专利名称：：一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法及其测定方法
技术领域：
：本发明属于生物多糖的提取，特别涉及一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法及其测定方法。
背景技术：
：目前，提取食用菌多糖常用的方法有热水浸提法、微波辅助法、超声波辅助法和酸碱浸提法，这些方法均有一定的不足之处。其中，热水浸提法需要温度在80-10(TC，处理时间在60-180min，处理温度比较高、时间比较长，容易使多糖发生变性失活；微波辅助法是利用微波的吸收性、穿透性和反射性使极性物质，如水等选择性吸收，从而被加热，增加物料的通透性，使得多糖等活性物质从组织中释放出来，其实质也是利用加热提取多糖，所以容易使多糖发生变性失活；超声波辅助法是利用其在溶剂中产生的空化作用，导致溶液内空穴的形成、增长和爆破压縮，从而是固体样品破碎，增大样品与萃取剂之间的接触面积，提高目标产物从固相转移到液相的传质速率，其实质是破碎细胞壁，溶出目标产物，但是在实际操作的过程中，利用超声波破碎食用菌细胞壁，效率非常低，致使多糖的提取率也比较低；酸碱浸提法虽然可以縮短提取时间，但由于酸、碱在浓度因子难以控制的情况下，容易使部分多糖发生水解，从而破坏多糖的活性结构，降低多糖得率。经查阅文献，以上提取方法的多糖提取率在9-15mg/g。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法。本发明的技术方案是—种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于使用原料鲜双孢蘑菇；使用试剂苯酚、浓硫酸、葡萄糖、硫酸铵(NH》^(V聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水；使用仪器设备10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机；分离方法及步骤(1)材料预处理将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h;(2)热水浸提粗多糖将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用；(3)双水相萃取操作精确称取聚乙二醇(PEG)60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL;得到的双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。本从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，最佳的条件为PEG6000的质量百分数为13.3%，(NH4)2S04的质量百分数为21.4X，pH值为7，温度为25°C，在一个大气压条件下操作。本从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的测定方法，其特征在于使用仪器UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平；(1)苯酚-硫酸法测定多糖含量分相后上下相各取lmL加9mL水稀释10倍，再取lmL稀释液加0.5mL6%苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值；上相吸光度为0.369，下相吸光度0.06;(2)标准曲线的制作准确称取葡萄糖0.0210g用蒸馏水溶解，定容至500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液O.lmL放入l号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加入事先配制好的6%苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀；静置30min，后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图；数据如表l表1标准曲线吸光度值试管号0123456789吸取量/mL00.10.20.30,40.50.60.70.80.9加水/mL10.90.80.70.60.50.40.30.20.1葡萄糖浓度/(mg/mL)01.052.13.154.25.256.37.358.49.45吸光度值00.0450.1050.1430.2170.2410.3210.3960.4250.462(3)数据计算计算得上相中多糖浓度为5.9mg/mL，下相中多糖浓度为2.Omg/mL。相关的计算公式R=Vt/VbK=Ct/CbY=1/(l+l/(RXK))R=0.655K=6.15Y=0.801R双水相体系上下相的体积比Vt双水相体系上相体积，mLVb双水相体系下相体积，mLK双孢燕多糖双水相体系分配系数Ct双水相系统上相双孢燕多糖的质量浓度，mg/mLCb双水相系统下相双孢燕多糖的质量浓度，mg/mL5Y双孢菇多糖在上相中的收率。本发明效果是双水相萃取(Aqueoustwo-phaseextraction,ATPE)技术始于20世纪60年代，由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前已成功的应用于蛋白、核酸等生物产品的分离和纯化。其主要优势有以下几点(1)易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低，现已证明双水相萃取的分配系数仅与分离体积有关，这是其他过程无法比拟的，这一点对于工业应用尤为有利；(2)由于双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速，因此相对于某些分离过程来说，能耗较小，而且可以实现快速分离；(3)由于双水相的相间张力大大低于有机溶剂与水相之间的相间张力，相分离过程温和，使生化分子如酶不易受到破坏，而且可以直接在双水相系统中进行生化转化以消除产物抑制；(4)整个操作过程可以在室温下进行操作条件温和。基于以上双水相萃取的优势，我们可以在温和的条件下，利用两种水溶液的萃取操作提取双孢蘑菇多糖，不仅可以提高产品的提取率和得率，而且可以将实验室操作的结果直接放大到生产规模，省去了中试过程，为生物产品的研发和生产找到了一条捷径。利用PEG/(NH4)2S04双水相体系萃取双孢蘑燕多糖最大收率为80.1%，得率可以达至lj17.45mg/g;图l葡萄糖标准曲线图具体实施例方式—种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法本发明创造的具体方案1实验材料、试剂和仪器设备鲜双孢蘑菇、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、(NH山S(V聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水。10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机、UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平。