专利名称：脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及elisa检测试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及脑膜炎奈瑟菌的检测，具体是一种脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒。
背景技术：
脑膜炎奈瑟菌是一种革兰氏阴性双球菌，通过呼吸道传染引起的流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是一种对人类危害严重的传染性疾病，此外还可引起菌血症、肺炎、关节炎、 结膜炎、心肌炎、泌尿系统等多种炎症，曾在全球引起多次大流行，在我国几乎每年都有发生，主要在春季或冬春之交易造成流行，是一种常见和多发疾病。脑膜炎奈瑟球菌可分为A、 B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和W 135共13个血清群，对人类致病的多属A、B、C群，其他类群在带菌者中经常发现，但很少致病。我国的流脑流行菌群仍以A群为主，但近年来也发现在某些地区出现C群以及一些新的血清群。
人群中的绝大多数人对脑膜炎奈瑟球菌易感，该菌可寄生于正常人的鼻咽腔内， 处于这种寄生状态的细菌并不导致任何病理变化，亦不引起任何疾病症状。这种带菌状态可以持续1周到数月之久，这种处于潜伏感染状态的带菌者在人群中的比例可高达50% 85%，人群中的带菌者是造成流行性脑脊髓膜炎流行的最重要的传染源，由于脑膜炎奈瑟菌的惟一自然宿主是人，因此，在人群较为密集的场所，容易造成细菌的高效率的传播，特别是在儿童、中小学生为最易感人群，极易在短时间内造成儿童发病流行，所以，控制人群中的带菌者传染源成为控制流脑流行的重要环节之一。
目前国内市场上脑膜炎奈瑟菌的各种免疫诊断试剂盒质量参差不齐，既无统一的质量标准，又在无序生产与应用，给脑膜炎奈瑟菌的预防和诊治造成严重障碍。目前虽有国外试剂商提供同类商品化诊断试剂盒用于检测，但是此种试剂盒价格十分昂贵，限制了临床的广泛使用。本发明将A型和C型脑膜炎奈瑟菌等量混合后全菌抗原包被包被酶标反应板，采用间接ELISA法方便快速地检出血清中特异性脑膜炎奈瑟菌IgM抗体，该检测结果与美国R&D公司流脑A+C型IgM ELISA检测试剂盒一致性高，灵敏度为95%，特异度为 99. 5%。
发明内容
本发明提供了一种脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒，为临床诊断流行性脑脊髓膜炎提供快速、准确、简便的检测工具。
本发明的技术方案为 脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)、在96孔酶标板的每孔内加入0. IM NaHCO3稀释的5%戊二醛200 μ 1，于37°C 温箱中放置60-70分钟，然后用去离子水洗涤96孔酶标板3-5次，甩干，备用； (2)、将A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌等体积混合后，用包被液按 1 1000的体积比稀释后，包被处理后的96孔酶标板，每孔95-105 μ 1 ；然后于37°C温箱中烘干20-25小时； (3)、取过夜烘干的抗原包被96孔酶标板用200 μ 1用PBS稀释的10%小牛血清的填满，然后于35-38°C下封闭1-2小时，得到抗原包被酶标反应板。
所述的脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制备方法，其特征在于所述的 A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌的浓度为2 X 109CfU/ml。
应用脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的ELISA检测试剂盒，其特征在于 所述试剂盒由脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、底物液、终止液构成，具体组份为 (1)、标本稀释液含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液； (2)、洗涤液含有0. 05% Tween 20的磷酸盐缓冲液； (3)、酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗； (4)、底物液=TMB-H2O2尿素溶液； (5)、终止液2mol/L H2SO4 溶液。
所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于 所述的标本稀释液中2%抗人IgG的0.01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液是由NaCl 8. 0g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KCl 0. 2g，硫柳汞 0. lg，加双蒸水至 1000ml，调至 pH7. 4制得； 所述的洗涤液是由NaCl 8. 0g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12Η20 2. 9g、KCl 0. 2g、 Tween-200. 5ml、硫柳汞0. lg、加双蒸水至1000ml，调至ρΗ7· 4制得； 所述的底物液是经200mg 3、3 ‘、5、5 ‘_四甲基联苯胺、IOOml无水乙醇、加双蒸水至IOOOml得底物液A ;Na2HP0414. 60g、柠檬酸9. 33g、0. 75%过氧化氢尿素6. 4ml、加双蒸水至IOOOml，调至pH5. 05. 4得底物液B ；将底物液A和底物液B按1 1-1.2的体积比混合制得； 所述的终止液是由IOOml浓硫酸缓慢滴加引入600ml双蒸水中不断搅拌，然后加双蒸水至900ml制得。
本发明试剂盒的检测结果与美国R&D试剂盒脑膜炎奈瑟菌A+C型IgM ELISA检测试剂盒的一致性高，灵敏度为95%，特异度为99. 5%。
