专利名称：用高效液相色谱测定水蕨dna甲基化含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA甲基化含量的测定方法，具体是指一种用高效液相色谱测定水蕨DNA甲基化含量的方法。
背景技术：
DNA甲基化已成为分子生物学研究热点之一。有研究表明，逆境(如冷、热胁迫、光 照、干旱、盐胁迫、重金属胁迫)对DNA的甲基化水平会造成影响。DNA甲基化水平在不同组 织和不同生长时期以及不同环境下可能有差异。并且，基因表达活性同DNA胞嘧啶甲基化 程度之间存在负相关性，DNA甲基化程度越低，基因表达活性越高；反之，DNA甲基化程度越 高，基因表达活性也就越低。同时，DNA甲基化对植物生长和发育都有重要影响。如果甲基 化不足或太高，都会导致植物生长发育的不正常和形态异常。因此，研究植物DNA甲基化对 探讨植物生长发育的机制和指导实际生产有重要的意义。水蕨是一种名贵的菜肴。因其为二型叶，造型美观，也常用作园艺观赏植物。同时 它还是重要的药用植物，有活血、解毒、治痞积、痢疾、胎毒和跌打等功效。因此在基础研究 和应用中起了很重要的作用。开展对濒危水生蕨类植物水蕨DNA甲基化水平的研究，有利 于指导水蕨人工栽培条件的优化，促进其正常生长和发育，有利于水蕨的食用、药用和观赏 资源的合理利用与开发，有利于促进“菜蓝子工程”和人民身体健康工作的开展，有利于“两 型社会”的构建。目前，测定DNA甲基化含量的方法有微阵列方法(DNAMicroarray)、基因芯片、和 甲基化敏感扩增多态性(Mthylation-Sensitive Amplified Polymorphism，MSAP)方法，甲 基化敏感性斑点分析(MS-DBA)等多种测定方法，但由于技术复杂，成本高，在实际生产中 很难推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法简单，并且节省成本，又能准确测定水蕨DNA甲基 化含量的测定方法。本发明是通过如下技术方案实现的用高效液相色谱测定水蕨DNA甲基化含量的方法，其步骤包括1)采集待测的水蕨样品并提取样品中的DNA，得到待测DNA样品，溶解于缓冲液后 于-20°C保存备用；2)将待测DNA样品水解并离心，取上层清液，得到待测样品溶液；3)配制胞嘧啶标准样品溶液和5-甲基胞嘧啶标准样品溶液，在相同的高效液相 色谱测定条件下，通过标准样品溶液和待测样品溶液的峰的保留时间和峰面积来确定待测 DNA样品中的DNA甲基化含量。所述高效液相色谱的流动相为质量分数为5%的甲醇溶液， 质量分数为0. 2%的三乙醇溶液和质量分数为94. 8%且摩尔浓度为5mmol/L的戊烷磺酸钠 混合组成，并且用磷酸调节混合溶液PH值到4的混合溶液。
所述流动相的流速为lmL/min。所述高效液相色谱的检测器为紫外检测器，检测紫外光波长为273nm。所述将待测DNA样品水解并离心的方法为，向待测DNA样品加入0.2mmol/L的盐 酸溶液，在80°C水浴上加热水解2h，再加入0. 4mmol/L的氢氧化钠水溶液进行中和，最后在 10000r/min的转速下离心IOmin后即完成待测DNA样品水解并离心的过程。本发明利用高效液相色谱(HPLC)来进行水蕨的DNA甲基化含量的测定，不仅方法 简便，成本较低，并且测定快速准确，定量分析效果较好。通过对水蕨DNA甲基化含量的测 定，可以为分析水蕨的生长发育状况提供了技术上的支撑，有利于指导实际生产与应用。同 时，由于HPLC技术本身已经应用非常广泛，技术相对成熟，并且水蕨中提取DNA也为常规方 法可以达到，因此可以推广应用。
图1为混合标准溶液的HPLC色谱图；图2为待测样品溶液的HPLC色谱图。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明实施例1取江苏吴江太湖水蕨，每株幼嫩叶约50mg，置于密封的塑料袋中用硅胶快速干燥 后，用CTAB法提取水蕨DNA，再用紫外分光光度法检测DNA的纯度和浓度。最后将沉淀DNA 溶于50 μ 1缓冲液TE中，于-20°C下保存备用。取上述待测DNA样品20 μ 1，加入0. 2mmol/ L的HCl溶液20 μ 1，在80°C水浴上水解2h，再加入0. 4mmol/L的NaOH溶液10 μ 1来中和 水解液，在lOOOOr/min的转速下离心lOmin，取上层清液，得到待测样品溶液。称取购于Sigma公司的胞嘧啶(C)标准样品和购于北京鼎国生物技术有限责任公 司的5-甲基胞嘧啶(5MeC)标准样品各15mg，然后各自用甲醇定容5ml，得到标准溶液。