2实验方法及步骤(1)实验材料预处理将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h。(2)热水浸提粗多糖将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液。重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用。(3)双水相萃取操作精确称取PEG60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL。6(4)苯酚-硫酸法测定多糖含量分相后上下相各取lmL加9mL水稀释10倍，再取lmL稀释液加0.5mL6%苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值。上相吸光度为0.369，下相吸光度0.06。(5)标准曲线的制作准确称取葡萄糖0.0210g用蒸馏水溶解，定容至500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液O.lmL放入l号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加入事先配制好的6%苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀。静置30min，后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图。数据如表l，图如图1。表l标准曲线吸光度值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>图1为葡萄糖标准曲线(6)数据计算计算得上相中多糖浓度为5.9mg/mL，下相中多糖浓度为2.Omg/mL。相关的计算公式R=Vt/VbK=Ct/CbY=1/(l+l/(RXK))R=0.655K=6.15Y=0.801R双水相体系上下相的体积比Vt双水相体系上相体积，mLVb双水相体系下相体积，mLK双孢燕多糖双水相体系分配系数Ct双水相系统上相双孢燕多糖的质量浓度，mg/mLCb双水相系统下相双孢燕多糖的质量浓度，mg/mLY双孢菇多糖在上相中的收率利用PEG/(NH4)2S04双水相体系萃取双孢蘑燕多糖最大收率为80.1%，得率可以达到17.45mg/g。双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。最佳的条件为PEG6000的质量百分数为13.3%，(NH4)2S04的质量百分数为21.4X，pH值为7，温度为25"，在一个大气压条件下操作。权利要求一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于使用材料鲜双孢蘑菇；使用试剂苯酚、浓硫酸、葡萄糖、硫酸铵(NH4)2SO4、聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水；使用仪器设备10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机；分离方法及步骤(1)材料预处理将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；(2)热水浸提粗多糖将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用；(3)双水相萃取操作精确称取聚乙二醇(PEG)60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL；得到的双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。2.根据权利要求1所述的一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于最佳的条件为PEG6000的质量百分数为13.3%，(NH4)2S04的质量百分数为21.4%，pH值为7，温度为25t:，在一个大气压条件下操作。3.根据权利要求1所述的一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的测定方法，其特征在于使用仪器UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平；(1)苯酚_硫酸法测定多糖含量分相后上下相各取lmL加9mL水稀释10倍，再取lmL稀释液加0.5mL6%苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值；上相吸光度为0.369，下相吸光度0.06;(2)标准曲线的制作准确称取葡萄糖O.0210g用蒸馏水溶解，定容至500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液0.lmL放入1号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加入事先配制好的6%苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀；静置30min，后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图；数据如表1<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>计算得上相中多糖浓度为5.9mg/mL，下相中多糖浓度为2.0mg/mL。相关的计算公式R=Vt/VbK=Ct/CbY=1/(l+l/(RXK))R=0.655K=6.15Y=0.801R双水相体系上下相的体积比Vt双水相体系上相体积，mLVb双水相体系下相体积，mLK双孢菇多糖双水相体系分配系数Ct双水相系统上相双孢燕多糖的质量浓度，mg/mLCb双水相系统下相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mLY双孢燕多糖在上相中的收率。全文摘要一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，将双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；热水浸提粗多糖加入蒸馏水，大火煮沸，文火维持，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水继续加热致沸腾，文火维持，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液用蒸馏水定容备用；双水相萃取操作精确称取聚乙二醇(PEG)60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，得到的双孢蘑菇多糖被分配在PEG相中。利用双水相体系萃取双孢蘑菇多糖最大收率为80.1％，得率可以达到17.45mg/g。文档编号G01N21/33GK101787085SQ20101012289公开日2010年7月28日申请日期2010年3月12日优先权日2010年3月12日发明者吴疆,孙少起,杨红澎,王玉,班立桐,黄亮申请人:天津市金三农农业科技开发有限公司