具体实施例方式(1)、试剂 包被液(0. 05mol/L, ρΗ9· 6的碳酸钠_碳酸氢钠缓冲液)=Na2CO3 1. 5g，NaHCO3 2. 9g，Na2N3 0. 2g，加双蒸水至 1000ml，调至 ρΗ9· 6 ； 标本稀释液(含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) ρΗ7· 4)，PBS =NaCl 8. 0g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KCl 0. 2g，硫柳汞 0. lg，加双蒸水至1000ml，调至ρΗ7· 4，即得； 封闭液(10%小牛血清/PRS 溶液)小牛血清 100ml，IXPBS(ρΗ7. 4)900ml ； 洗涤液(PBST,ρΗ7· 4) =NaCl 8. 0g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KC10. 2g、 Tween 200. 5ml、硫柳汞 0. lg、加双蒸水至 1000ml，调至 ρΗ7· 4 ； 酶标二抗(HRP*鼠抗人IgM单抗)辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗； 底物液(TMB-H2O2尿素溶液): ①底物液Α(3、3 ‘、5、5 ‘-四甲基联苯胺，TMB) :TMB200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至IOOOml ； ②底物液B缓冲液(0. lmol/L柠檬酸-0. 2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5. 0 5. 4) =Na2HPO4 14. 60g,柠檬酸9. 33g，0. 75 %过氧化氢尿素6. 4ml，加双蒸水至IOOOml，调至 ρΗ5· 0-5. 4 ； ③「将底物液A和B按1 1混合，即成TMB-H2O2尿素溶液。
终止液(2mol/L H2SO4溶液)双蒸水600ml，浓硫酸IOOml (缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。
(2)、主要仪器 酶标仪:BI0-RAD Model 550 ；ELISA 反应板Corning Incorporated costarR 96 Well EIA/RIA plate。
(3)、方法 酶标二抗最适滴度的选择 取96孔酶标板一块，用lOOng/ml人IgM 100 μ 1/孔4°C包被过夜，洗涤液洗板3 次，350 μ 1/孔，甩干； 将酶标抗人IgM单抗用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，100 μ 1/ 孔，37°C孵育40min，后用洗板3次，350μ 1/孔，甩干； 加底物显色，每孔加入底物液100 μ 1，37°C或室温避光显色15分钟；后加入终止液50 μ 1终止反应、，在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值，取A值在1. 0时的酶标抗体稀释度，作为酶标二抗的最适滴度为1 1000。
棋盘滴定法选择包被抗原最适滴度 取96孔酶标板一块；每孔加入0. lmol/L的NaHCO3稀释的5 %戊二醛200 μ 1， 37°C温箱放置1小时；去离子水洗涤96孔酶标板4次，甩干；将脑膜炎奈瑟菌A与C型 (2X109cfu/ml)等体积混合后，用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，每孔100μ 1 ； 37°C温箱过夜烘干；取过夜烘干的抗原包被板加200 μ 1 PBS稀释的10%小牛血清37°C封闭1. 5小时，得到梯度稀释抗原包被酶标反应板； 将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用标本稀释液按1 100倍稀释，加样，保温，洗涤。
加按最适滴度稀释的酶标抗人IgM单抗，保温，洗涤。
加底物显色，加酸终止反应后在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值； 选择强阳性参考血清的A值为0. 8-1. 0间、阴性参考血清的A值小于0. 2的包被抗原的稀释度作为最适滴度，本试剂盒最适包被脑膜炎奈瑟菌全菌抗原的稀释度为 2X105cfu/ml,100y 1/孔。
脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被反应板的制备方法 取96孔酶标板一块；每孔加入0. lmol/L的NaHCO3稀释的5 %戊二醛200 μ 1，37°C温箱放置1小时；去离子水洗涤96孔酶标板4次，甩干；将脑膜炎奈瑟球菌A与C型 (2X109cfu/ml)等体积混合后，用包被液1 1000稀释包板，每孔100 μ 1 ；37°C温箱过夜烘干；取过夜烘干的抗原包被板加200 μ 1 PBS稀释的10%小牛血清37°C封闭1. 5小时，得到抗原包被酶标反应板； 脑膜炎奈瑟菌IgM型ELISA检测试剂盒，由上述脑膜炎奈瑟球菌全菌包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、底物液、终止液及参考血清构成。
具体分为 标本稀释液含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. OlM pH7. 4的磷酸盐缓冲液 (PBS)； 洗涤液含有0. 05% Tween 20 的 0. 01mol/L ρΗ7· 4的磷酸盐缓冲液(PBST)； 酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗； 底物液=TMB-H2O2尿素溶液； 终止液2mol/LH2SO4 溶液。
利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中脑膜炎奈瑟菌IgM抗体 (1)待检血清，加入用标本稀释液1 100稀释的待检血清到包被好的酶标反应板，100 μ 1/孔，同时另设两孔分别加入强阳性参考血清和阴性参考血清ΙΟΟμ 1/孔，37°C 孵育lh，洗涤液洗板3次，350 μ 1/孔，甩干； (2)加酶标物，加入HRP (辣根过氧化酶)标记的鼠抗人IgM单抗，100μ 1/孔，37°C 孵育40min，洗涤液洗板3次，350 μ 1/孔，甩干； (3)显色，用洗涤液洗板后每孔加入底物液100 μ 1，37 °C或室温避光显色15分钟； (4)每孔加入终止液50 μ 1，终止反应； (5)结果判断，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即OD45tl值，强阳性参考血清的A值需> 0. 8、阴性参考血清的A值需< 0. 2则证明试剂盒结果正确。