所述用高效液相色谱(HPLC)仪器使用DIONEX公司出品的P680HPLC，检测器型号 为UVD170U，色谱柱型号为TOLCHR0N-C18，检测器波长为273nm，柱温为30°C。流动相为质 量分数为5%的甲醇溶液，质量分数为0. 2%的三乙醇溶液和质量分数为94. 8%且摩尔浓 度为5mmol/L的戊烷磺酸钠混合组成，并且用磷酸调节混合溶液pH值到4的混合溶液，以 lml/min的速度洗脱。由于在273nm的紫外光下，胞嘧啶和5_甲基胞嘧啶的含量和HPLC中相应峰面积 是成正比的。因此吸取含量确定的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的标准样品溶液，可以根据峰面 积的大小来确定胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的保留时间。吸取胞嘧啶标准溶液5 μ 1，5-甲基胞 嘧啶标准溶液2μ 1，用甲醇定容1L，配制成混合标准溶液。混合标准溶液进样量为20μ 1， 通过HPLC仪器测得的色谱图如图1所示。峰1的保留时间为4. 176，峰面积为0. 821，峰2 的保留时间为5. 041，峰面积为0. 330。根据含量和HPLC中相应峰面积是成正比的原理可 知，峰1与胞嘧啶对应，峰2与5-甲基胞嘧啶对应。待测样品溶液进样量为50 μ 1，通过HPLC仪器测得的部分色谱图如图2所示。通过 与标准样品的保留时间对比，可以找到峰3的保留时间为4. 10，与标准样品里胞嘧啶的保留时间4. 176相近，应该对应胞嘧啶。而峰4的保留时间为4. 98，与标准样品里5-甲基胞嘧 啶的保留时间5. 041相近，应对应5-甲基胞嘧啶。而峰3的峰面积为0. 173，峰4的峰面积为 0. 117。由于在273nm的紫外光下，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的含量和HPLC中相应峰面积是 成正比的。因此待测样品溶液中5-甲基胞嘧啶的质量分数为0. 117/(0. 173+0. 117)*100% =40. 3%。从而，该水蕨DNA中的甲基化含量为40. 3%。实施例2
用重金属Cu2+浓度为0. 1和0. 5mmol/L处理杭州临安的水蕨。然后按照实施例1 中相同的方法测定此两种水蕨DNA中的甲基化含量为16. 2%和3. 23%。由此表面随着重 金属浓度的升高，DNA甲基化水平降低，这点与植物的生长 状况一致。
权利要求
用高效液相色谱测定水蕨DNA甲基化含量的方法，其步骤包括1)采集待测的水蕨样品并提取样品中的DNA，得到待测DNA样品，溶解于缓冲液后于-20℃保存备用；2)将待测DNA样品水解并离心，取上层清液，得到待测样品溶液；3)配制胞嘧啶标准样品和5-甲基胞嘧啶标准样品的混合标准样品溶液，在相同的高效液相色谱测定条件下，通过混合标准样品溶液和待测样品溶液的峰的保留时间和峰面积来确定待测DNA样品中的DNA甲基化含量；所述高效液相色谱的流动相为质量分数为5％的甲醇溶液，质量分数为0.2％的三乙醇溶液和质量分数为94.8％且摩尔浓度为5mmol/L的戊烷磺酸钠混合组成，并且用磷酸调节混合溶液pH值到4的混合溶液。
2.如权利要求1所述的用高效液相色谱测定水蕨DNA甲基化含量的方法，其特征在于 所述流动相的流速为lmL/min。
3.如权利要求1所述的用高效液相色谱测定水蕨DNA甲基化含量的方法，其特征在于 所述高效液相色谱的检测器为紫外检测器，检测紫外光波长为273nm。
4.如权利要求1所述的用高效液相色谱测定水蕨DNA甲基化含量的方法，其特征在于 所述将待测DNA样品水解并离心的方法为，向待测DNA样品加入0. 2mmol/L的盐酸溶液，在 80°C水浴上加热水解2h，再加入0. 4mmol/L的氢氧化钠水溶液进行中和，最后在IOOOOr/ min的转速下离心IOmin后即完成待测DNA样品水解并离心的过程。
全文摘要
用高效液相色谱测定水蕨DNA甲基化含量的方法，其步骤包括采集待测的水蕨样品并提取样品中的DNA，得到待测DNA样品，溶解于缓冲液后于-20℃保存备用；将待测DNA样品水解并离心，取上层清液，得到待测样品溶液；配制胞嘧啶标准样品和5-甲基胞嘧啶标准样品的混合标准样品溶液，在相同的高效液相色谱测定条件下，通过混合标准样品溶液和待测样品溶液的峰的保留时间和峰面积来确定待测DNA样品中的DNA甲基化含量。本发明利用高效液相色谱来进行水蕨的DNA甲基化含量的测定，不仅方法简便，成本较低，并且测定快速准确，定量分析效果较好。同时，由于高效液相色谱技术本身已经应用非常广泛，技术相对成熟，并且水蕨中提取DNA也为常规方法可以达到，因此可以推广应用。
文档编号G01N30/74GK101813681SQ20101015443
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者万昆, 张金安, 董元火 申请人:江汉大学