度为0.1％～10％的戊二醛溶液，将溶液和硝酸纤维素膜加热至40℃～80℃，并保温5～60分钟；4)用磷酸盐缓冲液或水或生理盐水清洗硝酸纤维素膜两次以上；5)使用红外激光扫描成像系统，选择660nm-710nm之间任一波长激光激发，在大于激发激光波长至少40nm处检测硝酸纤维素膜上各蛋白质溶液斑点的荧光强度；6)结合标准组已知蛋白质浓度与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I校准与蛋白质溶液浓度N标准的关系公式I标准＝a×N标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；7)根据标准曲线和实验组蛋白质溶液斑点的荧光强度I实验计算实验组蛋白质溶液浓度N实验，即N实验＝(I实验-b)/a。
2.根据权利要求1所述的利用戊二醛诱发红外荧光测定溶液蛋白质浓度的方法，其 特征在于所述的标准组蛋白质溶液中应至少有一个的蛋白质浓度大于实验组蛋白溶液浓 度，并且至少有一个的蛋白质浓度小于实验组蛋白溶液浓度。
3.根据权利要求1所述的利用戊二醛诱发红外荧光测定溶液蛋白质浓度的方法，其特 征在于所述的硝酸纤维素膜大小以使各蛋白质溶液滴加在其上后形成的斑点之间不相互 重叠干扰为准。
4.根据权利要求1所述的利用戊二醛诱发红外荧光测定溶液蛋白质浓度的方法，其特 征在于所述的戊二醛溶液采用水或生理盐水或磷酸盐缓冲液作为溶剂配制。
全文摘要
本发明公开了一种利用戊二醛诱发红外荧光测定溶液蛋白质浓度的方法，将待测的实验组蛋白质溶液和若干已知浓度的标准组蛋白质溶液滴加在硝酸纤维素膜上；晾干后放入戊二醛溶液，加热后清洗；检测样品的荧光强度，根据标准组已知蛋白质浓度与荧光强度绘制的标准曲线和实验组蛋白质样品的荧光强度计算实验组蛋白质浓度。本发明体现了降低成本，提高速度，减少操作时间，利于批量操作。
文档编号G01N21/64GK101846625SQ201010171490
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者何刚, 商澎, 李京宝, 王亮, 骞爱荣 申请人:西北工业大学