(6)计算结果，将待检标本血清平均OD值(P)除以阴性血清平均OD值(N)，求得 P/N值，P/N彡2. 1为阳性，P/N < 2. 1为阴性。
特异性实验 以脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、麻疹病毒IgM 阳性血清、风疹病毒IgM阳性血清、人巨细胞病毒阳性血清和脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM 阴性血清采用脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板ELISA试剂盒检测，P/N值分别为 6. 23,1. 22,1. 15、1.27和1. 06，说明该试剂盒特异性良好。
重复性实验 随机抽取20份脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM阳性、阴性血清分别于不同的时间进行ELISA重复检测，同一份血清检测结果的P/N值上下浮动均不超过0. 05，变异系数均 < 5%,证明该试剂盒具有良好的稳定性和重复性。
临床标本检测 采用美国R&D公司流脑A+C型IgM ELISA检测试剂盒检测474例正常人血清血清， 其中IgM抗体阳性40例，阴性434例，采用脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板法检测结果与R&D公司流脑A+C型IgM ELISA检测试剂盒相比灵敏度为95%，特异度为99. 5%。
表1两种试剂盒IgM检测结果比较
计算灵敏度=95 %，特异度=99. 5 %。
权利要求
1.脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)、在96孔酶标板的每孔内加入0.IM NaHCO3稀释的5%戊二醛200 μ 1，于37°C温箱 中放置60-70分钟，然后用去离子水洗涤96孔酶标板3-5次，甩干，备用；(2)、将A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌等体积混合后，用包被液按11000的 体积比稀释后，包被处理后的96孔酶标板，每孔95-105 μ 1 ；然后于37°C温箱中烘干20-25 小时；(3)、取过夜烘干的抗原包被96孔酶标板用200μ 1用PBS稀释的10%小牛血清的填 满，然后于35-38°C下封闭1-2小时，得到抗原包被酶标反应板。
2.根据权利要求1所述的脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制备方法，其特征 在于所述的A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌的浓度为2 X IO9CfVml。
3.应用脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的ELISA检测试剂盒，其特征在于所 述试剂盒由脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、底物液、终止液 构成，具体组份为(1)、标本稀释液含10%小牛血清和2%抗人IgG的0.01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液；(2)、洗涤液含有0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲液；(3)、酶标二抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；(4)、底物液=TMB-H2O2尿素溶液；(5)、终止液2mol/LH2SO4 溶液。
4.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于所述的标本稀释液中2%抗人IgG的0. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液是由NaCl 8. 0g、 KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KCl 0. 2g，硫柳汞 0. lg，加双蒸水至 1000ml，调至 ρΗ7· 4 制得；所述的洗涤液是由 NaCl 8. Og^KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2.9g、KCl 0. 2g、Tween_20 0. 5ml、硫柳汞0. lg、加双蒸水至1000ml，调至ρΗ7· 4制得；所述的底物液是经200mg 3、3 ‘、5、5 ‘_四甲基联苯胺、IOOml无水乙醇、加双蒸水至 IOOOml得底物液A ；Na2HPO4 14. 60g、柠檬酸9. 33g、0. 75%过氧化氢尿素6. 4ml、加双蒸水至 IOOOml，调至pH5. 0-5. 4得底物液B ；将底物液A和底物液B按1 1-1.2的体积比混合制 得；所述的终止液是由IOOml浓硫酸缓慢滴加引入600ml双蒸水中不断搅拌，然后加双蒸 水至900ml制得。
全文摘要
本发明公开了一种脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒，包被酶标反应板是将A型和C型脑膜炎奈瑟菌等量混合后全菌抗原包被包被酶标反应板，采用间接ELISA法方便快速地检出血清中特异性脑膜炎奈瑟菌IgM；试剂盒由脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、显色液、终止液构成。本发明建立了敏感快速的ELISA抗体捕获血清中脑膜炎奈瑟菌特异性IgM抗体的方法，具有高特异性，高稳定性，主要供实验室研究和临床诊断使用。
文档编号G01N21/31GK101846675SQ201010137779
公开日2010年9月29日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者赵俊, 王明丽, 李京培 申请人:赵俊, 王明丽